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003 多环芳烃致癌的分子毒理学研究进展
多环芳烃是环境中广泛存在的污染物,其中毒机制尚不十分清楚.本文从其与细胞色素P450的关系、多环芳烃受体的作用及其对癌基因与抑癌基因的影响等方面进行综述,为其致癌机制的进一步研究提供思路.
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单株抗人肝脏微粒体蛋白及细胞色素P450单克隆抗体的制备及初步鉴定
目的:制备抗正常人肝脏微粒体(HLM)及细胞色素P450蛋白的单克隆抗体.方法:采用人肝脏微粒体蛋白作为免疫原免疫Balb/C小鼠,按常规方法融合、克隆,经间接ELISA法筛选抗体阳性杂交瘤细胞株,通过单抗亚类、Western blot对抗体进行初步鉴定.结果:成功地制备了一株抗肝微粒体蛋白的单克隆抗体(MAb),命名为MAb 10C7.用鼠单抗亚类快速鉴定纸条鉴定10C7为IgG2b.Western blot分析显示,MAb 10C7可特异识别相对分子量为46kD的人肝脏微粒体蛋白.结论:MAb 10C7抗正常人肝脏微粒或细胞色素P450蛋白的特异性强,对相关蛋白质的功能研究有较好的应用前景.
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全氟辛烷磺酸对SD大鼠肝毒性及其肝脏细胞色素P450mRNA表达的影响
目的 研究全氟辛烷磺酸盐(PFOS)染毒SD大鼠后,其对大鼠肝脏毒性及细胞色素P450(CYP450)亚型mRNA表达的影响.方法 40只SD雄性大鼠,随机分为5组:4个PFOS染毒组,染毒剂量分别为0.5、1.0、3.0和10.0mg/(kg·d),1个对照组.连续灌胃染毒28 d后,分析血清生化指标和观察肝脏病理变化,并检测肝脏CYP450各亚型mRNA的表达水平.结果 与对照组相比,大鼠染毒PFOS 28 d后,各染毒组大鼠的体重明显降低,10.0 mg/kg染毒组大鼠的肝脏重量显著增加.各染毒组大鼠的血清谷丙转氨酶、胆汁酸等水平显著升高,三酰甘油、总胆同醇含量降低.病理检查发现,各染毒组大鼠的肝脏细胞出现浊肿、变性,甚至坏死.此外,3.0和10.0 mg/kg组大鼠肝脏的CYP1A2 mRNA水平降低,而CYP17A1 mRNA水平升高.各染毒组CYP2B1 mRNA水平均升高,呈剂量效应关系.结论 PFOS的肝毒性呈剂量效应关系,并对CYP450的各个亚型有不同影响.
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亚碲酸钠对大鼠脂质过氧化及肝、肾毒性的影响
碲(Te)是VIA族类金属,分布于各种金属矿内,其理化性质与硫、硒相似.国外有不少关于Te及其毒性的研究报道,涉及毒理学安全性评价的大部分试验,并进行了毒作用机制的探讨[1].
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细胞色素P450酶系对喹乙醇诱导的肾细胞凋亡的影响
目的 采用体外细胞培养系统,研究肝脏微粒体细胞色素P450同工酶对喹乙醇(OLA)毒性的影响,筛选和确定影响喹乙醇毒性的主要细胞色素P450同工酶,探索CYP450酶系选择性介导OLA-ROS-细胞凋亡途径.方法 (1)以体外培养的人类肾小管上皮细胞(HK-2)作为检测OLA致肾小管毒性的细胞模型,以脏微粒体混合酶系(S9)加入到HK-2细胞培养中模拟体内代谢环境,将CYP450同工酶(CYP2D6、NADPH:P450还原酶、CYP2A、CYP3A、CYP2C、CYP2E1和CYP1A1/CYP1A2)的化学抑制剂分别加入培养体系中,造成不同P450同工酶活性抑制状况,通过细胞增殖抑制率(MTT)试验来检测OLA单独染毒或OLA与抑制剂联合染毒情况下的细胞毒性.(2)通过流式细胞仪DCF法检测各CYP450同工酶抑制剂对OLA所致HK-2细胞ROS产生情况的影响,筛选HK-2细胞内影响OLA作用的主要CYP450同工酶,推测其代谢路径.结果 (1)MTT检测发现,OLA+S9+α-萘黄酮组与OLA+S9组之间以及OLA+4-甲基吡唑+S9组与OLA+S9组之间细胞活性差异有统计学意义(P＜0.05),表明通过抑制CYP4501A酶以及CPY2E1活性可以使OLA的细胞毒性减轻.(2)OLA能够呈剂量依赖性的诱发细胞内ROS含量升高,且加入CYP1A抑制剂以及CPY2E1抑制剂后,可显著减少HK-2细胞ROS的产生量.结论 OLA通过CYP1A和CYP2E1的代谢诱导HK-2细胞生成ROS,进而可能诱发HK-2细胞的凋亡产生细胞毒性和肾毒性.
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3-甲基胆蒽对大鼠肝细胞细胞色素P450 1A的诱导作用
目的研究3-甲基胆蒽(3-methylcholanthrene,3-MC)对原代培养大鼠肝细胞细胞色素P450 1A(CYP 1A)酶活力的诱导作用,并探讨其时间-效应和剂量-效应关系.方法原位2步胶原酶灌流法分离大鼠肝细胞,无血清条件下培养细胞,并用不同剂量的3-MC诱导肝细胞24 h或48 h.乙氧基试卤灵(ethoxyresorufin,EOR)为CYP 1A酶活力探针药,高效液相色谱法(HPLC)测定试卤灵(resorufin,RSF)浓度.结果实验条件下对照组和3-MC诱导组的RSF均可被检测,与对照细胞相比,除0.005 μmol/L的3-MC对原代培养大鼠肝细胞EROD无显著诱导作用外,其余剂量(0.05,0.5,5 μmol/L)的3-MC均明显诱导酶活力,酶活力分别被上调至对照组的5.08,23.3,33.6倍(P＜0.01),3-MC的诱导作用在24 h达强,而其在48 h的诱导作用与24 h相似.3-MC对原代培养大鼠肝细胞CYP 1A酶活力的诱导作用呈明显的剂量依赖性.结论 3-MC对大鼠原代培养肝细胞CYP 1A酶活力有明显的诱导作用.
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SO2对大鼠肝、肺3种细胞凋亡相关基因和细胞色素P4504种基因表达的影响
目的探讨二氧化硫(SO2)对肝、肺3种凋亡相关基因(p53和bax是促凋亡基因,bcl-2是凋亡抑制基因)及对微粒体细胞色素P450 1A1、1A2、2B1和2E14种基因的mRNA和蛋白表达水平或酶活力的影响.
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基于药物代谢酶的中药毒性与毒理研究
目的中药因品种复杂,基源众多,炮制不当,配伍不宜,药不对证,用法不妥等原因使得不良反应报道日渐增多.特别是近年报道的在英国服用含有马兜铃酸的中草药而引起的肾脏疾病和90年代初比利时出现的因服用含中药广防己的减肥药导致肾功能衰竭报道,使得中药安全性的问题引起了国际上的重视.中药成分复杂,在体内同样面临机体P450酶对其的代谢.本研究拟选择传统中药"十八反"为研究对象,引入P450酶,探讨中药"十八反"中的主要药对产生毒性作用的分子基础.
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三种细胞培养模型的效果评价
原代大鼠肝细胞经不同体外细胞培养模型培养后,对肝细胞的酶渗出量、白蛋白分泌水平和细胞色素P450 1A(CYP 1A)活性进行了分析.结果显示:在三种培养模型中,培养液的LDH水平随培养时间的延长而逐渐降低,但在单层培养(MC)的第5天,LDH水平明显升高,而夹层培养(SC)的LDH在第8天后没有检出,AST和ALT水平在整个培养过程中无明显变化.在生物反应器中( bioreactor),肝细胞基础CYP1A活性可维持2周以上,培养液中白蛋白的含量以生物反应器高,其次是SC和MC.随着培养时间的延长,MC和SC中肝细胞CYP 1A活性逐渐降低,且MC肝细胞CYP 1A活性的下降速度比SC快.这种现象可被细胞色素P450(P450)的诱导剂如奥美拉唑和3-甲基胆蒽(3-MC)部分改变,MC肝细胞的诱导作用总是比SC肝细胞强.结果证实每一个体外细胞培养模型都有各自的优缺点,不同的体外细胞培养模型可以解决问题的不同方面.
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ALDH2和CYP2E1基因多态性及饮酒习惯与肝细胞癌易感性的关系
目的 研究乙醛脱氢酶2(ALDH2)和细胞色素P450 2El(CYP2E1)基因多态性与饮酒因素交互作用在广西原发性肝细胞癌发生中的作用.方法 对广西壮族自治区300例肝细胞癌和292例正常对照进行流行病学调查研究,并用PCR-RFLP方法检测ALDH2和CYP2El基因型.结果 病例和对照组中ALDH2和CYP2E1变异基因型携带者分别占50.3%、4 8.0%和32.3%、32.9%(P>0.05).饮酒频度每周≥3次(高频饮酒)且携带变异基因ALDH2和CYP2E1者发生肝癌的危险度分别是饮酒频度每周<3次(低频饮酒)且携带野生基因型者的3.334倍(95%CI =1.746～6.406)和1.803倍(95%CI=0.974～3.336),同时携带两变异基因型者患肝癌风险为1.200倍(95%CI=0.730～1.972),且饮酒增加两变异基因型携带者的肝癌发病风险(OR=1.816,95% CI=0.985-3.348).结论 单一ALDH2或CYP2E1基因型与肝细胞癌易感性无关;但高频饮酒且携带变异基因ALDH2或CYP2E1者患肝癌风险增加.且两变异基因型单倍体增加肝癌发病风险.提示乙醇在增加肝癌发病风险的过程中存在基因·环境和基因.基因相互作用.
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主要抗结核药物肝脏毒性的动物实验研究
目的探讨肝脏脂质过氧化反应和肝药酶活性改变与抗结核药物肝毒性的关系.方法健康成年SD大鼠56只,随机分为7组:INH(isoniazid,H)组、RFP(rifampicin,R)组、PZA(pyrazinamide,Z)组、HR组、RZ组、HRZ组和生理盐水对照组.分别灌药10 d后处死大鼠,取肝脏切片,电子显微镜下观察肝脏病理变化,制备肝匀浆测定MDA(Maleic Dialdehyde)、SOD(Superoxide Dismutase)、GSH(reduced glutathione)和P450含量.结果各实验组MDA和P450均有不同程度升高,SOD和GSH有不同程度降低,肝脏病理变化与脂质过氧化反应、肝药酶有相关性.结论异烟肼、利福平、吡嗪酰胺均可引起大鼠的脂质过氧化指标的改变及肝脏细胞的病理损害,多种药物联用比单用改变明显;抗结核药物肝脏毒性与脂质过氧化反应程度关系密切,吡嗪酰胺组比其他单用药组肝脏毒性大.利福平有明显肝药酶诱导活性.
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CYP2C19和CYP2C9等位基因在中国人群中多态性分布
目的:探讨细胞色素P450(CYP)2C19(CYP2C19)和CYP2C9在中国人群中的等位基因多态性分布,分析影响上述基因多态性的因素.方法:应用聚合酶链反应-变性高效液相(PCR-DHPLC)技术分析了150例癫痫患者CYP2C19外显子4(*3)、外显5(*2)和CYP2C9外显子7(*3)的等位基因变异,观察这二种基因多态性在癫痫患者中分布的特征.结果:150例癫痫患者CYP2C19*3、CYP2C19*2和CYP2C9*3均为野生型的发生率为38.7%,CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C9*3等位基因频率分别为34.3%、5.3%和7.3%.CYP2C19*2和CYP2C19*3等位基因分布频率存在性别之间的显著差异,P值分别为P＜0.05、P＜0.01;而CYP2C9*3的等位基因分布频率不存在性别之间的显著差异.CYP2C19基因型存在性别之间的显著差异,P＜0.01.存在CYP2C9*3等位基因多态性的个体一定出现CYP2C19*2的等位基因多态性.结论:性别因素可能对CYP2C19酶的活性产生影响,应用同时经CYP2C9和CYP2C19代谢的药物时,需进行基因型测定.
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CYP2C19和CYP2C9等位基因在中国人群中多态性分布
目的:探讨细胞色素P450(CYP)2C19(CYP2C19)和CYP2C9在中国人群中的等位基因多态性分布,分析影响上述基因多态性的因素.方法:应用聚合酶链反应-变性高效液相(PCR-DHPLC)技术分析了150例癫痫患者CYP2C19外显子4(*3)、外显5(*2)和CYP2C9外显子7(*3)的等位基因变异,观察这二种基因多态性在癫痫患者中分布的特征.结果:150例癫痫患者CYP2C19*3、CYP2C19*2和CYP2C9*3均为野生型的发生率为38.7%,CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C9*3等位基因频率分别为34.3%、5.3%和7.3%.CYP2C19*2和CYP2C19*3等位基因分布频率存在性别之间的显著差异,P值分别为P＜0.05、P＜0.01;而CYP2C9*3的等位基因分布频率不存在性别之间的显著差异.CYP2C19基因型存在性别之间的显著差异,P＜0.01.存在CYP2C9*3等位基因多态性的个体一定出现CYP2C19*2的等位基因多态性.结论:性别因素可能对CYP2C19酶的活性产生影响,应用同时经CYP2C9和CYP2C19代谢的药物时,需进行基因型测定.
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细胞色素P450 2E1基因的多态性与食管癌的易感性
目的:研究CYP2E1基因的多态性和烟酒嗜好及其相关作用与食管癌易感性的关系.方法:采用病例一对照分子流行病学方法,以PCR-RFLP方法分析78例食管癌患者和102例正常对照者的CYP2E1基因型.结果:(1)食管癌组吸烟、饮酒状况分布与对照组之间差异存在显著性(P均＜0.05),而CYP2E1基因RsaI位点和DraI位点各基因型频率在食管癌组和对照组的分布差异无显著性(P值分别为0.158、0.585).(2)Logistic回归分析表明,CYP2E1基因RsaI位点和吸烟、饮酒都是食管癌的危险因素,其比值比(OR)分别为1.5、2.5、5.5,而且CYP2E1基因的C1/C1基因型和DD基因型与吸烟、饮酒之间存在协同致癌性.结论:CYP2E1 C1/C1基因型和吸烟、饮酒都是食管癌的危险因素,而且它们存在协同致癌性.
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21-羟化酶缺乏症患儿基因突变分析
目的：分析21-羟化酶缺乏症（21-hydroxylase deficiency，21-OHD）患儿和家系基因突变特征及突变基因型与临床表型的关系。方法采用病例试验诊断研究设计。收集2011年12月至2013年5月期间就诊于上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心的16例21-OHD患儿及父母外周静脉血，抽提基因组DNA。根据细胞色素P450c21（Cytochrome P450c21，CYP21A2）基因与其假基因间序列的差异，用高特异性引物扩增该基因10个外显子及内含子序列，用PCR扩增产物直接测序法对21-OHD患儿及其家系进行基因分型。结果用PCR产物直接测序法检测与分析16例21-OHD患儿的突变基因型，共检出6种CYP21A2基因突变，其中IVS2-13A/C＞G[50%（16/32）]、p.I172N[25%（8/32）]为常见的2种类型，c.1451_1452delinsC[3%（1/32）]及p. R149P[3%（1/32）]均为罕见突变，除2例患儿未获得父母标本外，其余患儿基因突变均来自父母。失盐型患儿中常见的突变类型为IVS2-13A/C＞G[75%（15/20个等位基因）]，而单纯型患者中常见的突变为p.I172N[67%（8/12个等位基因）]，患儿基因型与临床表型间具有很高一致性。结论 PCR产物直接测序法能较特异地检出21-OHD基因突变位点，并可为疾病确诊及临床表型预测提供可靠依据。
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广西壮族人群肝癌家族聚集与细胞色素P450 2E1基因多态性等因素关系的研究
目的 探讨广西壮族人群肝癌高发家族聚集与细胞色素P450 2E1(CYP2E1)基因多态性等因素的关系.方法 在广西某肝癌高发现场壮族人群中,对10个肝癌高发家族成员(共91名)和10个无癌对照家族成员(共102名).采集外周血标本,以多聚酶链反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP).分析所有研究对象CYP2EI基因Rsa I位点基闪型及等位基因的分布频率;并用ELISA法检测HBsAg.肝癌相关因素的暴露情况则应用统一问卷进行调查.结果 肝癌高发家族成员CYP2EI基因Rsa I位点c1/c1、c1/c2基因型频率分别为63.7%和36.3%;在对照家族成员中,相应的频率分别为48.0%和52.O%(OR=1.901,95%CI:1.067～3.387);两组成员Rsa I位点基因型分布的差异有统计学意义(X2=4.797,P=0.029).非条件logistic回归分析结果显示,当地肝癌家族聚集的主要危险因素,按其危险度由高至低排列依次为:以玉米为主食、HBsAg携带、CYP2E1 c1/c1型.结论 在广西壮族人群中,肝癌的家族聚集与家族成员的CYP2E1基因Rsa I多态性的分布,有肯定的统计学关系;CYP2E1基因Rsa I多态性的分布不是引起肝癌家族聚集的惟一因素,也不是首要因素,与其他一些因素的综合作用更为重要.
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代谢酶基因多态性与结直肠癌易感性关系的病例对照研究
目的以自然随访人群为研究对象,研究Ⅰ、Ⅱ相代谢酶基因多态性与结直肠癌(CRC)易感性的关系.方法采用聚合酶链反应(PCR)-限制性片段长度多态性(RFLP)、等位基因特异性PCR(AS-PCR)和多重PCR分析技术,检测140例CRC患者和343名健康对照细胞色素P450氧化酶CYP1A1 6235T/C、CYP1A2 734C/A、CYP2E1-1259G/C和-1019C/T各位点多态性,谷胱甘肽转移酶GSTMu(GSTM1)和GST Theta(GSTT1)缺陷型,以及N-乙酰基转移酶基因NAT1和NAT2各等位基因型分布频率,分析其对CRC易感性的影响.结果等位基因CYP1A1 6235C、CYP1A2734A、CYP2E1-1259C、CYP2E1-1019T、GSTM1缺陷型、GSTT1缺陷型、NAT1*10和NAT2 Mx(x=1,2,3)的分布频率在病例组依次为31.65%、63.77%、23 02%、32.61%、57.25%、17.39%、26 45%和39.21%,对照组依次为39.85%、66 62%、20.27%、28.61%、55.46%、20.35%、25.22%和39.36%,所有基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律.单基因、多基因联合分层分析表明,CYP1A1 6235CC突变纯合型可显著降低CRC风险(OR=0.79,95%CI:0.63～0.99);在携带CYP1A2 734A等位基因个体,CYP1A1 6235C等位基因也可显著降低CRC风险(OR=0.53,95%CI:0.34～0.83);在GSTT1缺陷型个体,GSTM1缺陷型可使机体罹患CRC的风险显著升高(OR=4.41,95%CI:1.21～16.10).结论CYP1A1 6235C等位基因、GSTM1和T1缺陷基因型可影响机体对CRC的遗传易感性,前者是CRC的保护因素,后两者可使机体罹患CRC的风险增高.
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湖南人群CYP1A1、GSTM1、GSTT1基因多态性与急性白血病易感性关系研究
目的分析生物代谢酶Ⅰ相酶细胞色素P4501A1(CYP1A1)和Ⅱ相酶谷胱甘肽转硫酶GSTM1、GSTT1基因的遗传多态在湖南人群急性白血病患者和健康人群中的分布.方法采用病例对照研究方法,应用聚合酶链反应及聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术对112例急性淋巴细胞性白血病(ALL)患者和120例急性非淋巴细胞性白血病(ANLL)患者以及204名健康个体的CYP1A1 MspⅠ多态(3801 T-C突变)、GSTM1和GSTT1等基因的多态分布进行分析.结果ALL组与ANLL组的CYP1A1基因3801位点等位变异的频率分别为74.1%、70.8%,高于对照组(63.3%),但其差异无统计学意义(P＞0.05);ALL组GSTM1缺失基因型(GSTM1-/-)的频率为60.7%,与对照组(55.4%)比较差异无统计学意义(P＞0.05);ANLL组GSTM1-/-基因型频率为68.3%,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).ALL组、ANLL组及对照组的GSTT1缺失基因型(GSTT1-/-)的频率分别为50.9%、55.0%和49.0%,病例组与对照组差异无统计学意义(P＞0.05).GSTM1-/-和GSTT1-/-联合基因型在ALL、ANLL患者组和对照组中的频率分别为33.0%、40.0%和27.5%,其中ANLL组与对照组比较,其差异有统计学意义(P＜0.05).同时携带CYP1A1 MspⅠ多态突变基因型(杂合突变型或纯合突变型)与GSTM1-/-、GSTT1-/-基因型的个体患ANLL的风险增加(OR=1.890,95%CI:1.084～3.295).结论单一的CYP1A1 MspⅠ多态突变基因型或GSTT1-/-基因型与急性白血病易感性不相关;GSTM1-/-基因型及其与GSTT1-/-基因型、CYP1A1 MspⅠ多态突变基因型(杂合突变型或纯合突变型)同时存在时增加患ANLL的风险.提示GSTM1-/-可能是ANLL发病的易感因素之一,且与其他缺陷基因型存在协同作用.
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寒证大鼠细胞色素P450亚酶的表征及肉桂的调控
目的:考察寒证大鼠肝脏细胞色素P450(CYP450)亚酶的表征特点及热性中药的调控效果.方法:选取知母-石膏-黄柏-龙胆草制备寒性造模药,对SD大鼠诱导21 d后复制寒证模型;另取肉桂提取物对寒性大鼠进行干预,制备观察组;用生理盐水处理为对照组.钙盐沉淀法制备肝脏微粒体,与混合探针药物温孵,用高效液相色谱(HPLC)法测定探针药物的代谢消除百分率,评价CYP450亚酶活性变化.提取肝脏总RNA,实时荧光定量PCR法测定CYP450亚酶的mRNA表达.结果:寒性中药对大鼠CYP3A1酶的活性和mRNA具有显著的抑制作用,热性肉桂具有一定的调控作用,并且这种调控发生在mRNA水平.结论:本研究从多角度系统评价和验证寒证机体CYP450亚酶的表征特点及热性中药的调控效果.
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乳香没药对细胞色素P450活性的影响
目的:考察乳香没药对细胞色素P450活性的影响.方法:56只小鼠分为对照组和乳香+没药3.15,2.10,1.05 g·kg-1剂量组,连续ig给药7 d；48只小鼠分为对照组和乳香、没药、乳香+没药组,ig给药3.15 g·kg-11次.所有小鼠末次药后30 min ip给予戊巴比妥钠,观察乳香没药对P450的影响.40只大鼠分为对照组、乳香组、没药组、乳香+没药组,以3.00g·kg-1连续ig给药14d,取肝脏制备各组动物肝微粒体,并用cocktail探针法考察乳香没药对大鼠CYP1 A2,CYP2E1,CYP3 A4的影响.结果:乳香+没药3.15,2.10,1.05 g·kg-1剂量连续给药7d均可使戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠率降低(P ＜0.05,P＜0.01),而单次给药3.15g· kg-1有使戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠率升高的趋势.乳香、没药及乳香+没药混合物组大鼠肝微粒体体外对非那西丁、氯唑沙宗代谢率显著高于对照组,而氨苯砜无明显差异.结论:乳香、没药连续用药均使CYP1A2,CYP2E1活性增强,而对CYP3A4则无显著影响.
