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中国HCV3b型包膜蛋白编码基因的克隆分析与假病毒制备
从中国丙型肝炎病毒(HCV) 3b亚型感染者克隆分析包膜蛋白编码基因,并用于HCV 3b亚型假病毒制备.本研究从中国HCV感染血清中筛选克隆到2个3b亚型包膜蛋白编码基因,序列分析后构建表达质粒,以1b(Con1)作为对照,体外转染293T细胞后分析不同包膜蛋白表达水平,并制备了HCV 3b亚型假病毒(HCVpp),比较不同HCVpp感染效率.结果表明:2个3b亚型包膜蛋白编码基因(C27与C30)与国际3b参考株TrKj的进化关系较近.C27与C30核苷酸与氨基酸同源性较高(分别为98.5％与98.2％),包膜蛋白编码区存在10个氨基酸位点差异,且C27包膜蛋白体外表达水平明显高于C30,其中C27可制备出高感染效率的HCV 3b型假病毒,其感染效率明显高于C30与HCV 1型(Con1)制备的HCVpp.本研究分析了2个HCV 3b亚型感染者包膜蛋白编码基因序列及表达特性,并首次获得了高感染效率的HCV 3b亚型假病毒,为HCV研究及疫苗与药物研发提供了有效工具.
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2009甲型H1N1疫苗株与普通季节性H1N1疫苗株在呼吸道细胞中感染效率的比较
目的 探讨2009甲型H1N1疫苗株与季节性H1N1疫苗株在人呼吸道细胞中感染效率的差异.方法 用间接免疫荧光法检测H1N1病毒感染A549、CNE-2Z 、H1650、Hep-2和MRC-5细胞的效率；用间接免疫荧光法检测抑制因子对H1N1病毒侵入细胞的影响.结果 1)2009甲型H1N1疫苗株感染人呼吸道细胞的效率:H1650＞ A549＞CNE-2Z＞ MRC-5＞ Hep-2;季节性H1N1疫苗株感染人呼吸道细胞的效率A549＞ CNE-2Z＞ H1650＞ MRC-5＞Hep-2；2)2009甲型H1N1疫苗株和季节性H1N1疫苗株均依赖于内吞作用进入细胞.结论 在A549细胞中,季节性H1N1疫苗株的感染效率明显高于甲型H1N1疫苗株；在H1650细胞中,甲型H1N1疫苗株的感染效率明显高于季节性H1N1疫苗株.
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AD5/F35腺病毒载体对不同来源造血系统恶性细胞转染效率的研究
本研究比较AD5/F35腺病毒载体对不同来源的血液系统恶性细胞系感染效率的差异和细胞毒性反应.用AD5/F35-EGFP以不同MOI(感染复数)感染不同来源的血液恶性细胞系并用AD5-EGFP作为对照;用流式细胞术检测荧光阳性细胞比例,进行荧光显微镜照相并用MTT法检测病毒对感染靶细胞的杀伤作用.结果表明:对于髓系来源的细胞在MOI为30时,AD5/F35载体的感染效率大于99%,AD5载体在MOI为1000时感染效率为26.4%;对于B系来源的细胞在MOI为1 000时,AD5/F35载体感染效率为11.7%,AD5载体为5.7%;AD5/F35和AD5载体都不能有效地感染T系来源细胞,在MOI达到1000也未检测到荧光阳性细胞.在MOI为1 000的情况下AD5/F35载体对感染靶细胞也无明显杀伤作用.结论:AD5/F35载体对不同来源的血液恶性细胞的感染具有一定的选择性,对髓系来源细胞感染能力强,对B系来源细胞有一定感染能力,而且对感染靶细胞毒性小.AD5/F35载体优于常用的5型腺病毒载体,在以髓系细胞为靶细胞的基因治疗中有着较好的应用前景.
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重组腺病毒Ad5/F11p-GFP对不同肿瘤细胞系感染效率的比较研究
目的以 Ad5-GFP 及 Ad5/F35-GFP 为对照，评价Ad5/F11p-GFP 对不同肿瘤细胞系的感染效率。
方法制备并纯化 Ad5-GFP、Ad5/F11p-GFP 及 Ad5/F35-GFP三种重组腺病毒，以不同的感染复数（MOI）感染乳腺癌细胞系 SKBR-3、MCF-7及肾癌细胞系786O。48 h 后，荧光显微镜观察 GFP 的表达，流式细胞仪检测感染效率及不同细胞表面柯萨奇腺病毒受体（CAR）、CD46和桥粒芯糖蛋白质2的表达。
结果 Ad5/F35-GFP 对 SKBR-3、MCF-7及 786O 均具有很高的感染效率，且其在较低的 MOI 时就具有较高的感染效率；Ad5/F11p-GFP 对 CD46高表达的 MCF-7及 786O具有较高的感染效率，5 MOI 感染即可达到60%以上的感染效率；而 Ad5-GFP 仅对 CAR 高表达的细胞系786O具有较高的感染效率，且感染效率随着 MOI 的增加而升高。Ad5/F11p-GFP 和 Ad5/F35-GFP 对三种肿瘤细胞系的感染效率明显高于 Ad5-GFP。
结论对5型腺病毒进行纤维顶球的改造，可增强对肿瘤细胞的感染效率。 -
同一HCV 1b型感染者来源的准种编码的包膜蛋白制备假病毒的感染效率研究
目的 筛选丙型肝炎病毒(HCV)1b亚型包膜蛋白编码基因,用于HCV 1b亚型假病毒制备与应用.方法 从中国同一1b型HCV感染者(366)体内不同HCV准种中筛选不同的包膜蛋白编码基因,构建表达质粒并制备HCV假病毒(HCVpp),体外感染靶细胞,与前期制备的HCV 1b参考株HCVpp平行比较感染效率,并将HCVpp应用于中和抗体检测.结果 从中国同一1b型HCV感染者(366)体内筛选获得的包膜蛋白编码基因可制备感染效率明显不同(分高/中/低3种类型)的HCVpp,确定了其中一个HCV包膜蛋白基因(366-C)可制备出高感染效率的HCV 1b型假病毒,并应用于HCV特异性中和抗体检测.进一步研究表明366患者不同准种来源包膜蛋白表达水平相近,但序列分析发现感染效率不同的包膜蛋白存在个别氨基酸差异.结论 本研究获得了高感染效率的HCV 1b型假病毒,为HCV研究及疫苗与药物研发提供了有效工具.
关键词： 丙型肝炎病毒1b亚型 包膜蛋白 假病毒颗粒 感染效率 -
人脐带间充质干细胞在3种不同培养体系中的生长状况及腺病毒感染效率
背景:目前所报道的脐带间充质干细胞体外培养条件及培养效率不尽相同,尚缺乏统一标准.而且由于不同来源的间充质干细胞生物学特征尚有一定差异,因此建立脐带间充质干细胞简便、高效的培养体系十分必要.目的:观察人脐带来源的间充质干细胞在体外不同培养体系中的生长状态,以及不同腺病毒感染的效率.方法:采用胶原酶消化法从正常足月新生儿脐带中分离出间充质干细胞,贴壁法纯化培养,细胞贴壁后利用低糖DMEM,MesenPRO RS~(TM) Medium和STEMPRO~(R) MSC SFM这3种培养体系进行体外扩增.取对数生长期的第3～5脐带间充质干细胞,应用腺病毒Ad5-EGFP,Ad5/11-EGFP,Ad5/35-EGFP分别以感染复数=1,10,100进行感染,分别于感染后24,56,72 h倒置荧光显微镜观察病毒感染及绿色荧光表达情况.结果与结论:使用低糖DMEM培养的细胞初期融合时间长,STEMPRO~(R) MSC SFM培养的细胞虽然连接紧密,但消化传代后不易贴壁,而MesenPRO RS~(TM) Medium培养的细胞在相同时间内能达到较高的细胞密度,更适于脐带间充质干细胞的体外扩增.Ad5/35-EGFP感染脐带间充质干细胞的效率明显高于其他两种腺病毒,但可导致细胞凋亡;腺病毒Ad5/11-EGFP对脐带间充质干细胞的感染效率较佳,随着感染复数的升高,所表达的荧光强度也逐渐增大.
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在INS-1细胞中构建胰腺组织硫氧还蛋白相互作用蛋白过表达模型:两种腺病毒感染方法的差异
背景:目前,通过腺病毒感染方法在细胞中构建蛋白质过表达模型的方法主要有2种,一是在腺病毒感染细胞4 h后补充1640完全培养基,24 h后换为完全培养基,再继续培养到48 h(方法Ⅰ);另一种是在腺病毒感染细胞4 h后用PBS洗去含有腺病毒的1640培养基,更换4 mL完全培养基培养到48 h,中间不做任何处理(方法Ⅱ).前者病毒的作用时间较长,感染效果较好,但病毒本身对细胞的损害程度较大,对实验模型的稳定性产生干扰.而后者病毒的作用时间短,对细胞的毒性低,但有时病毒感染效率较低,目的蛋白的表达效果欠佳.目的:在大鼠INS-1胰岛β细胞中,通过比较相同腺病毒载体介导的不同感染细胞的方法而寻找一种更加稳定而高效的硫氧还蛋白相互作用蛋白(Thioredoxin-interacting protein,TXNIP)过表达模型.方法:构建含有绿色荧光蛋白的腺病毒载体(Ad-GFP)和TXNIP过表达腺病毒载体(Ad-TXNIP-GFP).分别设立正常组、空病毒组和TXNIP过表达组,按照上述2种不同的方法进行病毒转染.结果与结论:①方法Ⅱ中的绿色荧光蛋白荧光强度和阳性效率高于方法Ⅰ;②方法Ⅱ中的细胞形态更好且细胞存活率更高;③方法Ⅱ中,目的基因TXNIP在mRNA水平和蛋白质水平的表达情况明显高于方法Ⅰ.由以上结果得出结论,腺病毒感染INS-1细胞4 h后,使用PBS将旧培养基洗去并更换新培养基,继续培养到48 h的方法更有利于在INS-1细胞中构建TXNIP过表达模型.
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CAR的表达调节对肝癌基因治疗中腺病毒载体感染效率的影响
目的:通过抑制Raf-MEK-ERK信号转导途径调节肝癌细胞表面柯萨奇病毒和腺病毒受体(coxsackie-adenovirus receptor,CAR)的表达,探索肝癌基因治疗中CAR表达与腺病毒(adenovirus,Ad)感染效率之间的关系.方法:选择两株人肝癌细胞株SMMC-7721及HepG2,以Raf-MEK-ERK信号转导抑制剂U0126作用后,应用Western blotting检测细胞表面CAR蛋白的表达水平.选用能表达GFP的非复制型E1A缺陷的Ad感染人肝癌细胞SMMC-7721及HepG2,应用FACS分析U0126处理前后Ad感染效率的变化.结果:细胞经MEK抑制剂U0126处理后,细胞膜表面CAR的表达呈明显上调趋势.FACS检测显示,经U0126处理后,在相同感染复数(10 MOI)Ad-GFP的感染下,GFP+细胞率明显升高,SMMC-7721细胞由(71.65±6.21)%上升至(86.54±5.70)%;HepG2细胞由(77.53±4.62)%上升至(87.06±2.83)%(均P<0.05).结论:抑制剂U0126抑制Raf-MEK-ERK信号转导途径后,可上调肝癌细胞膜表面CAR的表达,从而导致Ad在肝癌细胞感染效率的提高.
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重组腺病毒载体Ad5-EGFP感染人树突状细胞的研究
目的 探讨重组腺病毒载体Ad5-EGFP感染人树突状细胞(dendritic cell,DC)的佳条件.方法 采用密度梯度离心法分离健康成人外周血中的单个核细胞(PBMC),再以黏附法分离出单核细胞,加入重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白细胞介素-4 (rhIL-4)、重组人肿瘤坏死因子-α(rhTNF-α)等细胞因子诱导培养出DC,动态观察细胞形态,流式细胞仪检测其表面标志.Ad5-EGFP以梯度感染复数值(MOI)10、100、200、400、600、800、1000 pfu/cell感染人DC,于感染后24、48 h,荧光倒置显微镜观察增强的绿色荧光蛋白(EGFP)表达,KS400型图像分析仪测定感染后48 h的感染效率.结果 MOI从10～800 pfu/cell时,EGFP阳性细胞数量逐渐增多,感染效率和病毒滴度呈量效关系,当MOI为800 pfu/cell时可获得较佳的感染效率,EGFP阳性细胞数量达到峰值,感染率达到95.25% .结论 Ad5-EGFP是感染人DC的较理想载体,通过选择恰当的MOI值能提高细胞对重组腺病毒的摄入,从而提高感染效率.
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疾病数学模型和传播动力学研究的流行病学意义
本文就我国多年来对疾病传播数学模型和疾病传播动力学研究和应用的经验,结合我国疾病防治的实践,简要地论述疾病传播数学模型和疾病传播动力学的功能,疾病传播动力学研究的主要内容和重要的理论指标,如疾病传播速率、疾病的基本繁殖率和疾病的传播阈值、疾病传播的平衡状态及其流行病学意义,以及数学模型和传播动力学对于设计和制定防治策略和措施的指导作用,目的在于促进我国理论流行病学的研究和应用,以利于我国流行病学和防治工作水平的提高.
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腺相关病毒载体在各种细胞株中的感染效率及表达特性研究
目的：研究腺相关病毒载体(AAV)感染各类正常细胞和肿瘤细胞的效率，为相关研究提供参考。方法：利用脂质体将重组腺相关病毒的包装质粒AAV-DJ、Helper以及表达绿色荧光蛋白(GFP)的穿梭质粒AAV-GFPP转染293FT细胞进行病毒包装，收集病毒液后感染2种正常细胞和14种肿瘤细胞，24 h后倒置荧光显微镜下观察GFP的表达，并随机选取3个视野统计感染GFP的细胞数目。结果：GFP重组腺相关病毒对各种细胞的感染效率存在差别，感染效率高的为293FT细胞(占96.2%)和Hela细胞(占81.86%)，对SCG7901、SEM-M和SP20细胞的感染效率近乎为零。结论：GFP重组腺相关病毒对正常细胞293FT感染效率高，对肿瘤细胞Hela、SMC7721、BGC823、PANC-1、A549、A875、C6和MCF-7的感染效率较高，这类细胞适合使用AAV作为载体进行外源基因的导入及功能研究。
