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重组腺病毒Ad5/F11p-GFP对不同肿瘤细胞系感染效率的比较研究
目的以 Ad5-GFP 及 Ad5/F35-GFP 为对照，评价Ad5/F11p-GFP 对不同肿瘤细胞系的感染效率。
方法制备并纯化 Ad5-GFP、Ad5/F11p-GFP 及 Ad5/F35-GFP三种重组腺病毒，以不同的感染复数（MOI）感染乳腺癌细胞系 SKBR-3、MCF-7及肾癌细胞系786O。48 h 后，荧光显微镜观察 GFP 的表达，流式细胞仪检测感染效率及不同细胞表面柯萨奇腺病毒受体（CAR）、CD46和桥粒芯糖蛋白质2的表达。
结果 Ad5/F35-GFP 对 SKBR-3、MCF-7及 786O 均具有很高的感染效率，且其在较低的 MOI 时就具有较高的感染效率；Ad5/F11p-GFP 对 CD46高表达的 MCF-7及 786O具有较高的感染效率，5 MOI 感染即可达到60%以上的感染效率；而 Ad5-GFP 仅对 CAR 高表达的细胞系786O具有较高的感染效率，且感染效率随着 MOI 的增加而升高。Ad5/F11p-GFP 和 Ad5/F35-GFP 对三种肿瘤细胞系的感染效率明显高于 Ad5-GFP。
结论对5型腺病毒进行纤维顶球的改造，可增强对肿瘤细胞的感染效率。 -
柯萨奇病毒-腺病毒受体在结肠癌组织中的表达及意义
目的:柯萨奇病毒-腺病毒受体(coxsackie and adenovirus receptor,CAR)介导腺病毒与靶细胞之间的粘附,是腺病毒转染靶细胞的限速因子.本文分析CAR在瘤旁上皮组织、结肠肿瘤原发灶和淋巴结转移灶中的表达,为设计腺病毒载体基因治疗方案提供依据.方法:采用免疫组织化学方法检测62例结肠癌组织中CAR的表达,分析CAR表达与临床病理特征的关系.结果:与瘤旁上皮组织相比,肿瘤组织普遍存在CAR表达下调,但CAR在原发灶和淋巴结转移灶的表达水平无明显差异.CAR的表达水平与患者年龄及肿瘤大小相关.结论:结肠癌组织中存在CAR表达下调,提示在设计腺病毒载体基因治疗方案时应充分考虑CAR表达变化对疗效的影响.
关键词： 柯萨奇病毒-腺病毒受体 结肠癌 基因治疗 -
柯萨奇病毒-腺病毒受体在肺癌组织中的表达意义
目的:初步探讨柯萨奇病毒-腺病毒受体(Coxsackie and adenovirus receptor,CAR)与人肺鳞状细胞癌及腺癌发生、发展的关系,为设计腺病毒载体对肺癌进行基因治疗的方案提供理论依据.方法:采用免疫组织化学方法检测112例肺癌(包括鳞状细胞癌65例,腺癌47例)组织中CAR的表达情况,利用统计学方法(SPSS 10.0软件)分析CAR的表达在鳞状细胞癌、腺癌以及癌旁正常肺组织中有否差异.结果:正常肺组织中仅有少量CAR的表达.两类型肺癌分别与癌旁组织CAR的表达差别有统计学意义(P＜0.01),在鳞状细胞癌中CAR的表达较癌旁组织提高34.75%,在腺癌中CAR的表达较癌旁组织提高38.30%..其中,鳞状细胞癌的CAR阳性率为43.08%,腺癌的阳性率为70.21%,两类型肺癌间CAR表达的阳性率差别亦有统计学意义(P＜0.01).但CAR的表达在肺鳞状细胞癌不同组织学分级中(Ⅰ～Ⅲ级)的差别未有统计学意义(P＞0.05).此外,我们发现在肺腺癌中所包含的细支气管肺泡癌部分几乎都有CAR的表达.结论:肺癌组织(鳞状细胞癌和腺癌)CAR的表达普遍提高,提示CAR与肺癌的发生、发展有一定的联系,并且与肺腺癌的形成及发展的关系更为密切,因此为进一步实现用腺病毒载体对肺癌进行基因治疗提供了理论基础.
关键词： 柯萨奇病毒-腺病毒受体 肺癌 基因治疗 -
pBiG-CAR真核表达载体的构建及鉴定
目的 构建及鉴定pBiG-CAR真核表达载体.方法 提取C57BL/6胎鼠总RNA,逆转录合成cDNA,经PCR扩增获得CAR基因,与双酶切的pBlue质粒连接,经转化、蓝白筛选及测序鉴定pBlue-CAR载体构建成功.扩增pBlue-CAR的CAR基因,经双酶切后与pBiG质粒连接,构建pBiG-CAR真核表达载体.结果 经琼脂糖凝胶电泳,获得目的基因CAR条带,pBlue-CAR目标条带及pBiG-CAR目标条带.基因测序证实所检测重组质粒序列与pBiG-CAR序列完全一致.结论 克隆C57BL/6鼠CAR基因、pBlue-CAR重组质粒的构建获得成功,并初步证实pBiG-CAR真核表达载体的构建获得成功,为进一步构建可控心肌特异性CAR过表达转基因鼠提供基础.
关键词： 柯萨奇病毒-腺病毒受体 C57BL/6鼠 pBiG质粒 载体构建 -
柯萨奇病毒-腺病毒受体siRNA对体外血睾屏障完整性的影响
目的 观察柯萨奇病毒-腺病毒受体(CAR) siRNA对体外血睾屏障完整性的影响,探讨睾丸CAR分子功能.方法 体外建立血睾屏障模型,以CAR siRNA和阴性对照siRNA进行转染,然后以RTPCR和Western blot法检测相关基因mRNA或蛋白表达的变化,免疫荧光法检测蛋白分布,以及测量跨上皮电阻的改变.结果 CAR siRNA组较对照组CAR表达显著降低.与对照组比较,CAR siRNA显著降低了跨上皮电阻,同时,也显著降低了ZO-1的表达,使其分布发生紊乱.结论 CAR siRNA降低支持细胞上皮屏障功能,CAR是血睾屏障的重要调控分子.
关键词： 柯萨奇病毒-腺病毒受体 小干扰RNA 睾丸支持细胞 -
曲古菌素A通过抑制MAPK/ERK通路上调食管癌EC1细胞CAR的表达
目的:观察曲古菌素A(trichostatin A,TSA)对人食管癌细胞EC1膜表面柯萨奇病毒-腺病毒受体(Coxsachievirus and adenovirus receptor, CAR)表达水平的影响,探讨MAPK/ERK信号通路在TSA上调CAR表达中的作用.方法:0.3、0.5、1.0 μmol/L的TSA处理EC1细胞48 h,采用免疫荧光、RT-PCR、Western blotting检测CAR的表达.以1.0 μmol/L TSA作用EC1细胞1、6、12、24、48 h,Western blotting检测p-ERK、CAR表达水平的变化,分析CAR表达和p-ERK水平变化的相关性.结果:0.3、0.5、1.0 μmol/L TSA处理EC1细胞后,CAR蛋白和mRNA水平均明显增加(P<0.05),并呈剂量依赖关系.1.0 μmol/L TSA作用EC1细胞6、12、24、48 h后,CAR蛋白表达较对照组均明显增加(P<0.05);p-ERK表达水平均明显下降(P<0.05),两者变化呈显著负相关(r=-0.886,P<0.01).结论:TSA能够上调人食管癌EC1细胞膜表面CAR的表达水平,其机制可能与其抑制MAPK/ERK通路有关.
关键词： 食管癌细胞 曲古菌素A 柯萨奇病毒-腺病毒受体 细胞外信号调节激酶 -
肿瘤细胞表面柯萨奇病毒-腺病毒受体与5型腺病毒感染效率的关系
目的:探讨不同肿瘤细胞系柯萨奇病毒-腺病毒受体(CAR)和整合素的表达水平与5型腺病毒感染效率的关系,为腺病毒基因治疗研究奠定基础.方法:利用瞬时转染CAR的真核表达质粒提高肿瘤细胞表面CAR的表达,应用抗体封闭细胞表面的CAR和整合素后,通过流式细胞仪和荧光素酶分析法测定腺病毒Ad5-CMV-EGFP和Ad5-CMV-Luc对肿瘤细胞的感染效率和基因表达水平的变化.结果:不同肿瘤细胞表面CAR和整合素的表达水平是不同的,其中SMMC-7721和A549细胞CAR的表达量高,而K562细胞CAR的表达水平低;荧光显微镜和流式细胞仪检测Ad5-CMV-EGFP对肿瘤细胞的感染效率,结果显示5型腺病毒对于SMMC-7721和A549细胞的感染效率高,而对于K562细胞则很低;瞬时转染表达CAR的真核质粒可提高多种肿瘤细胞表面CAR的表达,较大幅度提高了5型腺病毒的感染效率.而抗体封闭肿瘤细胞表面的CAR或整合素后,腺病毒感染效率显著下降.结论:肿瘤细胞表面CAR和整合素的表达水平决定了腺病毒对肿瘤细胞的感染效率.
关键词： 腺病毒 柯萨奇病毒-腺病毒受体 整合素 感染 基因治疗 -
CAR siRNA 对睾丸支持细胞上皮屏障通透性的影响及机制
目的：观察柯萨奇病毒-腺病毒受体（CAR）siRNA对睾丸支持细胞上皮屏障通透性的影响，并探讨其机制。方法采用睾丸支持细胞原代双室培养方法制备睾丸支持细胞上皮屏障，细胞培养3 d后分为CAR siRNA组、对照组，分别转染CAR siRNA、无同源性非靶向双链RNA。转染后第2天，分别采用RT-PCR和Western blotting法检测睾丸支持细胞中CAR mRNA、蛋白表达；采用Millicell-ERS电阻系统测量双室模型内外室的电位差；采用免疫荧光细胞化学染色法检测支持细胞的Occludin蛋白，荧光显微镜下观察Occludin分布情况；采用Western blotting法检测支持细胞中总Occludin蛋白量、与早期内涵体抗原1（EEA1）抗体结合的Occludin蛋白。结果 CAR siRNA组与对照组CAR mRNA相对表达量分别为0．122±0．013、0．429±0．039，CAR 蛋白相对表达量分别为0．142±0．041、0．532±0．022，两组比较，P均＜0．05。 CAR siRNA组与对照组TER分别为（37±2．5）、（50±3．0）ohm· cm2，两组比较，P＜0．05。 CAR siRNA组与对照组Occludin蛋白相对表达量分别为0．164±0．025、0．143±0．031，两组比较，P＞0．05。对照组Occludin呈蜂巢样沿细胞膜线状分布；CAR siRNA组Occludin分布较紊乱，细胞膜处减少，线性分布破坏，细胞质内增多。 CAR siRNA组、对照组细胞中与EEA1结合的Occludin蛋白量分别为1．332±0．018、1．000±0．015，两组比较，P＜0．05。结论 CAR siRNA能增加睾丸支持细胞上皮屏障通透性，其机制可能与其诱导Occludin蛋白内吞增强而分布改变有关。
关键词： 柯萨奇病毒-腺病毒受体 小干扰RNA 睾丸支持细胞上皮屏障 -
柯萨奇病毒和腺病毒受体在VMC和DCM猝死者心肌组织中的表达
目的 探讨病毒性心肌炎(VMC)和扩张性心肌病(DCM)的发病机制及相互关系.方法 应用改良免疫组化技术检测病毒性心肌炎(28例)、扩张性心肌病(31例)和对照组19例.结果 CAR阳性表达为棕色,主要表达于心肌细胞膜.在VMC心肌中均检测到较高水平的CAR表达(免疫组化面积积分为4.3975±0.0365);DCM组26例心肌组织中有较高水平的CAR表达(4.2064±0.0526),有5例几乎无表达(0.0723±0.0014),对照组心肌中几乎未检测到CAR的表达(0.0731±0.0362),VMC组及DCM组与对照组比较差异有显著性(P＜0.05).结论 VMC和DCM心肌组织中CAR表达明显高于对照组,提示VMC和DCM的发病都有病毒感染的参与,两者可能来自同一个病因.
关键词： 心性猝死 病毒性心肌炎 扩张性心肌病 柯萨奇病毒-腺病毒受体 免疫组织化学
