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Notch信号通过MAPK途径参与BMP9诱导的间充质干细胞C2C12成骨分化
目的 探讨Notch信号是否通过MAPK通路影响BMP9诱导C2C12细胞成骨分化.方法 利用BMP9腺病毒处理C2C12细胞5d后,用PCR和Western blot检测MAPK通路中P38、Erk1/2和JNK总蛋白以及磷酸化水平.用Notch信号特异性抑制剂DAPT阻断Notch信号后,细胞化学染色分析ALP和钙盐沉积,以及早晚期成骨指标Runx2和OCN在RNA以及蛋白水平上的变化.同时检测BMPs靶基因Id1 、Id2和Id3 RNA水平的表达和MAPK信号中P38、Erk1/2和JNK总蛋白以及磷酸化水平变化.结果BMP9能上调Hey1和Notch信号的配、受体表达;BMP9不影响P38、Erk1/2和JNK总蛋白的表达,但能上调其磷酸化水平;DAPT能抑制BMP9诱导C2C12细胞的ALP活性以及钙盐沉积;影响Runx2和OCN成骨标志物的表达;阻断Notch信号后Id1、Id2和Id3表达受到抑制,P38、Erk1/2磷酸化水平下调,而JNK磷酸化水平无明显变化.结论 Notch信号通过MAPK途径参与了BMP9诱导的C2C12细胞的成骨分化.
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bFGF2抑制BMP9诱导小鼠间充质干细胞C3H10T1/2向成骨细胞分化
目的 观察碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)对于骨形态发生蛋白9(BMP9)诱导的间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化的影响,并探讨其机制.方法 用BMP9和FGF2重组腺病毒感染C3H10T1/2细胞,测定成骨早期标志物碱性磷酸酶(ALP)活性变化,茜素红S染色观察成骨晚期标志物钙盐沉积,pl2SBE-luc荧光素酶报告基因活性检测,Western blot检测经典信号通路smadl/5/8和成骨关键转录因子RUNX2的变化,以及晚期成骨标志物骨钙素(OCN)的表达.结果 FGF2抑制了BMP9诱导的早期成骨指标ALP和晚期成骨指标钙盐沉积和骨钙素的表达,抑制了经典的BMPs-Smad信号通路,抑制了成骨关键的转录因子Runx2的表达.结论 FGF2可抑制BMP9诱导的间充质干细胞C3H10T1/2的成骨分化.
关键词： 碱性成纤维细胞生长因子 骨形态发生蛋白9 间充质干细胞 成骨分化 -
LPS激活TLR4抑制BMP9诱导iMEFs成骨分化
目的：研究脂多糖（LPS）激活的Toll样受体4（TLR4）信号对骨形态发生蛋白9（BMP9）诱导永生化小鼠胚胎成纤维细胞（iMEFs）成骨分化的影响。方法细胞免疫荧光检测TLR4／NF-κB信号通路的激活；LPS，BAY11-7082和BMP9处理iMEFs，ALP染色和活性检测iMEFs早期成骨分化能力；茜素红S染色检测晚期成骨分化能力；半定量PCR和Western blot检测晚期成骨基因OCN和OPN表达；Western blot 检测Smad1／5／8磷酸化水平；半定量PCR和Western blot检测成骨关键转录因子Runx2和Dlx5的表达。结果 LPS成功激活TLR4／NF-κB信号通路；LPS抑制BMP9诱导的ALP染色和活性（ P＜0.01）、钙盐沉积、OCN的mRNA和蛋白质表达（ P＜0.05）、OPN的mRNA （ P＜0.01）和蛋白质（ P＜0.05）表达、Smad1／5／8信号通路激活（ P＜0.01）、Runx2的mRNA和蛋白质表达（ P＜0.05）、Dlx5的mRNA（P＜0.01）和蛋白质（P＜0.05）表达，BAY11-7082可以部分逆转LPS的抑制作用（P＜0.05）。结论 LPS激活TLR4可以通过NF-κB信号通路抑制BMP9诱导的iMEFs成骨分化。
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骨形态发生蛋白9抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞体外侵袭和迁移
目的 探讨骨形态发生蛋白9(BMP9)对乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭、迁移能力的影响.方法 RT-PCR法检测MDA-MB-231细胞系中BMP9的表达;扩增高滴度的BMP9表达腺病毒,感染MDA-MB-231细胞,制备高表达BMP9的重组MDA-MB-231/BMP9细胞,以此作为实验组;同时以含GFP的窄载腺病毒感染该细胞为MDA-MB-231/GFP,联合空白MDA-MB-231共同作为对照组;通过平板集落形成实验、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验检测重组MDA-MB-231/BMP9细胞侵袭及迁移能力.结果 与对照组细胞相比,实验组细胞中BMP9 mRNA表达水平明显增高;实验组细胞集落形成率由对照的90.6%±2.5%与85.6%±3.5%显著下降至57.3%±4.5%(P＜0.05);实验组划痕愈合率由对照的95.4%±3.1%与92.5%±2.4%下降至74.0%±3.6%(P＜0.05);实验组穿膜细胞数由对照的(255.3±16.1)个与(267.3±14.9)个下降至(150.3±14.6)个(P＜0.05).结论 BMP9可以在体外抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭与迁移.
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Shh促进BMP9诱导的小鼠间充质干细胞C3H10T1/2的成骨分化
目的 观察Shh蛋白对骨形态发生蛋白9(BMP9)诱导的小鼠间充质干细胞(MSCs) C3H10T1/2成骨分化的影响,并初步探讨其作用机制.方法 Shh腺病毒和BMP9作用于C3H10T1/2细胞,碱性磷酸酶(ALP)检测ALP变化,茜素红S染色检测钙盐沉积,RT-PCR检测Shh、BMP9、骨桥蛋白(OPN)、骨钙素(OCN)以及成骨相关基因Id1、Id2、Id3、CTGF和Runx2的表达,Western blot检测OPN、OCN、Runx2、DLX5和p-Smad1/5/8的蛋白水平,荧光素酶报告基因检测Smad1/5/8的转录活性.结果 Shh不影响BMP9的表达,但可增强由BMP9诱导的C3H10T1/2细胞早晚期成骨分化(P＜0.05),并促进BMP9诱导的成骨相关基因的表达(P＜0.05);Shh促进了BMP9诱导的Smad荧光素酶活性(P＜0.05),但对其磷酸化并无影响.结论 Shh可促进BMP9诱导的小鼠C3H10T1/2细胞的成骨分化.
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骨形态发生蛋白9体外调节乳腺癌细胞与骨髓间充质干细胞的相互作用
目的 观察骨形态发生蛋白9(BMP9)在共培养条件下对HS-5成骨分化及MDA-MB-231转移相关因子表达的影响.方法 采用Transwell小室间接共培养MDA-MB-231细胞与HS-5细胞,加入BMP9条件培养基,使用化学发光法、细胞化学染色法及茜素红S染色法分别检测HS-5细胞碱性磷酸酶(ALP)活性、ALP表达及细胞钙盐沉积的变化；应用RT-PCR及Western blot观察HS-5细胞骨钙素(OCN)、MDA-MB-231细胞甲状旁腺激素相关蛋白(PTH-rP)及白细胞介素6(IL-6)mRNA和蛋白表达的变化.结果 HS-5的ALP活性升高,并呈时间依赖性,第9天达高,随后降低；ALP细胞化学染色结果进一步证实这一点；HS-5细胞钙盐沉积增多、OCN mRNA和蛋白的表达升高(P＜0.05)；MDA-MB-231转移相关的PTH-rP及IL-6 mRNA和蛋白的表达下降(P＜0.05).结论 BMP9能够调节乳腺癌细胞与骨髓间充质干细胞的相互作用.
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BMP9促进间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化的研究
目的 确认骨形态发生蛋白9(Bone Morphogenetic Proteins 9,BMP9)是否促进间充质干细胞C3H10T1/2定向成骨分化,并初步探讨其分子机制.方法 用重组鼠BMP9蛋白处理C3H10T1/2细胞.化学发光法检测碱性磷酸酶(ALP)活性;免疫组化检测骨桥素(OPN)的表达;茜素红S染色检测细胞钙盐沉积;Western Blot 检测转录因子Smad1/5/8的磷酸化情况.结果 BMP9可以诱导C3H10T1/2细胞早期成骨指标ALP的活性,也可促进晚期成骨指标OPN的表达和钙盐沉积;BMP9刺激后,C3H10T1/2细胞中转录因子Smad1/5/8的磷酸化水平增加.结论 BMP9可以促进间充质干细胞C3H10T1/2定向成骨分化.
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美洛昔康对骨形态发生蛋白9诱导间充质干细胞骨向分化的抑制作用
目的 探讨美洛昔康对骨形态发生蛋白9(BMP 9)诱导间充质干细胞成骨分化的影响.方法 用BMP 9编码序列的重组腺病毒感染C3H10T1/2细胞,并同时加入美洛昔康5,10和20 μmol·L-1对BMP9的作用进行干预.采用化学发光法检测第5天、第7天和第9天的碱性磷酸酶(ALP)活性,RT-PCR方法分别于第9天和第11天检测骨钙蛋白mRNA表达以及第1天、第3天和第5天Dlx-5 mRNA表达,于第14天和第20天采用茜素红S染色法检测钙盐沉积.另用荧光素酶报告质粒检测BMPR-Smad信号的转录活性.结果 与正常C3H10T1/2细胞组相比,第5～第9天BMP9组ALP活性明显增加(P＜0.01),但加入美洛昔康5,10和20μmol·L-1后,ALP活性随美洛昔康浓度增加而明显降低(P＜0.05).与正常C3H10T1/2细胞组相比,BMP9组骨钙蛋白素和Dlx-5的mRNA表达水平及钙盐沉积明显增加,美洛昔康则明显抑制BMP9诱导的骨钙蛋白素和Dlx-5 mRNA的表达及钙盐沉积(P＜0.05).BMP9促进C3H10Tl/2细胞中BMPR-Smad报告质粒的荧光素酶活性增加(P＜0.01),美洛昔康能够抑制BMP9对BMP-Smad信号的活化作用(P＜0.05).结论 美洛昔康对BMP9诱导的间充质干细胞成骨化有明显的抑制作用,其机制可能与抑制BMP-Smad信号激活有关.
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骨形态发生蛋白9诱导骨骼肌源性干细胞的成骨分化
背景:已有实验报道部分骨形态发生蛋白能够诱导间充质干细胞等向成骨细胞的分化.目的:评估骨形态发生蛋白9定向诱导骨骼肌源性干细胞成骨分化的能力.方法:采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶二步消化法提取兔骨骼肌源性干细胞,用重组腺病毒的方法将骨形态发生蛋白9导入细胞,通过碱性磷酸酶定量测定、钙盐沉积实验观察骨形态发生蛋白9对于骨骼肌源性干细胞成骨分化的定向诱导作用.结果与结论:成功分离培养兔骨骼肌源性干细胞,免疫细胞化学染色80%以上的细胞呈Sca-1 阳性.骨形态发生蛋白9能诱导骨骼肌源性干细胞碱性磷酸酶的表达,且能够促进细胞的钙盐沉积.提示,骨形态发生蛋白9具有定向诱导骨骼肌源性干细胞分化成骨的能力.
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骨形态发生蛋白9的成骨效应研究与进展
背景:组织工程人工骨是解决传统植骨骨量不足,新骨形成缓慢的有效途径,而寻找促进细胞增殖和成骨分化的因子和技术是目前研究组织工程骨的关键领域.目的:全面了解骨形态发生蛋白9 的成骨机制、作用及表达纯化的方法,为更好的实现成骨分化因子在临床促进骨形成,解决骨缺损修复奠定基础.方法:检索PubMed 数据库2000-01/2010-12 及CNKI数据库2006-01/2010-12 收录的骨形态发生蛋白9 相关综述和论文报告,并分析其成骨机制、作用及表达纯化的方法几个方面的研究进展.结果与结论:共纳入骨形态发生蛋白9 的相关文献21 篇.在骨形态发生蛋白9 诱导成骨过程中,经典Wnt 信号通路、Hey1、碱性螺旋-环-螺旋蛋白和过氧化物酶增殖体活化受体2、激活素受体样激酶1 和2、胰岛素生长因子2 及类维生素A 等机制都起着重要的作用.目前,骨形态发生蛋白9 已经在体内外被证实是成骨能力强的转化生长因子.对骨形态发生蛋白9 的研究主要是通过重组腺病毒作为载体,但目前构建的病毒载体会有许多编码蛋白质的基因,其表达产物免疫原性很强,应用上存在安全隐患.有学者将真核质粒作为载体,转染真核细胞中,得到骨形态发生蛋白4.能否用此方法得到骨形态发生蛋白9,从而解决腺病毒应用的安全性问题,为临床治疗骨缺损等提供生物技术支持,还有待进一步的研究证实.
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骨形态发生蛋白9体外诱导牙囊细胞的成骨分化
背景：有研究表明骨形态发生蛋白9能促进多种干细胞的成骨分化，但其是否具有诱导牙囊细胞成骨向分化的能力尚不清楚。目的：探讨骨形态发生蛋白9对大鼠牙囊细胞成骨分化的诱导作用。方法：以纯化的第3代大鼠牙囊细胞为研究对象，感染骨形态发生蛋白9腺病毒后，检测牙囊细胞中碱性磷酸酶活性、钙盐沉积以及矿化相关因子基因和蛋白的表达变化。结果与结论：感染骨形态发生蛋白9的牙囊细胞碱性磷酸酶活性持续增强，钙盐沉积明显增强。Real time PCR检测结果显示感染骨形态发生蛋白9的牙囊细胞中矿化相关因子碱性磷酸酶、骨钙素、骨涎蛋白、骨桥蛋白和核心结合因子mRNA表达增强。Western blot检测结果显示感染骨形态发生蛋白9的牙囊细胞中骨桥蛋白的表达增强。以上结果表明骨形态发生蛋白9可诱导牙囊细胞向成骨方向分化。
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β-catenin对骨形态发生蛋白9诱导间充质干细胞成骨分化的影响
目的 探讨经典Wnt信号通路关键节点β-catenin对骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化的影响.方法 用重组腺病毒介导BMP9在C3H10T1/2细胞中过表达,联用β-catenin重组腺病毒上调β-catenin的表达,并通过RNA干扰抑制β-catenin的表达.分析C3H10T1/2细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的变化;RT-PCR检测细胞成骨分化相关基因骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和骨钙蛋白(osteocalcin,OC)基因mRNA的转录水平;茜素红S染色检测细胞的钙盐沉积.结果 BMP9单独作用能诱导C3H10T1/2细胞向成骨方向分化,并增强细胞ALP活性;单独的β-catenin无成骨诱导作用,但可剂量依赖性地增强BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的ALP活性,并促进BMP9诱导的细胞OPN和OC基因mRNA的转录水平及钙盐沉积;抑制β-catenin表达可显著降低BMP9诱导的C3H1OT1/2细胞的ALP活性(P＜0.05),下调OPN和OC基因mRNA的转录水平,并抑制钙盐沉积.结论 经典Wnt信号通路可能通过β-catenin协 同BMP9诱导C3H10T1/2细胞成骨分化,且BMP9诱导的成骨分化可能需要通过Wnt/ β-catenin途径来实现.
关键词： Wnt/β-catenin 骨形态发生蛋白9 间充质干细胞 成骨分化 -
骨形态发生蛋白9对人乳腺癌MDA-MB-231细胞溶骨性骨转移的抑制作用
目的 探讨骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9)对人乳腺癌MDA-MB-231细胞溶骨性骨转移的抑制作用及其可能的机制.方法 将人乳腺癌MDA-MB-231细胞分为试验组(感染BMP9腺病毒)、空白对照组(未感染)及GFP对照组(感染GFP腺病毒),RT-PCR法检测各组细胞中骨保护素(osteoprotegerin,OPG)基因mRNA的转录水平,Western blot法分别检测各组细胞中BMP9及OPG蛋白的表达水平.将BALB/c裸鼠分为空白对照组(注射空白对照细胞)、GFP对照组(注射GFP对照组细胞)及试验组(注射试验组细胞),每组5只,均经胫骨贴骨注射,1×106个/(0.3μl·只),X片成像技术分析各组裸鼠溶骨区域变化,免疫组化法检测各组裸鼠瘤体组织中OPG蛋白的表达.结果 试验组MDA-MB-231细胞中OPG基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平均明显高于空白对照组和GFP对照组(P＜ 0.05),仅试验组细胞中有BMP9的表达.试验组裸鼠胫骨瘤体直径及溶骨区域均明显小于GFP对照组和空白对照组(P＜0.05),试验组裸鼠瘤体组织中OPG的表达量明显高于GFP对照组(P＜0.05).结论 BMP9可抑制MDA-MB-231细胞溶骨性骨转移,可能是通过上调OPG/RANKL/RANK系统中OPG的表达而发挥作用.本实验为探讨BMP9在肿瘤骨转移微环境中的作用机制奠定了基础.
关键词： 骨形态发生蛋白9 骨保护素 乳腺癌 MDA-MB-231细胞 骨转移 -
β-catenin协同BMP9诱导骨肉瘤TE85细胞成骨分化
目的:检测β-连环蛋白(β-catenin)联合骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)对骨肉瘤TE85细胞成骨分化的影响.方法:采用构建有β-catenin和BMP9基因的重组腺病毒Adβ-catenin和AdBMP9,单独或联合感染人骨肉瘤TE85细胞,并用半定量RT-PCR法检测β-ca555tenin和BMP9 mRNA在TE85细胞中表达水平的改变;荧光素酶报告基因系统检测β-catenin/TCF4相对活性的变化,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色和读数法分析TE85细胞的早期成骨能力,茜素红染色法检测细胞的晚期成骨能力;半定量RT-PCR法检测骨保护蛋白(osteoprotegerin,OPG)以及晚期成骨分化指标骨钙蛋白(osteocalcin,OC)和骨桥蛋白(osteopontin,OPN) mRNA的表达水平,蛋白质印迹法检测OC和OPN蛋白的表达水平.结果:重组腺病毒Adβ-catenin与AdBMP9感染TE85细胞后能显著提高外源性β-catenin与BMP9 mRNA的表达水平(P值均＜0.05),Adβ-catenin能明显增强β-catenin/TCF4的相对活性(P＜0.05).Adβ-catenin 与AdBMP9能分别诱导骨肉瘤细胞TE85早期成骨分化指标ALP活性增加(P＜0.05),但增加的程度有限;对晚期成骨指标OC和OPN mRNA和蛋白表达以及钙盐沉积无明显上调的作用.Adβ-catenin与AdBMP9联合作用之后,上述各项早晚期成骨指标的表达均显著增强,差异均有统计学意义(P值均＜0.05).结论:β-catenin和BMP9单独诱导骨肉瘤细胞TE85成骨分化的能力有限,而联合作用后诱导成骨分化的能力显著增强,β-catenin能协同BMP9诱导骨肉瘤细胞TE85成骨分化.
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骨形态发生蛋白9对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响
目的:探讨骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMPg)在体内、外对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响.方法:将pAdtrack-CMV/BMP9和pAdtrack-CMV/GFP腺病毒感染MDA-MB-231细胞,RT-PCR法检测MDA-MB-231/GFP和MDA-MB-231/BMP9细胞中BMP9 mRNA的表达,MTT法、平板集落形成实验和FCM法检测细胞增殖和凋亡的情况.建立裸鼠MDA-MB-231、MDA-MB-231/GFP和MDA-MB-231/BMP9移植瘤模型,测量移植瘤体积,TUNEL法检测肿瘤细胞的凋亡情况.结果:MDA-MB-231和MDA-MB-231/GFP细胞中无BMP9 mRNA的表达,MDA-MB-231/BMP9细胞中有明显BMP9 mRNA表达;MDA-MB-231/BMP9细胞增殖抑制率高于MDA-MB-231/GFP细胞(P<0.05),而细胞集落形成率明显低于MDA-MB-231/GFP和MDA-MB-231组(P<0.05),细胞凋亡率则明显高于MDA-MB-231/GFP和MDA-MB-231组(P<0.05).MDA-MB-231/BMP9组的裸鼠移植瘤体积明显小于MDA-MB-231/GFP和MDA-MB-231组(P<0.001),而移植瘤细胞中的凋亡指数则明显高于MDA-MB-231/GFP和MDA-MB-231组(p<0.001).结论:BMP9可在体内、外抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖并促进其凋亡.
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大黄素通过BMP-9途径促进前体成骨细胞的分化
目的 研究大黄素对前体成骨细胞MC3T3-E1增殖与分化的影响及其作用机制.方法 采用不同浓度(0.05、0.1、0.5、2.0和5.0μmol/L)大黄素处理MC3T3-E1细胞(给药组),以不加大黄素为对照组.分别采用MTT法检测细胞的增殖率;对硝基苯基磷酸二钠(PNPP)法定量检测碱性磷酸酶(ALP)活性;茜素红染色观察矿化结节数目;RT-PCR法检测骨形态发生蛋白(BMPs)途径相关信号分子的表达.采用BMPs抑制剂(Noggin)处理细胞后检测ALP活性,观察BMP-9在大黄素促成骨分化中的作用.结果 大黄素对MC3T3-E1细胞的增殖无影响,大黄素浓度为0.5 ～ 5.0 μmol/L时可促进细胞ALP表达及矿化结节形成,其中浓度为5 μmol/L时效果显著.大黄素可增强细胞BMP-9的表达,与BMP-9信号途径相关的上下游信号分子mRNA的表达亦有相应改变;Noggin预处理后,大黄素促成骨分化的功能受到明显抑制.结论 大黄素可通过激活BMP-9信号通路促进前体成骨细胞的分化.
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BMP9在脊柱融合过程中的作用及其相关机制研究进展
骨形态发生蛋白(BMPs)是目前研究多的骨诱导生长因子,在骨骼生长发育、诱导骨形成和干细胞分化方面发挥了关键作用,并且能够诱导动物或人体间充质干细胞分化为骨、软骨、韧带、肌腱和神经组织.BMP9是一种特殊的BMPs家族成员,是活性强的成骨细胞的骨形成蛋白,在体外和体内促进成骨细胞分化为间充质干细胞.已确定在人类至少有15种不同的BMPs,它们被发现、研究并应用于脊柱融合术.本文旨在对BMP9在脊柱融合过程中的作用及相关机制作一综述.
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骨形态发生蛋白-9诱导牙周膜干细胞成骨分化及信号通路的研究进展
牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells， PDLSCs）是牙周膜中一种具有自我增殖与多向分化潜能的干细胞，已证实其运用于牙周组织工程可显著增强牙周组织的形成和修复能力。骨形态发生蛋白（ bone morphogenetic proteins， BMPs）是转化生长因子-β（ transforming growth factor-β， TGF-β）超家族成员，BMP9作为BMPs家族强的成骨生长因子之一，已证实其在与PDLSCs相互作用中通过BMP-Smad蛋白和BMP-丝裂原活化蛋白激酶2条途径诱导PDLSCs成骨分化。这些结论对于治疗牙周疾病、抑制骨破坏疾病的进展、以及阐明成骨原因等有着重要意义。文中就BMP9对PDLSCs在成骨分化中作用和功能的影响以及信号通路方面的新研究作一综述。
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环氧化酶-2与骨形态发生蛋白9诱导血管平滑肌钙化的关系研究
目的 研究高磷对骨形态发生蛋白9(bone morphoge-netic protein 9,BMP9)的影响,BMP9对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)钙化的影响与环氧酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)的关系.方法 利用免疫荧光、茜素红染色和Western blot检测高磷水平对血管平滑肌钙化的诱导作用;利用茜素红染色、硝酸银染色、real-time PCR和Western blot检测BMP9诱导血管平滑肌钙化的作用;采用免疫荧光、茜素红染色、real-time PCR、Western blot检测COX-2与BMP9诱导血管平滑肌钙化的关系.结果 与对照组相比,高磷明显促进骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和骨钙素(os-teocalin,OCN)表达,并诱导VSMCs出现明显钙盐沉积;高磷呈浓度依赖性方式诱导BMP9表达,增加Runx2、Dlx-5、ALP等骨向调节因子的mRNA表达水平,但降低SM22α 的mRNA.BMP9过表达明显增加VSMCs中OPN和OCN的表达水平,同时降低α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达水平;BMP9过表达明显诱导钙盐沉积,但ALK2突变后则减弱BMP9的这种作用;BMP9过表达能诱导血管平滑肌钙化,14 d时作用明显.高磷和BMP9过表达都能在VMSCs中明显诱导COX-2表达,过表达COX-2增强BMP9在VSMCs中对OPN和OCN表达的促进作用,但加强BMP9对α-SMA表达的抑制作用;COX-2抑制剂减弱BMP9对OPN和OCN表达的促进作用,以及BMP9对α-SMA表达的抑制作用;COX-2抑制剂同时还降低BMP9在VSMCs中促进钙盐沉积的作用.结论 高磷诱导VSMCs钙化可能与促进BMP9和COX-2表达有关,并且COX-2参与介导BMP9诱导的VMSCs钙化.
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过表达BMP9对人肺鳞状细胞癌细胞NCI－H520迁移和侵袭的影响
目的：探讨骨形态发生蛋白9（bone morphogenetic protein 9，BMP9）对人肺鳞状细胞癌细胞NCI－H520迁移和侵袭的影响及其机制。方法：采用RT－PCR和Western blot法分别检测NCI－H520细胞和正常人支气管上皮（ HBE）细胞中BMP9的mRNA和蛋白表达水平；用AdBMP9感染NCI－H520细胞，RT－PCR和Western blot法验证BMP9的变化；应用划痕愈合实验检测各组细胞的迁移能力， Transwell小室检测迁移和侵袭能力，并用RT－PCR和Western blot法检测迁移相关因子基质金属蛋白酶2（ MMP2）的mRNA和蛋白水平。 Western blot法检测BMP－Smad经典通路中Smad1／5的磷酸化水平（ p－Smad1／5）。用BMP特异性拮抗剂AdNoggin与AdBMP9共处理NCI－H520细胞，检测p－Smad1／5及细胞迁移能力的变化。结果：BMP9在NCI－H520细胞中的mRNA和蛋白水平均比在HBE细胞中低；AdBMP9感染的NCI－H520细胞中BMP9的mRNA和蛋白水平均明显升高，细胞迁移和侵袭能力均明显下降，MMP2的mRNA和蛋白水平下降，且p－Smad1／5的表达水平明显上调。在NCI－H520细胞中，Noggin能有效逆转BMP9导致的p－Smad1／5升高和细胞迁移抑制能力。结论：外源性BMP9转入肺鳞癌细胞NCI－H520可明显抑制其迁移侵袭的能力，该抑制作用可能与BMP－Smad信号通路的激活有关。
