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莪术含药血清抑制HSCs中Shh和Gli1表达的机制研究
研究莪术含药血清抑制活化的大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)中Hedgehog(Hh)信号通路关键因子Shh(sonic hedgehog),Gli1(glioma-associated oncogene homolog-1)表达的机制.清洁级SD大鼠均分2组,分别给予莪术水煎剂、生理盐水灌胃取血制备含药血清.体外培养大鼠HSCs,分为7组:空白组、模型组、Hh通路抑制剂组、莪术组、Hh通路抑制剂+莪术组、Hh通路激动剂组、Hh通路激动剂+莪术组.除空白组外,其余各组均给予100μg·L-1瘦素诱导后,各组再予以相应药物干预24h,经MTT法检测HSCs增殖情况,RT-PCR法检测Shh,Gli1的mRNA表达,Western blot法检测Shh,Gli1蛋白表达及免疫荧光法检测Gli1蛋白表达.经瘦素活化的大鼠HSCs中Shh,Gli1的mRNA和蛋白表达均显著上调(与空白组比较P<0.01).Hh通路抑制剂、莪术含药血清分别干预后,Shh,Gli1的mRNA和蛋白表达显著下调(与模型组比较P<0.01);莪术含药血清与Hh通路抑制剂协同干预后,Shh,Gli1mRNA和蛋白表达显著下调(与模型组比较P<0.01);Hh通路激动剂干预后,Shh,Gli1mRNA和蛋白表达显著上调(与模型组比较P<0.01).用莪术含药血清干预Hh通路激动剂组后,Shh,Gli1mRNA和蛋白表达显著下调(与Hh通路激动剂组比较P<0.01).莪术含药血清可通过抑制瘦素诱导活化的HSCs中Shh,Gli1的表达,参与Hh信号通路抑制HSCs的活化,发挥抗肝纤维化的作用.
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神经干细胞增殖信号通路网络分析
脑内神经干细胞具有增殖和分化能力,对脑皮质功能重建非常关键,寻找调控脑内神经干细胞增殖的关键靶点和网络通路意义重大,也是医学界亟待解决的难题.该文以Notch通路作为网络核心,总结了国内外对Wnt,Shh,EGFR,细胞因子等信号与Notch信号通路构成的生物分子网络系统进展,重点分析了Notch通路中的Notch受体,CBF1,NICD,Hes1等关键节点,这些节点可能成为未来新型药物作用的潜在靶点.中药具有多成分、多靶点、多层次的特点,与网络药理学有共通之处.中药的有效成分组或活性成分群是其发挥网络药理学效应的物质基础之一,值得深入探索.该文旨在为中药治疗神经退行性病变和神经损伤提供新的策略.
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Shh促进BMP9诱导的小鼠间充质干细胞C3H10T1/2的成骨分化
目的 观察Shh蛋白对骨形态发生蛋白9(BMP9)诱导的小鼠间充质干细胞(MSCs) C3H10T1/2成骨分化的影响,并初步探讨其作用机制.方法 Shh腺病毒和BMP9作用于C3H10T1/2细胞,碱性磷酸酶(ALP)检测ALP变化,茜素红S染色检测钙盐沉积,RT-PCR检测Shh、BMP9、骨桥蛋白(OPN)、骨钙素(OCN)以及成骨相关基因Id1、Id2、Id3、CTGF和Runx2的表达,Western blot检测OPN、OCN、Runx2、DLX5和p-Smad1/5/8的蛋白水平,荧光素酶报告基因检测Smad1/5/8的转录活性.结果 Shh不影响BMP9的表达,但可增强由BMP9诱导的C3H10T1/2细胞早晚期成骨分化(P＜0.05),并促进BMP9诱导的成骨相关基因的表达(P＜0.05);Shh促进了BMP9诱导的Smad荧光素酶活性(P＜0.05),但对其磷酸化并无影响.结论 Shh可促进BMP9诱导的小鼠C3H10T1/2细胞的成骨分化.
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鸡胚发育过程中Shh超表达对脊髓神经纤维投射的抑制作用
目的 探讨鸡胚发育过程中,sonic hedgehog(Shh)在脊髓中超表达后对神经纤维投射的影响.方法 在鸡胚龄2.5々3d(E2.5～E3)时,利用鸡胚活体原位电转基因技术将Shh表达质粒和携带有报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的质粒共转入鸡胚脊髓,E6时取材切片,至少取3个材料,免疫荧光技术检验Shh的超表达,利用Open Book技术研究Shh在鸡胚脊髓中超表达后对神经纤维投射的影响.结果 在脊髓组织切片水平上,免疫荧光结果表明,Shh在鸡胚脊髓中成功超表达,无论在组织切片上还是通过Open Book技术进行观察,与对照组相比,超表达后转染侧神经纤维都无法正常通过底板投射到对侧,表明Shh在鸡胚脊髓神经纤维投射方面具有重要作用.结论 在鸡胚发育过程中,脊髓中Shh超表达后对神经纤维投射具有抑制作用.
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食管鳞状细胞癌成纤维细胞 hedgehog 通路对 SHH 蛋白的应答
目的：探讨食管鳞状细胞癌成纤维细胞 hedgehog 通路是否应答 SHH 蛋白。方法分离、原代培养食管鳞状细胞癌成纤维细胞，用 Western blot 方法检测培养的细胞是否为成纤维细胞，SHH 蛋白与细胞孵育后提取细胞总RNA，荧光定量 PCR 方法检测细胞中 hedgehog 通路是否应答。结果 Western blot 结果显示培养细胞表达间质细胞标记 Vimentin 和 Fibronectin，不表达上皮细胞标记 E - cadherin。三株细胞中有两株应答 SHH 蛋白，一株不应答。结论食管鳞状细胞癌中，成纤维细胞对 SHH 配体是否应答存在着不同的情况，因此，检测间质中 Hh 通路的活性可为临床上选择对 Hh 抑制剂应答的肿瘤提供重要的生物标记。
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大脑神经发生相关信号通路的研究进展
神经干细胞的增殖与分化受到多种源于自身或外在、邻近或远程细胞信号通路的调控。本文总结国内外研究中与大脑神经发生相关的信号通路，如Notch、骨形态发生蛋白、Wnt、Shh等，重点分析各通路的关键蛋白以及在神经干细胞调控中的作用。
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中医不同治法对绝经后骨质疏松症大鼠骨组织Hedgehog信号通路mRNA和蛋白表达的影响
目的 观察去卵巢骨质疏松症大鼠模型骨组织Hedgehog信号通路中SHH、GLI1 mRNA和蛋白活性变化,探究中药防治骨质疏松症病机的分子生物学机制.方法 实验采用切除雌性SD大鼠双侧卵巢的方式建立骨质疏松症模型,运用补肾填精中药复方、活血化瘀中药复方、补肾活血中药复方对模型大鼠进行干预12周,用骨疏康作为阳性药物对照组,以及正常组和模型组.ELISA法检测各组骨组织SHH、GLI1蛋白含量;RT-PCR检测各组SHH、GLI1 mRNA相对表达量.结果 骨组织SHH、GLI1蛋白与正常组相比模型组含量明显减少(P＜0.01),与模型组相比较,各用药组均明显增加(P＜0.01).结论 骨质疏松症的发生机制与Hedgehog信号传导通路SHH、GLI1 mRNA和蛋白活性下降有关;补肾填精中药复方、活血化瘀中药复方、补肾活血中药复方通过激活Hedgehog信号传导通路中的SHH、GLI1,以促进骨形成,抑制骨吸收,起到防止骨质疏松症的作用.
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SHH信号通路在血小板源性生长因子诱导的血管平滑肌细胞增殖中的作用研究
目的 探讨sonic hedgehog(SHH)信号通路是否在血小板源性生长因子(PDGF)诱导的血管平滑肌细胞(VSMC)增殖中被活化,研究SHH信号通路是否参与PDGF诱导的VSMC增殖.方法 体外培养人VSMC,施加PDGF刺激后应用激光共聚焦显微成像、Western-Blot及qRT-PCR检测SHH信号通路分子mRNA的表达变化;分别应用慢病毒介导的RNAi及SHH信号通路特异抑制剂cyclopamine 阻断SHH通路后,用细胞计数、BrdU掺入法及Ki67染色评价细胞增殖情况.结果 激光共聚焦显微成像及Western-blot及qRT-PCR均显示PDGF能够活化SHH信号通路蛋白shh、patchedl1Gli2的表达;阻断SHH信号通路后,PDGF诱导VSMC增殖的作用明显减弱.结论 SHH信号通路在PDGF诱导的VSMC增殖中有重要作用.
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Shh和Ptch在肝细胞癌中的表达研究
目的 探讨肝细胞癌(HCC)中Shh和Ptch的表达及其意义.方法 应用组织芯片技术、免疫组化和原位杂交方法检测100例HCC、25例癌旁组织和5例正常肝组织中Shh和Ptch的表达情况. 结果 免疫组化检测HCC中Shh和Ptch的阳性表达率分别为19.28%(16/83)、24.68%(19/77);原位杂交检测结果分别为44.29%(31/70)、15.85%(13/82);两种基因在HCC中的表达相关,均与非肿瘤组织的表达有显著性差异,并分别与肿瘤的大小及分化程度相关.结论 Shh和Ptch的表达参与了HCC的发生,它们可能是HCC治疗的理想靶标.
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结直肠癌组织Shh和VEGF表达及相关性研究
目的:探讨结直肠癌(CRC)组织中刺猬基因Shh (Sonic hedgehog)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达特点及其与临床病理特征的关系.方法:应用免疫组织化学方法检测68例CRC、25例正常组织中Shh蛋白和VEGF的表达,并分析与临床病理因素的相关性.结果:CRC组织中Shh和VEGF的阳性表达率分别为52.9％(36/68)和57.4％(39/68),明显高于正常组织的20.0％(5/25)和8.0％(2/25),差异有统计学意义,x2=7.960,P=0.004 8；x2=18.062,P=0.000.Shh的表达与肿瘤T分期相关,随着T分期的增加,Shh表达率逐渐下降,差异有统计学意义,x2=10.756,P=0.013.VEGF表达与肿瘤T分期和淋巴结转移状况有关,x2=14.462,P=0.002;x2=18.045,P=0.000.Shh和VEGF表达与性别、年龄、肿瘤部位和大小及组织学类型无关(P＞0.05).Pearson相关分析显示,Shh与VEGF表达正相关,r=0.319,P=0.008.结论:Shh信号通路的异常激活在CRC发生演进过程中发挥一定的作用,而VEGF是CRC发生侵袭和转移的重要影响因素.Shh和VEGF可以作为CRC诊断和预后判断的分子标志.
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原发性肝细胞癌组织Shh和Ptch-1与Gli-2表达及生物学意义的研究
目的:探讨原发性肝细胞癌(HCC)Sonic hedgehog信号通路信号肽Shh、膜受体Ptch-1和核转录因子Gli-2的表达及其生物学意义.方法:将44例HCC组织及其相应的癌旁肝组织制成含88个微组织的组织芯片,采用免疫组织化学方法分别检测了Shh、Ptch-1和Gli-2在两种组织中的表达情况.结果:在HCC组织中,Shh与Ptch-1阳性率(63.6%和45.5%)均显著高于癌旁肝组织(36.4%和25.0%),P均<0.05.Gli-2在HCC中表达阳性率(68.2%)显著高于癌旁肝组织(38.6%),P<0.01;且与HCC的组织学分级以及侵袭性相关,P均<0.05;与肿瘤大小和HBV感染无关.结论:增强的Gli-2活性导致细胞异常增殖,其所引起的Shh信号通路的过度激活可能促进HCC的发生和发展.
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Shh、Ptch1及Ptch2基因在小鼠磨牙发育过程中的表达
目的 通过原位杂交的方法研究Sonic Hedgehog(Shh)、Patehed1(Pteh1)及Patched2(Ptch2)在小鼠下颌磨牙发育过程中的表达,以探讨该信号通路在牙胚发育中的作用.方法 制备小鼠下颌第一磨牙发育各期标本,原位杂交检测Shh、Ptch1及Ptch2的表达部位及强度.结果 Shh在帽状期表达于釉结,钟状早期表达于内釉上皮,钟状晚期表达于成釉细胞;Ptch1在帽状期表达于牙囊、外釉上皮及星网状层,钟状早期表达于牙囊、外釉上皮及牙乳头,钟状晚期表达于成牙本质细胞及牙乳头;Ptch2在帽状期表达于釉结,钟状早期表达于内釉上皮,钟状晚期无表达.结论 Shh信号系统在牙胚发育各期有各自的表达特点,提示可能在牙胚形态的调控,成釉细胞、成牙本质细胞分化的诱导中起重要作用.
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过量氟对大鼠切牙Shh表达的影响
目的 研究过量氟对大鼠切牙Shh(Sonic Hedgehog)表达的影响,从分子水平探讨氟斑牙的发病机制.方法 20只Wistar大鼠随机分为2组:对照组(饮用蒸馏水)和实验组(饮用100 mg/L氟化水),复制氟斑牙动物模型,8周末处死动物,获取切牙标本,免疫组化染色观察Shh在大鼠切牙的表达定位及在对照组与实验组切牙表达的变化.结果 Shh在分泌期成釉细胞、成牙本质阳性表达.实验组Shh的表达明显弱于对照组,差异有显著性(P＜.01).结论 过量氟可能通过抑制Shh的表达,从而影响牙齿发育的启动和随后的细胞分化,导致釉质发育障碍.
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原发性釉结细胞重聚的体外研究
目的 观察釉结细胞在丧失空间位置信息后在间充质的诱导下能否重新聚集形成釉结,以加深对原发性釉结的形成及釉结细胞的生物学功能的理解.方法 制备昆明小鼠磨牙蕾状期(E13.5)及帽状期(E14.5)牙胚,上皮和间充质分离,设置完整的牙上皮团块与牙间充质重组组和牙上皮打散重聚重组组作为对照.釉结细胞标记后,将牙上皮解离成单细胞悬液重聚与牙间充质重组培养.体外培养72 小时共聚焦显微镜观察已标记的釉结细胞是否发生了细胞重排,Shh 原位杂交检测新形成的釉结的分泌功能.重组体移肾囊膜内培养4 周,HE 及Azan染色观察其成牙情况.结果 釉结细胞标记打散重聚重组体,体外培养72 小时,观察到有牙齿形成,且上皮中心为散在标记阳性细胞,Shh 原位杂交结果显示重组体中有Shh 基因表达.重组体经肾囊膜下培养4 周后均有牙齿形成,且完整的牙上皮团块与牙间充质重组组牙齿发育好于牙上皮打散重聚组,牙尖数目较多.结论 釉结细胞经打散重聚重组后,可重新形成牙齿,且重新形成的釉结细胞是打散的各种上皮细胞成分在新的位置在间充质的诱导下重新分化而形成,即釉结细胞不具有细胞记忆性.
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Sonic Hedgehog信号通路在心血管系统疾病中的研究进展
Sonic Hedgehog(Shh)在Hedgehog家族中表达为广泛,Shh信号通路存在于多种动物体内,Shh信号通路对调节心肌细胞发育、心血管系统形成、细胞分化、组织损伤后修复、组织再生等过程发挥重要作用,其异常激活参与多种肿瘤细胞的发生过程.近年来研究发现,Shh信号通路不仅参与胚胎时期的心肌细胞发育、心血管系统形成,也可促进心肌细胞/血管再生、招募内皮祖细胞移位至损伤区域、减少再灌注心律失常,对缺血缺氧后心肌细胞的保护起关键作用.总结Shh信号通路转导机制及其在心血管系统疾病中发挥的作用,有望为先天性心脏病的修复以及缺血性心脏病的分子靶向治疗提供新思路.
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前列腺癌中Hedgehog信号通路的表达及意义
目的：探讨前列腺癌(Prostate Carcinoma)、癌旁前列腺组织中Hedgehog(Hh)信号通路相关因子mRNA的表达及意义。方法采用逆转录聚合酶链式反应(reverse anscription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)方法检测32例前列腺癌、癌旁前列腺组织中Shh、Ptc和Gli1 mRNA的表达。结果 Shh、Ptc和Gli1 mRNA在前列腺癌组织中的表达均高于癌旁组织(P <0.05)，Shh与Ptc的表达呈正相关(P <0.05)。结论在前列腺癌Hh信号通路中Shh、Ptc和Gli1mRNA呈现高度表达状态，存在Hedgehog信号通路的激活现象，Gli1表达上调促进前列腺癌细胞的增殖和分化以及前列腺癌的发生和发展。
关键词： 前列腺癌 Hedgehog信号通路 Shh PTC Gli1 -
CD34+CD38- Lin -细胞群单个细胞培养的初步研究
目的 探讨单个CD34+CD38-Lin-细胞在体外培养体系中的生存和增殖能力.方法 用免疫磁珠从脐带血单个核细胞中分选出Lin-细胞,然后用流式细胞仪筛选出CD34+CD38-Lin-细胞,并由流式细胞仪将单个CD34+CD38 - Lin -细胞直接放入培养孔中进行培养.培养基中分别加细胞因子Shh、BMP-4或Jagged-1作为实验组,未加细胞因子的以等量PBS作为对照.应用细胞计数法、集落培养计数法检测不同培养条件下各组细胞数量的变化及集落形成能力的差异.结果 培养第3天,各组均能见到单个细胞的分裂倍增现象.培养1周后,各实验组的细胞存活率均高于对照组,顺序为Jagged-1组＞BMP-4组＞Shh组＞对照组,而每孔细胞数的顺序为Jagged-1组＞BMP-4组＞对照组；实验组中每孔细胞数为0的孔数明显低于对照组,尤其是Jagged-1组,而实验组每孔细胞数多于17的孔数高于对照组,其中BMP-4组高.实验组的每孔集落数明显高于对照组,实验组之间的差异并不明显.另外,单个细胞集落培养后能形成红系爆式集落及粒细胞、单核细胞、粒-单核细胞集落形成单位等各式集落.结论 单个CD34+CD38-Lin-细胞能够单独完成生存、自我更新及增殖等过程,而添加细胞因子Shh、BMP-4、Jagged-1能够增强其上述能力,显示微环境的重要性.单个CD34+CD38-Lin-细胞只能形成一种细胞集落,说明微环境对于维持CD34+CD38-Lin-细胞群的全能性必不可少.
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Shh反义核酸对体外培养小鼠牙胚发育的影响
目的 用Shh反义寡脱氧核苷酸(ODN)抑制体外培养小鼠牙胚中Shh的翻译,观察该抑制反应对牙胚生长及矿化的影响.方法 培养牙胚取自胎龄为E17.5d昆明小鼠下颌第一磨牙,利用简易Trowell支架,建立小鼠牙胚体外培养模型,实验共分为三组:反叉ODN组;正义ODN组及空白对照组,核酸浓度为30 μmol/L.体外分别培养10 d后,进行HE染色、von Kossa染色.结果 蛋白印迹结果显示所应用的反义核酸阻断了牙胚中Shh的表达.HE、von Kossa染色结果显示:培养10 d,S-ODN组与空白对照牙胚进入钟状晚期,细胞分化,并可见分泌的基质带;钙磷酸盐在成牙本质细胞与成釉细胞间的基质中沉积.AS-ODN组牙胚培养10 d,牙胚进入钟状期,但牙胚体积明显变小,牙尖形态发育不良,成牙本质细胞排列紊乱,但仍可见高柱状分泌期细胞;von Kossa染色未见明显钙磷酸盐沉积.结论 Shh反义核酸减缓体外培养牙胚的发育,可能通过对成牙本质细胞分泌功能的影响而影响牙胚的矿化.
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子宫颈病变中 SHh 信号通路蛋白表达与高危型人类乳头状瘤病毒感染的关系探讨〔1〕
目的：研究 Hedgehog（Hh）信号通路蛋白亚家族 SHh 与高危型人类乳头状瘤病毒（HPV）在女性宫颈病变中相互作用的机制。方法：选择进行子宫颈项目体检及就诊的女性180例，其中阴性宫颈上皮组织40例，宫颈上皮内瘤变（CIN）80例和宫颈鳞状细胞癌（SCC）60例，应用免疫组化技术及 HPV 检测，并进行数据分析。结果：SHh 信号各组表达为阳性以上者，SCC 组96.7%，CINⅡ-Ⅲ组72.5%，CINⅠ组37.5%，正常组无表达。高危型 HPV 阳性检出率SCC 组95.0%，CINⅡ-Ⅲ组52.5%，CINⅠ组27.5%，正常组5.0%。结论：宫颈病变类型中以 CIN 及宫颈癌 SHh 信号通路蛋白表达为主，且高危型 HPV 检出率高，SHh 有望成为宫颈癌靶向治疗新靶点，高危型 HPV 检测已成为宫颈癌筛查及诊断中的重要项目。
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Shh信号通路成员Shh蛋白在胃癌细胞SGC-7901中的表达
目的:研究Shh信号通路成员Shh蛋白在胃癌细胞中的表达,探讨其与胃癌发生的关系.方法:培养胃癌细胞(SGC-7901)和正常肠上皮细胞(IEC-6),用免疫细胞化学法检测两种细胞中Shh蛋白的表达,用RT-PCR法检测Shh mRNA在两种细胞中的表达.结果:Shh蛋白在正常肠上皮细胞中表达阳性率为15%,在胃癌细胞中表达阳性率为70%,Shh蛋白在正常肠上皮细胞中的表达明显低于胃癌细胞(P＜0.05).Shh mRNA在正常肠上皮细胞中不表达或低表达,在胃癌细胞中明显表达(P＜0.05).结论:Shh信号通路可能与胃癌发生有关.
