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四分子交联体 Tspan-5的研究进展
四分子交联体 Tspan-5属于四分子交联体家族 TM4SF 的成员之一。研究表明，Tspan-5在神经细胞分化成熟、肿瘤细胞转移和破骨细胞生成中发挥重要作用。Tspan-5还表达于绒毛外滋养细胞中，并且影响滋养细胞的侵袭，提示 Tspan-5可能在胚胎植入中起着重要作用。此外，研究发现 Tspan-5与 ADAM10相互作用，通过调节Notch 活性进而改变细胞的侵袭和迁移性，这可能是 Tspan-5发挥生物效应的分子机制。
关键词： 四分子交联体Tspan-5 胚胎植入 侵袭性 Notch 解聚素金属蛋白酶10 -
血府逐瘀胶囊调控血管新生中Jagged1/Notch信号的作用机制
目的:探讨Jagged1/Notch信号通路在血府逐瘀胶囊调控血管新生中的作用.方法:以2.5％的血府逐瘀胶囊含药血清和空白血清分别干预人微血管内皮细胞(HMEC-1),通过实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测药物处理细胞12,24,36,48 h时Jagged1 mRNA水平的表达,通过蛋白免疫印迹法(Western blot)检测药物处理细胞12,24,48 h时Jagged1在蛋白质水平的表达;在血府逐瘀胶囊促血管新生佳药效条件下,使用γ-分泌酶抑制剂(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰基-L-2-苯基甘氨酸叔丁酯(DAPT)阻断Notch信号通路,设置DAPT处理组,二甲基亚砜(DMSO)溶剂组和空白组,通过体外成血管实验检测抑制Jagged1/Notch信号对药物诱导HMEC-1体外成血管能力的影响.结果:血府逐瘀胶囊含药血清干预内皮细胞12 h能上调Jagged1在mRNA水平表达(P＜0.01),药物干预细胞24 h能同时上调Jagged1在mRNA和蛋白水平表达(P ＜0.05);DAPT阻断Notch信号后,药物促体外成血管能力下降.结论:血府逐瘀胶囊可通过调控Jagged1表达,影响Jagged1/Notch信号通路,从而调控血管新生.
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补肾阳中药对小鼠胚胎干细胞活动及相关基因表达的影响
目的:观察补肾阳中药复方对小鼠胚胎干细胞活动的影响.方法:选用小鼠胚胎干细胞模型CRL-1825细胞株,加入补肾阳中药复方大鼠含药血清,观察补肾阳中药对干细胞增殖、分化、凋亡以及相关基因表达的影响.结果:补肾阳中药可以抑制CRL-1825细胞凋亡,但对CRL-1825细胞增殖、分化无明显影响;补肾阳中药同时可促进CRL-1825细胞Notch1基因表达,相对表强度由46.33升高至102.81;补肾阳中药还可以抑制P16INK4a基因表达,相对表强度由202.11降至93.11.结论:补肾阳中药复方可以抑制CRL-1825细胞凋亡,并可能与调控Notch1、P16INK4a表达相关.
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黄芪甲苷对淀粉样蛋白1-40损伤的胚胎鼠神经干细胞的增殖和分化的影响
目的:研究黄芪甲苷(AS)对阿尔兹海默病(AD)脑中神经干细胞(NSC)增殖分化的影响.方法:分离胚胎大鼠神经干细胞,并以β淀粉样蛋白1-40(A β1-40)处理,MTT法检测AS对细胞增殖的影响;免疫细胞化学检测AS诱导神经干细胞分化的类型;Real-time PCR检测γ-分泌酶及Notch mRNA的表达.结果:高剂量AS能刺激NSC分化,中低剂量AS能够促进细胞增殖,减轻A β的细胞毒性作用.机制研究表明,AS既能抑制y-分泌酶mRNA表达,也能促进Notch mRNA的表达.高剂量AS抑制γ-分泌酶mRNA表达的作用明显,中剂量AS则以促进Notch mRNA的表达为主.结论:高剂量AS能够通过抑制γ-分泌酶mRNA的表达,抑制Notch的激活从而诱导NSC分化.中剂量AS主要通过促进Notch的表达来促进干细胞增殖.
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神经干细胞增殖信号通路网络分析
脑内神经干细胞具有增殖和分化能力,对脑皮质功能重建非常关键,寻找调控脑内神经干细胞增殖的关键靶点和网络通路意义重大,也是医学界亟待解决的难题.该文以Notch通路作为网络核心,总结了国内外对Wnt,Shh,EGFR,细胞因子等信号与Notch信号通路构成的生物分子网络系统进展,重点分析了Notch通路中的Notch受体,CBF1,NICD,Hes1等关键节点,这些节点可能成为未来新型药物作用的潜在靶点.中药具有多成分、多靶点、多层次的特点,与网络药理学有共通之处.中药的有效成分组或活性成分群是其发挥网络药理学效应的物质基础之一,值得深入探索.该文旨在为中药治疗神经退行性病变和神经损伤提供新的策略.
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高表达Delta4增加Notch基因的表达
Notch信号传导系统在介导造血细胞增殖与分化过程中具有重要作用.通过分子克隆技术成功构建含标记基因FLAG的Notch配基Delta4的高表达载体pTracer.CMV.Delta4.FLAG,瞬时转染COS7细胞,48 h后收获细胞并制备融合蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳和Western-blot证实后,将其稳定转染CHO细胞,Western-blot鉴定并筛选高表达Delta4的Delta4-CHO1-4及Delta4-CHO1-5细胞株,利用Luciferase分析方法进行Delta4功能性研究.研究结果发现Delta4对Notch1及Notch2均具有信号功能活性,且对后者的活性功能水平大于前者,说明Delta4为Notch1及Notch2的配基.与其他配基功能比较:对Notch1,Delta4的功能活性高于Delta1及Jagged1,但略低于Jagged2;对Notch2,Delta4的功能活性低于Delta1、Jagged1及Jagged2,但亦具有较强的活性水平.
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microRNA-1诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化过程中Notch信号分子的表达变化
目的 探讨微小RNA-1对大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响及分化过程中Notch信号分子的表达变化.方法 全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠MSCs并进行流式细胞学鉴定,miR-1慢病毒载体感染大鼠MSCs(MSCsmiR-1)按培养时间将细胞分成4组:对照组、培养4、6和15 d组;光镜下观察细胞形态变化,qPCR检测miR-1及心肌细胞特异性基因GATA-4、c TnⅠ、α-actin表达,免疫荧光检测cTnⅠ表达,Western blot检测α-actin表达;qPCR检测Notch信号通路相关基因的表达变化.结果 原代大鼠MSCs呈长梭形、漩涡状生长,98％以上细胞表达CD44和CD29,不足1％的细胞表达CD45.MSCsmiR-1中miR-1表达水平持续上升,同时伴随心肌特异性基因GATA-4、cTnⅠ和α-actin的表达逐渐增强,感染4d后可见cTnⅠ在部分MSCsmR-1中表达,同时可检测到α-actin在MSCsmiR1中表达;MSCsmiR-1向心肌样细胞分化过程中,Notch信号分子Jagged1、Notch1、Notch3和Hey2表达水平逐渐下调,于15 d时下调幅度大.结论 传导miR-1至大鼠MSCs中可促使其向心肌样细胞的分化;且分化过程中伴随着Notch信号分子Jagged1-Notch1/Notch3-Hey2表达水平下调.
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Notch信号通路与肝癌的研究进展
Notch信号通路是一种高度保守的信号通路,在调节细胞分化、增殖和凋亡等一系列生理病理过程中都起着关键性的作用.Notch信号在肝癌中频繁发生异常表达及激活突变,其通过多种机制促进肝癌的发生发展,且与肝癌的侵袭、转移和预后密切相关.因此,Notch信号可作为肝癌治疗的一个靶标,为肝癌的治疗提供新的方向和机遇.
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Notch信号通路研究进展
在无脊椎动物和脊椎动物发育过程中,Notch信号对细胞的命运决定起关键作用.通过Notch受体的信号传递能够扩大并固化相邻细胞之间的分子差异,终决定细胞的命运.本文综述了Notch信号通路的相关细节,重点讨论了CSL非依赖的途径.
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VEGF和Notch通路在肝癌血管形成中的作用
血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和Notch信号通路在血管新生及肿瘤血管生成过程发挥极重要的作用。V E GF被认为是血管生成的刺激因子，可启动血管生成，而Notch信号通路则在肿瘤血管生成过程发挥负反馈作用，防止血管过度生成，两者的协调作用保证形成的血管具有一定功能，确保肿瘤生长的氧供。同时阻断DLL4/Notch 和VEGF 具有协同作用，既能降低肿瘤血管的密度及功能，又抑制肿瘤生长。如果能证实VEGF/Notch信号网络在肝癌新生血管中的作用，可以为肝癌的治疗提供新的思路。
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NOTCH配体Jagged2和Delta4对32D细胞的分化抑制研究
目的探讨Notch信号传导系统中相关配体Jagged2和Delta4对髓系前体细胞32D的分化抑制作用.方法构建Delta4高表达载体pTracer.CMV.Delta4.FLAG,制备Delta4-CHO细胞;将Notch1-32D细胞加入含G-CSF培养液的CHO、Jagged2-CHO及Delta4-CHO细胞中,观察Notch1-32D细胞分化及分化抑制情况. 结果构建成功Delta4高表达载体pTracer.CMV.Delta4.FLAG并稳定转染CHO细胞.在G-CSF存在下,Notch1-32D细胞可分化为成熟的粒细胞; Jagged2能抑制G-CSF引起的Notch1-32D细胞分化,但Delta4不能抑制G-CSF引起的Notch1-32D 细胞分化.结论分化抑制实验发现NOTCH 配体中,Delta4不能抑制G-CSF引起的Notch1-32D细胞分化,但Jagged2能抑制G-CSF引起的Notch1-32D细胞分化,为进一步揭示Notch信号传导系统的作用机制及其对造血系统的影响提供重要理论依据.
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Notch-Hes信号通路异常与急性白血病
Notch信号的异常活化与急性白血病的关系密切.Notch信号通路的核心组件包括Notch受体、Notch配体、CSL DNA结合蛋白、下游靶基因等效应分子等4部分.任何影响配体、受体、信号转导分子及效应分子的因素都会对Notch信号通路的传递产生影响.基于异常Notch信号在急性白血病中的重要作用,目前已经开发出了多种针对Notch上游信号的靶向药物,但是由于Notch信号的复杂性、多效性,现有针对Notch上游信号的靶向药物毒副作用较多.Hes基因家族是Notch信号中一个非常重要的靶基因,并且与白血病发生之间的关系密切.本文简述了该研究领域的新进展,期望Hes蛋白或基因的深入研究能为研发新一代靶向药物提供参考.
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融合蛋白TRX-hJagged1原核表达载体的构建及其在BL21中的表达
本研究旨在构建原核表达载体并原核表达Notch配体Jagged1.构建不同长度但均包含DSL区的原核表达载体pET-hJagged1,将构建重组原核表达载体pET-hJagged1转化大肠杆菌BL21后,予以IPTG诱导,优化诱导条件,使目的蛋白TRX-hJagged1在上清中有较大量表达.诱导工程菌并以镍柱纯化对可溶性的目的蛋白进行纯化.结果表明,成功构建了原核表达载体pET-hJagged1(BglⅡ)、pET-hJagged1 (Hind Ⅰ)及pET-hJagged1(Stu Ⅰ),但仅pET-hJagged1(Stu Ⅰ)表达可溶性的TRX-hJagged1.通过镍柱纯化获得了较单一的TRX-Jagged1蛋白,Western Blot证实了其为目的蛋白.结论:成功地构建了原核表达载体pET-hJagged1,并在原核表达系统表达了TRX-Jagged1融合蛋白,为进一步研究Jagged1在淋巴造血系统中的作用奠定了基础.
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Notch配体Delta-like 1对小鼠骨髓细胞来源的树突状细胞分化和抗原呈递功能的影响
本研究探讨Notch配体Delta-like 1(Dll1)对小鼠骨髓细胞来源的树突状细胞(dendritic cell,DC)分化及其抗原呈递功能的影响.在GM-CSF和IL-4存在条件下,用OP9-Dll1和OP9-GFP细胞分别与小鼠骨髓细胞共培养8天,经肿瘤抗原刺激成熟.用流式细胞仪检测DC表面MHC Ⅱ、CD80和CD86的表达情况,ELISA法检测肿瘤抗原刺激后DC培养上清细胞因子IL-12和IL-10的水平,通过混合T淋巴细胞反应观察DC对T细胞的促增殖能力.结果表明:与GFP组相比,Dll1组的小鼠骨髓来源的树突状细胞明显增多(p＜0.05).肿瘤抗原刺激后,Dll1组DC表面MHC Ⅱ、CD80和CD86表达量更高.DC分泌的IL-12水平显著高于对照组(p＜0.05),而IL-10的水平显著低于对照组(p＜0.01).Dll1组DC具有更强的促T细胞增殖活性.结论:OP9-Dll1促进小鼠骨髓细胞向DC分化并增强其抗原呈递功能.
关键词： 树突状细胞 Notch Delta-like 1 T细胞 骨髓细胞 -
融合蛋白hJagged1ext-Fc毕赤酵母表达载体的构建及表达
本研究旨在构建人IgG1 Fc蛋白及融合蛋白hJagged1ext-Fc,并在毕赤酵母GS115中表达.用RT-PCR法从人骨髓细胞中扩增hJagged1基因的胞外段.在测序正确后,将hJagged1基因的胞外段插入构建好的PIC-Fc载体,得到PIC-hJagged1ext-Fc.用MD平板筛选重组子,G418法筛选高拷贝转化子,经甲醇诱导表达后,采用SDSPAGE分析表达蛋白.结果表明:hJagged1基因的胞外段被有效地扩增.序列分析显示所构建的舍phJagged1ext-Fc融合基因的质粒与设计相同,人IgG1 Fc蛋白及融合蛋白hJagged1ext-Fc得到正确表达.结论:成功地构建了hJagged1ext-Fc融合基因的毕赤酵母表达载体,并在毕赤酵母中正确表达,为进一步研究Jagged1在造血干/祖细胞的体外扩增奠定了基础.
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人Delta-like-1胞外区在CHO细胞的表达纯化及对造血祖细胞的扩增作用
Notch信号通路在调控造血干细胞的增殖分化中具有重要作用.本研究克隆表达人Notch配体Delta-like-1(Dll-1)的胞外区(hDll-1ext),并观察其对脐带血造血祖细胞的扩增作用.从人骨髓单个核细胞中提取总RNA,用RT-PCR的方法扩增Delta-like-1基因胞外区,克隆到T载体.测序正确后,亚克隆到pcDNA3.1/Myc-His(+)A表达载体.用脂质体转染CHO细胞,G418筛选单克隆,Western印迹检测hDll-1ext的分泌表达情况.选择表达量高的细胞克隆,扩增并收集上清.用金属亲和层析柱从上清中纯化融合蛋白hDlll-1ext.利用免疫磁性分离方法分离脐带血CD34+细胞.结果表明,RT-PCR方法检测到脐带血CD34+细胞表达Notch-1受体.在含rhIL-3,rhSCF及rhVEGF的脐带血CD34+细胞无血清培养体系中,加入纯化的hDll-1ext,通过集落培养检测hDl-1ext对造血祖细胞的扩增作用.含hDll-1ext组中CFU-Mix和HPP-CFC数量是对照组的1.5倍,结论:重组的hDll-1ext对原始的造血祖细胞具有扩增作用.
关键词： Delta-like-1 Notch CHO细胞 造血祖细胞 -
hDll1ext-Fc融合蛋白的表达纯化与初步鉴定
目的获得高效表达 hDll1ext-Fc 融合蛋白的细胞系以及具有生物学活性的目的蛋白。
方法根据已知序列设计引物，并将 hDll1ext 基因片段经PCR 扩增，酶切后连接至 pIRES2-EGFP-Fc 中，挑选阳性克隆测序，将正确的重组质粒转染至 CHO-S 细胞，筛选高表达细胞系，利用 rProtein A 亲和柱纯化目的蛋白，并通过检测 Notch 下游信号分子 Hes1的表达及双荧光素酶报告基因实验检测蛋白活性。
结果构建了 pIRES2-EGFP-hDll1ext-Fc 真核表达载体，并筛选了高效表达 hDll1ext-Fc 的 CHO-S 细胞系，纯化得到较高纯度的融合蛋白，配合生物活性检测实验显示，可溶性的 hDll1ext-Fc 能够激活 Hes1报告基因，并且能上调Notch 下游分子 Hes1的表达，证明其能够激活 Notch 信号通路。
结论在 CHO-S 细胞中成功表达了 hDll1ext-Fc 融合蛋白，为进一步研究 Delta-like-1的生物学功能奠定重要基础。关键词： 配体 Notch CHO 细胞 Delta-like Fc融合蛋白 -
Notch信号转导对小细胞肺癌的调控及其机制研究
目的 探讨Notch信号转导对小细胞肺癌的调控作用及可能机制.方法 应用重组质粒转染的方法,在小细胞肺癌细胞株NCI-H446中表达组成性活化的Notch1(NIC转染组),同时设立转染空质粒组和未转染组作为对照组,待筛选出稳定细胞株后,以MTT法检测细胞活力,应用半定量RT-PCR技术测定Notch1及其下游基因(HES1和hASH1)表达,并应用免疫细胞化学标记和Westernblot技术对神经内分泌标志物嗜铬粒素A(CgA)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达行半定量[阳性单位(PU)值]分析.结果 未转染组和转染空质粒组Notch1及其下游基因HES1表达不明显,而hASH1表达显著,转染组细胞Notch1及HES1表达升高,同时伴有hASH1表达明显降低.与两对照组比较,转染组细胞增殖速度显著降低,连续6 d测得的吸光度(A)值均小于未转染组和转染空质粒组(均P<0.05).免疫细胞化学染色显示,NIC转染组、转染空质粒组、未转染组的CgA染色的PU值分别为8.81±0.77、38.10±1.55、38.97±0.80,NSE染色的PU值分别为7.21±0.59、28.25±1.46、30.57±1.31,NIC转染组CgA和NSE的PU值均小于转染空质粒组和未转染组(均P<0.01).Western blot检测结果中,将未转染组的条带灰度值设为1.00,NIC转染组、转染空质粒组的CgA条带灰度值分别为0.54±0.03、0.99±0.05,NSE条带灰度值分别为0.43±0.02、1.07±0.09,NIC转染组cgA和NSE条带的灰度值均小于转染空质粒组和未转染组(均P<0.01).结论 Notch信号途径对小细胞肺癌的调控可能是通过靶基因HES1对分化效应基因hASH1的转录抑制来实现的;Notch信号途径可以抑制小细胞肺癌细胞的增殖,降低其神经内分泌标志物的表达.
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Notch信号通路在诱导免疫耐受作用中的研究进展
Notch基因早于1919年在果蝇体内被发现,其基因功能的部分缺失会在果蝇翅膀的边缘造成缺失(Notch),故此得名[1].其后的研究发现Notch信号广泛分布于果蝇、线虫和脊椎动物的各种生物体中,他是无脊椎动物和脊椎动物发育过程中一类十分重要的信号受体家族,对于生物体细胞的分化,增殖和凋亡起着重要的作用.而且表达该信号途径的基因在进化上高度保守.在果蝇和线虫中,Notch精确调控细胞分化的起始过程,对胚胎发育过程中器官发生和形态建成起重要作用.
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Notch信号通路在中枢神经系统神经发生过程中作用的研究进展
Notch信号通路是神经发育过程中必不可少的信号通路之一。它在胚胎生长发育期通过促进神经干细胞增殖或允许神经干细胞分化为神经元/胶质细胞，维持神经元和胶质细胞合适的数量和比例；在成年中枢神经系统损伤后，调控神经干/祖细胞向神经元/胶质细胞分化，参与和调控神经系统的修复过程。
