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弓形虫动物转种条件的研究
弓形虫病是一种人兽共患寄生虫病,人群与动物的弓形虫感染率很高.有关弓形虫在实验动物体内传代、虫株分离以及致病力等方面的研究虽有报道[1~3],但鼠龄、接种途径对感染小鼠生存时间的影响,以及感染时间与收虫数量的关系的报道甚少.为了全面了解弓形虫动物转种的影响因素,本文用胰蛋白酶消化与不消化法收集的弓形虫速殖子、不同虫数经不同途径接种,以及感染不同龄鼠,观察了感染小鼠的存活时间及不同感染时间收虫量的动态变化,为弓形虫生物学、免疫学和分子生物学的研究奠定基础.
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缺氧肺动脉内皮细胞纤溶系统的变化及卡托普利对其的影响
缺氧性肺动脉高压常有微血栓形成,一般认为与高凝状态有关,但是否同时存在纤溶系统功能紊乱,尚不十分清楚。本实验采用体外培养的方法,观察了缺氧时肺动脉内皮细胞分泌组织型纤溶酶原激活物(tPA)及纤溶酶原激活物抑制物(PAI-1)的变化及卡托普利对其分泌功能的影响。 一、材料与方法 1.肺动脉内皮细胞的培养:无菌操作取成年杂种猪肺动脉段(大动脉),清洗后钳夹一端血管,将37℃预温的0.1%胶原酶(Ⅱ型)注入管腔,37℃孵育30 min,收集消化液,离心洗2次,加入含20%小牛血清的M199培养液,按1×105/ml细胞量接种于培养瓶中,37℃,5%CO2孵箱培养,待细胞长满后用0.25%胰蛋白酶消化、传代,2~3代内皮细胞用于实验。
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低氧对血管内皮细胞肾上腺髓质素基因转录的影响
为研究低氧条件对肾上腺髓质素(adrenomedullin,ADM)基因表达的影响,本文观察了低氧引起血管内皮细胞ADM基因转录的变化,并探讨ADM在缺血缺氧性疾病机制中的作用.1 材料和方法(1)HUVEC细胞的培养人脐静脉内皮细胞株HUVEC(美国芝加哥大学Pritzker医学院Gewertz BL教授惠赠),用含20%小牛血清的M199培养基置于37℃,5%CO2培养箱内贴壁生长,待长满培养瓶培养面后用PBS冲洗2次,加入0.25%胰蛋白酶消化、传代.
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原代人腹膜间皮细胞培养的方法学探讨
目的 建立简便有效的获取人腹膜间皮细胞(HPMCs)的方法.方法 采用胰蛋白酶-EDTA(0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA-Na2)组织消化法,从人的大网膜中分离出HPMCs;分别从形态学、免疫组化鉴定分离出的细胞.结果 分离出的细胞在倒置相差显微镜下早期呈多形性、拉伸状;后期呈多边形、"铺路石状".细胞表面标志物鉴定显示角蛋白、波形蛋白抗原阳性,第Ⅷ因子相关抗原、白细胞CD45抗原阴性,证实分离培养的确是HPMCs.结论 胰蛋白酶-EDTA组织消化法是一种简便有效的分离HPMCs的方法.
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神经细胞培养方法在缺血性脑损伤研究中的应用
神经组织的体外培养是1907年由Harrison首创[1],很多学者相继在培养技术、培养容器、培养液几方面作出改进:1956年Nakai创造了神经组织的分离细胞培养[2],1957年Dulbecco采用胰蛋白酶消化并用液体培养基方法获得了单层培养细胞;神经组织的分离细胞培养和单层培养法的出现,对神经细胞培养的发展起了很大的推动作用,已成为人们进行神经领域研究所普遍采用的技术.
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表皮细胞体外培养及临床应用
利用手术切除阴茎包皮,剪碎后经胰蛋白酶消化,添加1640培养液和表皮生长因子,制成细胞悬液,接种于垫有塑料薄膜载体的培养瓶中,经体外培养和传代培养,可在载体上得到大面积的表皮细胞生长薄膜,在移植时可将载体从培养瓶中取出,使长有表皮细胞薄膜一面贴敷于深二度烧伤创面和肉芽创面,一周后,可见移植创面长满培养的表皮细胞。经大量临床治疗证明,有很好的疗效。因此,以阴茎包皮作为培养皮肤细胞来源,通过增殖不仅达到扩大表皮面积目的,而且能较快地修复创面,有很好的实用价值和发展前景。
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利用激光扫描共聚焦显微镜观察丹参滴丸对乳鼠心肌细胞缺氧的保护作用
目的:探讨丹参滴丸对培养的乳鼠心肌细胞缺氧/再给氧的保护作用机制.方法:出生3~7 d的大白鼠乳鼠的心脏在无菌条件下取出来,剪碎,经胰蛋白酶消化分离成单个细胞,放入含15%小牛血清的1640培养液内培养36 h,将培养的细胞随机分成:Ⅰ正常对照组;Ⅱ缺氧10 min组;Ⅲ缺氧10 min加丹参滴丸组;Ⅳ缺氧10 min再给氧10 min加丹参滴丸组.缺氧时向培养瓶内通N2,流量为每分钟100个气泡(直径0.5 cm);给氧时向瓶内通O2(含5%CO2),加丹参滴丸组在通气前先加入丹参滴丸,终浓度为40 μg/mL.将实验后的细胞用0.25%的胰蛋白酶从培养瓶内消化下来,加入无血清无酚红的1640培养液清洗,离心后弃上清,用PBS清洗离心5 min,500 r/min,弃上清,加入含10 μmol的Fluo-3/AM染色,37℃恒温水浴锅内孵育1 h,经PBS清洗弃上清,放入无酚红无血清1640培养液内备用.胞内游离钙离子可与钙荧光探针Flio-3结合,产生一种荧光物质,激光扫描共聚焦显微镜(美国Meridian公司生产的Insight plus型),通过发射波长是488 nm的激光,激发细胞内游离钙产生荧光,通过纤维成像系统,可观察及测量出细胞内钙离子平均荧光强度的变化.结果:Ⅰ组细胞内钙离子平均荧光强度为1005.75,Ⅱ组钙离子强度为1509.43,经t检验,P<0.05,二者有显著差异;Ⅲ组钙离子荧光强度有所减弱,为1217.78,与Ⅰ相比无显著差异(P>0.05);Ⅳ组钙离子荧光强度为1567.91,与Ⅰ组相比有显著差异(P>0.05).结论:丹参滴丸对心肌细胞缺血缺氧后所致钙超载有拮抗作用.
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β1-肾上腺素受体自身抗体诱导的自噬和凋亡之间关系的研究
目的:通过使用自噬激动剂、自噬抑制剂、凋亡抑制剂以及蛋白阻滞剂处理或预处理已由β1-肾上腺素受体自身抗体(β1-AA)造模的H9c2细胞,探讨能否通过人为因素调控细胞自噬从而下调心肌细胞凋亡,改善心功能受损。方法:采用不含ED-TA的0.25%胰蛋白酶消化传代H9c2心肌细胞,用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基进行培养,主动免疫Wistar大鼠获得的β1-AA对细胞进行24 h造模处理,或用自噬激动剂雷帕霉素、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤、自噬抑制剂氯喹、凋亡抑制剂、蛋白阻滞剂分别单独给予或者联合处理细胞,采用Western blot以及RT-PCR对自噬的变化进行检测;对自噬变化组采用流式细胞术以及线粒体跨膜电位检测法对凋亡进行检测。结果:H9c2细胞约90%满时可传代并每隔约2天传代一次;β1-AA可诱导H9 c2细胞发生自噬和凋亡;自噬和凋亡在一定范围内彼此影响,协同决定细胞死亡的发生。结论:β1-肾上腺素受体自身抗体诱导的自噬和凋亡在一定范围内彼此之间相互调节。
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羟基喜树碱对兔晶体上皮细胞的抑制作用
目的:为研究羟基喜树碱(Hydroxycamptothecine,HCPT)对体外培养的兔晶体上皮细胞(rabbit lens epithelial cells, RLECs)生长的影响,探索预防后发性白内障的药物.方法:2~3月龄健康家兔20只;DMEM/F12培养基;胎牛血清;MTT;细胞培养瓶;96孔酶标板;全自动酶标光度仪;倒置显微镜;透射电子显微镜;离心机.(1)取2~3代的对数生长期RLECs于96孔板中,置入CO2孵箱中培养24 h后,将不同浓度的HCPT分别作用24及72 h,用MTT测定法观察其对RLECs增殖的抑制作用;(2)将传代的RLECs接种于96孔板中,立即加入HCPT(浓度为小于半效抑制量的1/10,因该浓度对细胞无杀伤作用)24 h后取出,加入MTT在酶标仪上比色;(3)将传代的RLECs培养在盖玻片上24 h后,加入一定浓度的HCPT,作用72 h后,用多聚甲醛固定,行苏木精-伊红染色,光镜下观察RLECs的形态变化.(4)将浓度为1.34 μg/mL的HCPT作用于2~3代的RLECs 24 h,用0.25%胰蛋白酶消化,PBS洗两次,离心弃上清液,戊二醛固定,电镜观察超微结构的变化(另设未加药组为对照).结果:HCPT能有效抑制体外培养的RLECs的增殖.24 h的半效抑制量(ID50)为96.041 μg/mL,72 h的ID50为1.340 μg/mL;且HCPT对RLECs贴壁有影响,使部分RLECs不能贴壁.光镜下可见HCPT主要引起细胞核固缩、碎裂等病理变化,其胞浆的改变表现为空泡及深染的粗颗粒.电镜下见经HCPT处理的RLECs线粒体肿胀,可见典型的凋亡细胞及凋落小体的形成.结论:HCPT是一种新型的抗癌药,其作用靶是拓朴异构酶Ⅰ(Topo Ⅰ).其低剂量、长时间作用于RLECs,抑制效果明显,该药不仅抑制细胞增殖,还影响细胞贴壁.因此是一种有潜力的预防后发性白内障的侯选药物.
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紫杉醇、羟基喜树碱对晶体上皮细胞生长周期的影响
目的:研究紫杉醇(Taxol)和羟基喜树碱(Hydroxycamptothecine, HCTP)对兔晶体上皮细胞(rabbit lens epithelial cells, RLECs)生长周期的影响.观察Taxol和HCPT对体外培养的兔晶体上皮细胞抑制的作用.方法:2~3月龄家兔30只;DMEM/F12培养基;胎牛血清;MTT;细胞培养瓶;全自动酶标光度仪;倒置显微镜;离心机;流式细胞仪.(1)取2~3代的对数生长期RLECs于96孔板中,放入CO2孵箱内培养24 h后,将不同浓度的Taxol和HCPT分别作用24及72 h,用MTT测定法观察其对RLECs增殖的作用.(2)将消化的第2代RLECs计数成一定浓度的细胞悬液加入3组培养瓶中,一组为不加药的正常对照组,其余两组为分别加入一定浓度的Taxol和HCPT的实验组,作用48 h,用0.25%胰蛋白酶消化、PBS洗涤、立即进行流式细胞仪分析.结果:本研究发现Taxol和HCPT对体外培养的兔晶体上皮细胞均有抑制作用,Taxol 24 h的半效抑制量(ID50)为6μg/mL,72 h的ID50为4μg/mL.HCPT 24 h的ID50为96.041 μg/mL,72 h的ID50为1.34 μg/mL.流式细胞仪分析表明Taxol将RLECs的细胞周期阻断于G2/M期,并在G2/M期阻断前还有短时的G0/G1期阻断.HCPT将细胞周期阻断于S期.结论:Taxol和HCPT增多属细胞周期特性药.Taxol为新型抗微管药物,其作用目标为细胞骨架的微管系统,抑制微管解聚.本实验证实Taxol使RLECs周期阻断于G2/M期,至于在G2M期阻断前还有短时的G0/G1期阻断,其机制值得进一步研究.羟基喜树碱靶向高度选择性抑制拓扑异构酶(Topo Ⅰ),主要作用于RLECs的S期.
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紫杉醇诱导兔晶体上皮细胞凋亡的实验研究
目的:从诱导兔晶体上皮细胞(rabbit lens epithelial cells, RLECs)凋亡的角度观察紫杉醇(Taxol)对体外培养的兔晶体上皮细胞抑制的作用.方法:2~3月龄家兔40只;DMEM/F12培养基;胎牛血清;MTT;TUNEL试剂;24孔酶标板;细胞培养瓶;全自动酶标光度仪;倒置显微镜;透射电子显微镜;离心机.(1)取2~3代的对数生长期RLECs于96孔板中,放进CO2孵箱内培养24 h后,将不同浓度的Taxol分别作用24及72 h,用MTT测定法观察其对RLECs增殖的作用.(2)将传代RLECs培养在盖玻片上24 h后,加入一定浓度的Taxol,作用72 h后,用多聚甲醛固定,行苏木精-伊红染色,光镜下观察RLECs的形态变化.(3)将一定浓度的Taxol作用于2~3代的RLECs 24 h,用0.25%胰蛋白酶消化,PBS洗两次,戊二醛固定,行超微结构观察(同时设未加药标本为正常对照).(4)将传代的RLECs培养在盖玻片上24 h后,加入一定浓度的Taxol,作用72 h,固定后行TUNEL染色并在光镜下观察(另将未加药标本为阴性对照.).结果:本研究发现Taxol对体外培养的RLECs有抑制作用,其24 h的半效抑制量(ID50)为6μg/mL,72 h的ID50为4μg/mL.光镜下,正常对照的RLECs呈多边形上皮样,胞浆丰富、粉红色、胞核呈紫蓝色.部分用药组细胞体积缩小、呈圆形、包浆浓染,可见染色质边集、胞核固缩、碎裂等多种形态改变.电镜下观察用药组细胞见典型的凋亡细胞及凋亡小体的形成.TUNEL染色见部分用药组细胞胞核呈深棕黄色,提示细胞凋亡.结论:本研究通过光镜、电镜以及免疫组化等多方面的证实:Taxol主要是通过诱发细胞凋亡的机制而抑制RLECs生长的.
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视网膜血管铺片技术的改进及在糖尿病视网膜病研究中的运用
目的:改进视网膜血管铺片的制备方法,并用于糖尿病视网膜病的研究.方法:分别用胰蛋白酶消化法及胃蛋白酶-胰蛋白酶联合消化法制备视网膜血管铺片,比较铺片成功率.一次性腹腔注射STZ诱导糖尿病大鼠模型,成模13wk时以胃蛋白酶-胰蛋白酶联合消化法制备视网膜血管铺片,行HE染色观察血管形态改变,免疫组织化学染色方法观察RAGE、ICAM-1的表达.结果:胃蛋白酶-胰蛋白酶联合消化法较胰蛋白酶消化组铺片成功率高(80%vs53.3%,P<0.05),能显示清晰、完整的视网膜血管网.糖尿病大鼠视网膜无细胞毛细血管较正常大鼠增加2.67倍,毛细血管RAGE及ICAM-1免疫活性分别上调1.26倍,1.43倍(P<0.001).结论:胃蛋白酶-胰蛋白酶联合消化法是一种稳定的重复性好的视网膜血管铺片技术,可用于糖尿病视网膜病变的研究.
关键词: 视网膜血管铺片 糖尿病视网膜病 胰蛋白酶消化 胃蛋白酶-胰蛋白酶消化 -
猪脱细胞真皮基质在体内转归的动物实验与临床观察
一、资料与方法1.猪脱细胞真皮基质(ADM)的制备:健康白色家猪(解放军军事医学科学院动物所)16只,雌雄不限,体重(53±6)kg.处死后取断层皮片(厚度为0.3~0.4 mm),采用2.5g/L胰蛋白酶消化30 min,再用体积分数0.5%的TritonX-100持续振荡24 h后,置于体积分数0.5%的戊二醛溶液中浸泡10 min以及氯己定溶液中浸泡30 min,洗净.以1:2的比例拉网(3 cm×3 cm)后于4℃下保存待用.