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IL-6／IL-21信号通路在肺动脉高压的治病过程中起重要作用
肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension ，PAH）是一种发生在远端中小型肺动脉的疾病，主要与动脉肌化、内膜增厚和丛状损伤的形成有关。近年来，炎症和自身免疫也被认为是 PAH 病理过程中的重要因素。T 细胞、B 细胞、巨噬细胞等炎症细胞在进展型 PAH 的丛状损伤中有浸润。因此，这些细胞分泌的炎性因子可能与肺动脉内皮细胞（PAEC）和肺动脉平滑肌细胞（PASMC）的过度增殖有关。
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肝细胞生长因子抗血管内皮细胞凋亡信号通路的研究进展
慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是常见的严重危害人类健康的呼吸系统疾病。肺动脉高压（pulmonary hypertension，PH）是COPD患者主要并发症之一，是影响预后的独立危险因素［1］。COPD患者存在血管内皮细胞损伤［2］，肺动脉内皮细胞的凋亡与PH的发生密切相关［3］。肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF），或称分散因子（scatterfactor，SF），是一种多肽生长因子，近年研究发现，HGF是一种血管内皮特异性生长因子，通过抑制血管内皮细胞的凋亡，保护肺血管结构的完整性，延缓肺动脉高压的进程［4］。然而HGF通过何种信号通路对血管内皮细胞发挥抗凋亡作用尚不完全明确。因此，本文将对HGF对血管内皮细胞抗凋亡信号通路的研究进展进行综述，以明确日后研究方向。
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低氧诱导肺动脉内皮细胞间质细胞衍生因子-1的表达及其调控机制
肺血管重塑(PVR)是低氧性肺动脉高压持续且难以逆转的主要原因,其主要病变表现为肺动脉壁细胞增多,但其来源和机制仍不清楚.研究表明骨髓和外周血中存在血管壁细胞的祖细胞,并且参与了PVR的形成[1-3].间质细胞衍生因子-1(SDF-1)是特异性介导干细胞归巢至骨髓,介导祖细胞归巢至损伤或缺血组织的关键因子,SDF-1表达在这些部位的血管内皮细胞,而低氧是这些部位的微环境特征,也是诱导SDF-1表达的主要原因[4-5].低氧诱导因子-1α(HIF-1α)是特异性介导细胞低氧反应的关键因子,直接调控脐静脉内皮细胞SDF-1基因的表达[6].我们旨在探讨低氧对肺动脉内皮细胞SDF-1表达的影响及HIF-1α对其表达的调控作用.
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肺动脉高压糖代谢研究新进展
肺动脉高压是一类以肺动脉阻力逐渐升高为特征，少见的、致命的、异质性疾病，其病理表现主要为肺小动脉重塑，肺血管阻力升高，终导致右心衰竭。近年来，人们发现肺动脉高压的病理与恶性肿瘤在某些方面存在相似性，例如在PAH患者和PAH动物模型中均观察到肺动脉内皮细胞（EC）和平滑肌细胞（PASMC）存在过度增殖、抗凋亡现象。由研究肿瘤获得启发，人们开始研究代谢异常与PAH发病的关系。研究发现，肺动脉高压时，肥厚的右心室与重塑的肺血管均存在“Warburg效应”，表现为PET检查时，18F-FDG摄取量升高。肥厚的右心室在正常氧供条件下，心肌细胞由依赖线粒体氧化磷酸化供能转为依赖效率较低但无需耗氧的糖酵解作为能量主要来源，这种代谢转变被认为是由于缺血、压力导致线粒体重塑引起的。但是，在右心室由压力负荷增加到右心衰竭过程中，代谢底物是如何发生变化尚未研究清楚。根据临床与基础研究，右心室糖代谢的变化可作为反映肺动脉高压患者右心功能及判断预后的重要指标。而在肺血管中，引起Warburg效应的原因和其带来的影响非常复杂，也缺乏相应研究，但是可能与引起肺血管细胞过度增殖与抗凋亡有关。丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）二氯乙酸盐，以及脂肪酸氧化抑制剂曲美他嗪都是目前非常有价值的针对代谢治疗的药物。许多针对肺动脉高压代谢改变的技术，如PET和代谢组学，将成为肺动脉高压诊断、评估与检测的新手段。
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肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β对牛肺动脉内皮细胞凋亡的影响及意义
目的研究肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)对牛肺动脉内皮细胞(BPEC)损伤的机制及在急性肺损伤(ALI)发病过程中的作用.方法建立BPEC的体外培养,采用流式细胞仪膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin-V FITC)、碘化吡啶(PI)染色检测TNF-α、IL-1β对BPEC凋亡的影响以及抗TNF-α单克隆抗体、AC-DEVD-CHO(caspase-3的竞争性抑制剂)的保护效应.结果 (1)TNF-α作用24 h,随着其浓度的增加(浓度为500、1 000、2 000 U/ml),BPEC凋亡率逐渐增加[分别为(8.21±0.70)%、(9.63±0.71)%、(17.43±1.99)%],与对照组[(3.09±0.08)%]比较差异有显著性(P均＜0.05);(2)TNF-α (2 000 U/ml)培养时间延长(分别为6、12、24、36 h),BPEC凋亡率逐渐增加[分别为(6.72±0.38)%、(7.72±1.66)%、(12.95±0.32)%、(17.70±1.79)%,P均＜0.05];(3)加入抗TNF-α单抗、AC-DEVD-CHO的TNF-α组的BPEC凋亡率[(7.78±0.21)%、(7.32±0.11)%]显著高于单纯TNF-α(2 000 U/ml)组[(10.59±0.49)%,P均＜0.01],而加入IL-1β的TNF-α组的凋亡率[(10.73±0.60)%]与单纯TNF-α组比较差异无显著性(P＞0.05).结论 ALI过程中是TNF-α而不是IL-1β直接诱导了肺动脉内皮细胞的凋亡.IL-1β与TNF-α无协同促内皮细胞凋亡的作用.
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烟草烟雾提取物刺激人肺动脉内皮细胞引起衰老并诱导平滑肌细胞增殖和迁移
目的 观察烟草烟雾提取物(CSE)对肺动脉内皮细胞(HPAEC)衰老的影响以及细胞衰老相关分泌表型(SASP)对肺动脉平滑肌细胞(HPASMC)的增殖和迁移效应.方法 对HPAEC给予不同浓度的CSE,分别于0、6、12、24、48和72 h观察并使用CCK8法检测细胞活性,流式细胞术检测细胞的增殖情况,利用β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)衰老染色对衰老细胞进行拍照染色计数, Western blot法检测衰老相关蛋白的表达情况,免疫荧光检测细胞中蛋白的表达量,实时PCR检测衰老相关基因的表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测分泌的细胞因子浓度,Transwell检测HPASMC的迁移情况.结果 与0 h时比较,48 h时细胞活性明显降低,吸光度值为(1.8±0.1),差异有统计学意义(P<0.05);72 h时细胞活性(1.8±0.1)下降更加明显(P<0.01).流式细胞术检测细胞周期发现CSE刺激后S期细胞(14.1±1.2)数量较前(28.5±1.8)明显下降,细胞周期阻滞较为明显且具有统计学意义(P<0.01).细胞衰老相关分泌表型(SASP)的含量不断升高,其中MCP-1含量0 h时为(177±39),48 h时为(460±43),72 h时为(609±64);TGF-β1含量0 h时为(121±18),48 h时为(413±32),72 h时为(606±67);bFGF含量0 h时为(123±17),48 h时为(291±13),72 h时为(471±43),差异均有统计学意义(均P<0.05).Western blot法可见HPAEC中衰老相关蛋白p53或p21随着CSE刺激浓度和刺激时间的增加表达也逐渐增高(P<0.05),SA-β-gal衰老染色可见随着时间延长视野内衰老细胞的数量明显增加.免疫荧光和Transwell小室实验图像均可验证细胞增殖情况.结论 CSE可诱导HPAEC发生衰老并能够使平滑肌细胞发生迁移.
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重组尿激酶原对人肺动脉内皮细胞尿激酶型纤溶酶原激活物表达的影响
重组尿激酶原(u-PA)是我国自主研发的第2代具有纤维蛋白特异性、出血不良反应少的新型溶栓药物.重组尿激酶原用于急性心肌梗死溶栓治疗的大型临床研究显示,其溶栓效果好,且较链激酶原(t-PA)对全身纤维溶解系统的影响小.
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凝血酶致脑微血管内皮细胞凋亡作用
脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cell,BMVEC)在脑疾病发生、发展中占重要地位[1].近年来,BMVEC的体外培养方法已获成功[2].凝血酶是一种血清丝氨酸蛋白酶,除参与凝血外,它还促进BMVEC收缩并增加其通透性[3],并与肺动脉内皮细胞及神经元凋亡相关[4～6].本实验用体外原代培养的大鼠BMVEC研究凝血酶的作用,并用其受体拮抗剂水蛭素探讨致病机制.
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银杏叶提取物和左旋硝基精氨酸甲酯对内毒素致大鼠肺动脉内皮细胞损伤的保护作用
我们于2006年10月至2008年4月观察银杏叶提取物(GbE)和左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)对内毒素致大鼠肺动脉内皮细胞(PAECs)损伤的保护作用,通过内毒素即脂多糖制备细胞损伤模型,GbE和L-NAME两种药物单独用药和联合用药进行药物干预,检测多种指标,观测联合用药是否在保护内皮细胞损伤方面较单独用药具有优越性[1-3].
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缺氧肺动脉内皮细胞纤溶系统的变化及卡托普利对其的影响
缺氧性肺动脉高压常有微血栓形成，一般认为与高凝状态有关，但是否同时存在纤溶系统功能紊乱，尚不十分清楚。本实验采用体外培养的方法，观察了缺氧时肺动脉内皮细胞分泌组织型纤溶酶原激活物(tPA)及纤溶酶原激活物抑制物(PAI-1)的变化及卡托普利对其分泌功能的影响。 一、材料与方法 1.肺动脉内皮细胞的培养：无菌操作取成年杂种猪肺动脉段（大动脉），清洗后钳夹一端血管，将37℃预温的0.1%胶原酶（Ⅱ型）注入管腔，37℃孵育30 min，收集消化液，离心洗2次，加入含20%小牛血清的M199培养液，按1×105/ml细胞量接种于培养瓶中，37℃，5%CO2孵箱培养，待细胞长满后用0.25%胰蛋白酶消化、传代，2～3代内皮细胞用于实验。
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重组尿激酶原对人肺动脉内皮细胞u-PA系统的影响
目的 探讨重组尿激酶原对体外培养的正常人肺动脉内皮细胞(HPAECs)尿激酶型纤溶酶原激活物系统表达的影响.方法 将重组尿激酶原0或150 IU/mL与人肺动脉内皮细胞共同孵育8 h,收集培养上清并应用ELISA方法检测其中尿激酶型纤溶酶原激活物受体(u-PAR)和纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)的含量;将重组尿激酶原(0～150 IU/mL)分别与HPAECs共同孵育(0～24 h),提取细胞总RNA并应用RT-PCR技术检测尿激酶型纤溶酶原激活物(u-PA)mRNA表达的变化.结果 细胞培养上清ELISA实验表明,与对照组相比,重组尿激酶原150 IU/mL组细胞培养液中u-PAR的含量显著增加[(0.51±0.04)μg/L vs (0.58±0.05) μg/L,P=0.005];PAI-1的含量显著下降[(66.75±7.92) μg/L vs (53.38±12.18) μg/L,P=0.009].RT-PCR结果表明,HPAECs与重组尿激酶原150 IU/mL共同培养后0 h、4 h、8 h、12 h和24 h 5个时间点u-PA条带与GAPDH条带平均光密度之比分别为(0.34±0.11)、(0.51±0.12)、(0.58±0.12)、(0.50±0.18)和(0.35±0.10).其中8 h组与对照组相比差异有统计学意义,8 h组与24 h相比P=0.053.结论 重组尿激酶原能够明显促进HPAECs释放u-PAR并显著抑制PAI-1的表达和释放.重组尿激酶原能够呈时间依赖性提高u-PA mRNA在HPAECs的表达.重组尿激酶原直接影响人肺动脉内皮细胞u-PA系统的表达,该作用可能是增强药物本身溶栓疗效的一种重要途径.
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15-LOX-1对LPS作用下肺动脉内皮细胞增殖和炎性因子的影响
目的 探讨下调15-脂氧酶-1(15-LOX-1)对脂多糖(LPS)作用下肺动脉内皮细胞(PAECs)和炎性因子分泌的影响.方法 体外培养PAECs,并随机分为4组:对照组、LPS组、15-LOX-1 siRNA对照组(scramble组)和15-LOX-1 siRNA组.采用Real-time PCR检测15-LOX-1表达,MTT法检测PAECs增殖变化,ELISA法检测产物13-HODE以及炎性因子白细胞介素1α(IL-1α)和白细胞介素6(IL-6)的变化.结果 与LPS组比较,15-LOX-1siRNA组15-LOX-1 mRNA表达降低,PAECs增殖增多,13-HODE、IL-1oα和IL-6分泌减少,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 下调15-LOX-1可抑制炎性因子分泌,促进PAEC增殖,改善LPS对内皮的损伤.
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内毒素诱导肺动脉内皮细胞生成过氧亚硝基阴离子的意义
目的:探讨牛肺动脉内皮细胞(BPAEC)产生过氧亚硝基阴离子(ONOO )的能力及其作用.方法:用流式细胞免疫荧光技术,定量检测内毒素主要成分脂多糖(LPS)诱导培养的BPAEC中ONOO-生成标志物硝基酪氨酸(NT)的含量,观察ONOO-对BPAEC形态变化的影响.结果:LPS可剂量依赖性诱导BPAEC产生ONOO-明显增多,并为氨基胍部分翻转;ONOO-可导致BPAEC明显回缩,胞体变小,细胞间隙增宽.结论:LPS诱导BPAEC产生增多的ONOO-可能参与介导LPS对BPAEC本身的损伤效应.
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T淋巴细胞趋化因子受体5表达上调介导了肠毒素超抗原对肺动脉内皮的损伤
目的 观察革兰阳性菌肠毒素活化的T淋巴细胞(T细胞)对人肺动脉内皮细胞(HPAEC)的损伤作用,初步探讨其损伤机制.方法 将葡萄球菌肠毒素B(SEB)活化后的T细胞上清加入HPAEC,检测内皮细胞趋化因子的分泌情况;用Transwell小室观察内皮细胞分泌的趋化因子对T细胞趋化的影响.用10 ng/ml SEB刺激的T细胞与HPAEC共培养,检测T细胞与内皮细胞的黏附率;用原位末端缺刻标记法(TUNEL)检测内皮细胞凋亡情况.结果 不同浓度T细胞培养上清刺激的HPAEC都表现出趋化因子随刺激时间延长而释放增加的趋势,72 h后1×10-2、1×10-1、1×100T细胞中单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1,ng/ml)分别为1.240±0.103、4.200±0.305、6.500±0.500,巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α,ng/ml)分别为0.210±0.015、0.287±0.012、0.531±0.037,正常T细胞表达和分泌因子(Rantes,ng/ml)分别为1.420±0.074、7.634±0.630、15.700±1.300,其中Rantes表现出早期(6 h)快速释放和后期(12、24、48、72 h)延迟释放的特点.与未经SEB作用的对照组相比,超抗原组的T细胞从Transwell小室上室趋化移动至聚碳酸酯膜的数量(个)显著增多(86.38±14.50比16.50±2.50,P＜0.01＝;与T细胞组比较,超抗原组24 h T细胞黏附率显著增加[(15.50±1.08)%比(1.60±0.22)%,P＜0.01＝,加入1 μg/ml甲基化Rantes组T细胞黏附率[(4.39±0.66)%]较超抗原组显著下降(P＜0.01＝;黏附到下层HPAEC的T细胞趋化因子受体5(CCR5)/CD4较100 ng/ml SEB诱导3 d的单个核细胞(PBMC)增加了约2.5倍,CCR5/CD8增加了约2.8倍;与正常培养的HPAEC组比较,超抗原组HPAEC细胞凋亡指数增加[(32.50±4.50)%比(3.50±0.50)%,P＜0.01＝.结论 SEB活化的T细胞增加了对HPAEC的趋化和黏附,进一步导致HPAEC的损伤;这种趋化作用的增强与SEB活化的T细胞表面CCR5表达上调有关.
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红景天苷对人肺动脉内皮细胞线粒体ROS及细胞分泌功能的影响
目的:研究红景天苷对氧化应激下人肺动脉内皮细胞线粒体ROS及细胞分泌功能的影响及其分子机制.方法:应用香烟烟雾提取液(CSE)诱导人肺动脉内皮细胞(hPAE)生成ROS,红景天苷干预hPAE,ELISA检测CES诱导、红景天苷干预的hPAE合成的NOS、ET-1、VGGF的变化,DCFH-DA、Rh123法分别检测线粒体ROS、线粒体膜电位的变化.结果:CSE组线粒体ROS的DCFH-DA的荧光强度高于生理水组,NOS、ET-1和VEGF的合成高于CSE+红景天苷组、生理盐水组；CSE组的线粒体的膜电位高于CSE+红景天苷组和生理盐水组;CSE+红景天苷组的线粒体ROS的DCFH-DA和DiBAC4的荧光强度低于CSE组,而与生理盐水组接近.结论:红景天苷可抑制CSE诱导的人hPAE线粒体ROS的生成,恢复线粒体的膜电位,降低NOS、ET-1和VEGF的合成,从而保护氧化应激下hPAE细胞的分泌功能.
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P2X7R在肺动脉高压患者及人肺动脉内皮细胞中的表达
目的 探讨肺动脉高压患者与人肺动脉内皮细胞中P2X7受体(P2X7R)的表达变化,探讨P2X7R是否参与肺动脉高压发病.方法 人的肺组织来源于黑龙江省医院,其中对照组取自右下肺叶球形性变实施肺叶切除患者的肺组织,病变组取自患有特发性肺动脉高压尸检患者的肺组织,应用免疫印迹及实时定量PCR技术检测P2X7R的表达变化.人肺动脉内皮细胞系给予缺氧处理后,采用免疫印记技术检测P2X7R的表达变化.结果 原发性肺动脉高压患者肺组织P2X7R在蛋白及mRNA水平的表达均较对照组明显增高.缺氧组肺动脉内皮细胞P2X7R在蛋白水平的表达较常氧对照组明显增高.结论 原发性肺动脉高压患者肺组织及缺氧肺动脉内皮细胞P2X7R表达上调,提示P2X7R可能参与肺动脉高压发病过程.
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新生儿持续肺动脉高压与肺血管内皮细胞功能
新生儿持续肺动脉高压(persitent pulmonary hypertension of newborn,PPHN)是指新生儿期肺血管阻力增高及肺血流速度增加而发生的临床综合征.其发生率为活产儿的1‰,是新生儿多种疾病引起死亡的终病理途径.本症多继发于先天性心脏病、慢性缺氧或急性呼吸衰竭,其中主要为肺实质疾病,特点为严重肺动脉高压,导致肺外右向左血液分流及低氧血症[1].1 PPHN病理生理改变1.1 肺血流速度增加伴有肺内或心内分流的新生儿,随着肺血管阻力降低,肺血流速度(Qp)常增加,使肺血管床扩张,同时由于左心容量负荷增加,使肺动脉楔压和毛细血管静水压增高.Qp持续增高,将导致肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞结构改变,使肺血管阻力(PVR)增加,发生肺动脉高压(PH)[2].
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缺氧条件下15-脂氧化酶在体内肺组织的表达
目的 探讨缺氧过程中,在大鼠体内肺组织15-LO(15-脂氧化酶)在不同时间的表达程度和分布.方法 通过制作缺氧模型,正常Wistar雌性大鼠随机分为对照组,缺氧1 d、3 d、5 d和7 d组,大鼠每天缺氧2 h,其他时间置于空气中,原位杂交方法检测15-LO在体内的表达程度.结果 在缺氧1 d、3 d、5 d、7 d时,通过原位杂交方法,可见在肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞15-LO的表达逐渐增强,而且在各级肺动脉均有表达,正常对照组和缺氧7d组比较,P<0.05有显著统计学意义.结论 提示在体内15-LO随缺氧时间的增加,表达逐渐加强.
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缺氧时肺动脉内皮细胞与肺动脉平滑肌细胞增殖的相互影响
血管内皮细胞和血管平滑肌细胞在结构和功能上关系密切,两者的相互作用参与血管舒缩和血管壁结构的调节.本文观察了培养的小牛肺动脉内皮细胞(PAECs)和肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)缺氧时在细胞增殖方面的相互影响.PASMCs常氧条件培养基(CM)可使PAECs的3H-TdR掺入降低约58%(P＜0.01),缺氧CM对PAECs的3H-TdR掺入无明显的抑制作用;PAECs的常氧CM使PASMCs的3H-TdR掺入升高约60%,缺氧CM则明显抑制PASMCs的3H-TdR掺入(降低27%,P＜0.01).PAECs和PASMCs混合培养24h后,常氧条件下混合细胞的相对3H-TdR降低22%(P＜0.01),2.5%O2和0%O2缺氧条件下,相对3H-TdR掺入分别升高75%和44%(P＜0.01,与常氧组相比).与单独培养组相比,常氧或0%O2条件下共培养24 h末,PASMCs的3H-TdR掺入分别升高18%和26%(P＜0.05),常氧组G1期细胞减少,G2/M期细胞增多(P＜0.01),缺氧组C1和S期细胞增多,G2/M期细胞减少(P＜0.01);PAECs的3H-TdR掺入降低24%和38%(P＜0.01),G1和S期细胞增多,G2/M期细胞大幅度减少(P＜0.01).上述结果表明PAECs和PASMCs在细胞增殖方面存在复杂的调节关系,其调节在缺氧时发生改变,这种改变可能参与缺氧性肺动脉高压的发生.
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红花黄素对大鼠肺动脉内皮细胞P-选择素及ICAM-1表达的影响
目的 观察红花黄素在缺氧复氧条件下对大鼠肺动脉内皮细胞P-选择素(Ps)及细胞间黏附分子-1(ICAM-1)基因表达的影响.方法 采用细胞培养、RT-PCR、Western blot、免疫细胞化学染色法等技术,观察在常氧、缺氧、复氧及红花黄素干预等不同条件下大鼠肺动脉内皮细胞Ps、ICAM-1 mRNA及蛋白表达的变化.结果 常氧组细胞1、6、12h各个时间点,Ps、ICAM-1 mRNA及蛋白表达水平没有明显变化,缺氧组的各个时间点Ps、ICAM-1表达水平与同时间点常氧组相比无统计学差异(P分别＞0.05).缺氧1h后再给氧1、6、12h,Ps、ICAM-1 mRNA及蛋白的表达均明显高于相同时间点常氧组与缺氧组(P分别＜0.05);缺氧1 h后再给氧同时给予红花黄素干预组Ps、ICAM-1 mRNA及蛋白的表达均明显低于相同时间点单纯缺氧复氧组(P分别＜0.05).结论 单纯缺氧状态下大鼠肺动脉血管内皮细胞Ps、ICAM-1表达无明显变化,缺氧复氧条件下Ps、ICAM-1表达上调,红花黄素可抑制缺氧复氧条件下Ps、ICAM-1的过度表达.
