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产后子宫复旧的要诀
女性在整个妊娠与分娩的阶段,子宫的变化是非常大的.想象一下,在孕前,一个重约50g左右、长约7 ～ 8cm、宽约4 ～ 5cm、容量也就5ml左右的子宫,它是如何能做到在里面慢慢地孕育出一个胎儿的呢?这是因为子宫本身就是一种肌性器官,它在整个孕期会随着胎儿的慢慢增大而逐渐被撑大,到分娩前,它已经撑大到可以容纳胎儿及胎盘、脐带、羊水等了.待分娩后,这些内容物逐渐排出时,子宫也开始启动修复程序,随着子宫肌细胞的缩复,终慢慢地恢复至孕前状态.
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白芍总苷对H2O2诱导乳鼠心肌细胞损伤的保护作用
目的：研究白芍总苷对过氧化氢(H2O2)诱导乳鼠心肌细胞损伤的保护作用，探讨其作用机制。方法取出生3 d的SD乳鼠，分离心肌细胞，培养72 h后分别设模型组，白芍总苷低、中、高剂量组，舒血宁注射液组，空白对照组，每组8个复孔；除空白对照组外，其余各组细胞经H2O2(100μg/ml)处理。白芍总苷低、中、高剂量组分别用含30、60、120μg/ml白芍总苷的培养基培养，舒血宁注射液组给予含100μg/ml舒血宁注射液的培养液，空白对照组和模型组于普通培养基中培养。干预6 h后，通过倒置显微镜观察各组细胞形态学变化；采用MTT法检测各组细胞存活率；检测各组细胞培养液中AST、磷酸肌酸激酶(CPK)、乳酸脱氢酶(LDH)水平；测定各组细胞SOD、GSH-Px、过氧化氢酶(CAT)、MDA水平；通过流式细胞术测定细胞凋亡率。结果与模型组比较，白芍总苷中、高剂量组细胞存活率[(64.1±7.3)%、(81.3±7.8)%比(42.3±6.2)%]升高(P＜0.05或P＜0.01)；细胞培养液中AST[(26.72±6.03)U/ml、(23.86±5.38)U/ml 比(34.75±6.91)U/ml]、CPK[(1.96±0.35)U/ml、(1.59±0.32)U/ml 比(2.54±0.40)U/ml]、LDH[(811.55±162.32)U/L、(683.48±134.14)U/L比(936.07±140.94)U/L]含量降低(P＜0.05或 P＜0.01)；细胞中 SOD[(85.34±16.87)U/mg、(94.62±17.75)U/mg 比(56.45±13.76)U/mg]、CAT[(22.76±3.38)U/mg、(26.49±3.72)U/mg 比(16.13±3.18)U/mg]活性升高(P＜0.05或 P＜0.01)， MDA[(8.74±2.05)nmol/mg、(6.91±1.80)nmol/mg 比(11.56±2.19)nmol/mg]含量降低(P＜0.05或 P＜0.01)；细胞凋亡率[(24.2±5.5)%、(13.4±3.9)%比(51.2±9.1)%]降低(P＜0.05或 P＜0.01)，且白芍总苷高剂量组GSH-Px[(3.54±0.83)U/mg比(2.50±0.67)U/mg]活性升高(P＜0.05或P＜0.01)。结论白芍总苷对H2O2所致乳鼠心肌细胞损伤具有剂量依赖性的保护作用，其作用机制可能与白芍总苷可有效改善抗氧化酶活性、抑制氧化应激损伤、降低细胞凋亡率有关。
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九龙藤总黄酮对过氧化氢诱导乳鼠心肌细胞氧化应激损伤的保护作用
目的 观察九龙藤总黄酮对过氧化氢(H2O2)诱导乳鼠心肌细胞氧化应激损伤的保护作用.方法分离SD大鼠乳鼠心肌细胞,培养72 h后随机分为空白对照组,模型组,九龙藤总黄酮高、中、低剂量组,舒血宁注射液组.除空白对照组外,其余各组细胞经H2O2(100μg/ml)处理.九龙藤总黄酮高、中、低剂量组给予含240、120、60μg/ml九龙藤总黄酮的培养液干预,舒血宁注射液组给予含100μg/ml舒血宁注射液的培养液,空白对照组和模型组给予普通培养基培养.干预6 h后,通过倒置显微镜观察各组细胞形态学变化,通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组细胞存活率;检测各组细胞培养液中天冬氨酸转氨酶(AST)、磷酸肌酸激酶(CPK)、乳酸脱氢酶(LDH)水平;测定各组细胞中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)水平;通过流式细胞术测定细胞凋亡率,并通过Western blot方法检测心肌细胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)表达.结果与模型组比较,九龙藤总黄酮中、高剂量组心肌细胞培养液中AST[(28.8±6.1)U/ml、(24.5±5.3)U/ml比(36.2± 6.7)U/ml]、CPK[(1.8±0.4)U/ml、(1.5±0.3)U/ml 比(2.5±0.4)U/ml]、LDH[(805.2±160.9)U/L、(671.5± 128.7)U/L比(916.5±168.4)U/L]水平降低(P<0.05或P<0.01);心肌细胞中SOD[(84.8±17.4)U/mg、(95.3±18.2)U/mg比(55.7±13.1)U/mg]、CAT[(23.4±3.1)U/mg、(26.3±3.5)U/mg比(15.2±3.0)U/mg]水平升高(P<0.05 或 P<0.01),MDA[(8.1±1.7)nmol/mg、(6.8±1.5)nmol/mg 比(11.1±2.3)nmol/mg]水平降低(P<0.05或P<0.01),caspase-3[(1.64±0.16)、(1.30±0.12)比(2.06±0.25)]表达、细胞凋亡率[(24.2±5.5)%、(13.4±3.9)%比(51.2±9.1)%]显著降低(P<0.05或P<0.01);九龙藤总黄酮高剂量组细胞中 GSH-Px[(3.6±0.9)U/mg 比(2.4±0.7)U/mg]活性显著升高(P<0.05).结论 九龙藤总黄酮可有效改善 H2O2诱导氧化应激损伤乳鼠心肌细胞形态、提高细胞存活率、改善抗氧化酶活性、下调 caspase-3表达、降低细胞凋亡率,对H2O2诱导乳鼠心肌细胞氧化应激损伤具有剂量依赖性的保护作用.
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乌头碱、新乌头碱及次乌头碱对心肌细胞钙释放的影响
目的：探讨乌头碱、新乌头碱、次乌头碱对心肌细胞钙释放的影响。方法分离的成年Sprague-Dawley大鼠左心室心肌细胞分别使用0.3、1、3μmol/L乌头碱、新乌头碱、次乌头碱溶液灌流12 min，灌流后4、8、12 min时检测自发性钙释放(SCR)诱发率以及舒张末期钙浓度(F0)、钙瞬变幅度(ΔF)的变化。检测灌流0.3μmol/L乌头碱、新乌头碱、次乌头碱溶液后12 min，心肌细胞发挥正性肌力作用时钙瞬变和收缩功能动力学指标的变化。结果乌头碱、新乌头碱、次乌头碱均可诱发SCR，0.3μmol/L时新乌头碱SCR诱发率高，3μmol/L时乌头碱SCR诱发率高。与对照组比较，给药后12 min，3μmol/L乌头碱、新乌头碱、次乌头碱均可增加 F0[(1.459±0.379)、(1.585±0.493)、(1.213±0.254)比(1.079±0.108)]、ΔF[(1.615±0.455)、(2.210±0.756)、(1.528±0.422)比(1.036±0.125)]，差异有统计学意义(P均＜0.05)；且新乌头碱ΔF高于乌头碱和次乌头碱(P均＜0.05)。与对照组比较，0.3μmol/L乌头碱、新乌头碱、次乌头碱均可增加ΔF[(0.409±0.127)、(0.423±0.107)、(0.414±0.118)比(0.260±0.065)；P＜0.05或P＜0.01]、收缩幅度[(5.464±2.239)%、(7.449±2.548)%、(5.524±1.645)%比(3.428±0.911)%；P＜0.05或 P＜0.01]，延长钙瞬变达峰时间[(0.041±0.016)s、(0.039±0.009)s、(0.038±0.011)s 比(0.032±0.007)s；P＜0.05或P＜0.01]；与乌头碱组比较，新乌头碱和次乌头碱可降低钙瞬变消除时间常数[(0.301±0.054)s、(0.324±0.064)s 比(0.361±0.076)s；P＜0.05或P＜0.01]，缩短舒张期收缩恢复至50%时的时间[(0.124±0.035)s、(0.126±0.040)s 比(0.157±0.056)s；P＜0.05或 P＜0.01]。结论乌头碱、新乌头碱、次乌头碱的正性肌力作用与毒性效应同时存在，表明心肌细胞内钙浓度升高是产生正性肌力作用的有利因素，也是诱发SCR的危险因素。
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萝卜硫素抑制脂多糖诱导心肌细胞肥大的机制研究
目的 探讨萝卜硫素对脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导心肌细胞肥大的影响及其作用机制.方法 体外原代培养新生大鼠心肌细胞,将心肌细胞按随机数字表法分为对照组,LPS诱导组,JAK2抑制剂组,萝卜硫素低、中、高剂量组.除对照组外,其余各组细胞加入1 mg/L的LPS进行干预,低、中、高剂量组加入10、20、40 μg/ml萝卜硫素进行干预,JAK2抑制剂组加入JAK2抑制剂10 nmol/L干预24 h.采用计算机图像分析系统测定心肌细胞体积,BCA法测定心肌细胞中总蛋白含量,ELISA法检测细胞培养基上清液中 IL-6、TNF-α水平,WB 法检测酪氨酸激酶/信号转导子和转录激活子(janus kinase/signal transducer and activator of transcription, JAK/STAT)信号通路相关蛋白表达水平.结果 与LPS诱导组比较,低、中、高剂量组细胞体积[(1 635.71±154.84)μm3、(1 450.06±140.13)μm3、(1 194.51± 134.76)μm3比(1 854.28±181.37)μm3]和蛋白[(20.14±2.11)μg、(17.59±1.64)μg、(14.27±1.47)μg 比(23.17±2.56)μg]含量降低(P＜0.05);细胞培养基上清中 IL-6[(1 410.08±255.17)pg/ml、(1 065.61± 210.37)pg/ml、(790.09±140.28)pg/ml 比(1 804.07±275.34)pg/ml]、TNF-α[(164.16±27.51)pg/ml、(130.13± 22.08)pg/ml、(92.27±12.16)pg/ml比(182.42±30.37) pg/ml]水平降低(P＜0.05);细胞p-JAK2/JAK2[(0.39± 0.05)、(0.27±0.04)、(0.21±0.03)比(0.54±0.07)]、p-STAT3[(0.47±0.05)、(0.25±0.03)、(0.18±0.03)比(0.53±0.06)]表达降低(P＜0.05).结论 萝卜硫素对LPS诱导的心肌细胞肥大具有保护作用,其机制可能与抑制JAK2/STAT3信号通路活化有关.
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足阳明经穴针刺血清对家兔离体胃窦平滑肌细胞舒缩活动的影响
目的:探讨足阳明经穴针刺血清对家兔离体胃窦平滑肌细胞舒缩活动的影响,从离体细胞水平研究足阳明经与胃相关的特异性.方法:将45只家兔随机分为生理盐水组、阿托品模型组、针刺足阳明经穴组、针刺足少阳经穴组、针刺足太阳经穴组,每组9只.分组处理后,颈动脉采血制备针刺血清.另取正常家兔10只,取胃窦平滑肌,经Ⅱ型胶原酶消化后制成正常兔胃窦平滑肌细胞悬液.取1∶2稀释的针刺血清与同体积的正常兔平滑肌细胞悬液作用,用戊二醛固定后在显微镜下以测微尺测定细胞长度.结果:阿托品模型组的血清能使正常兔胃窦平滑肌细胞舒张,细胞长度增加;针刺足阳明经穴组的血清可以促进正常兔胃窦平滑肌细胞收缩,细胞长度缩短,而针刺足少阳经穴组和针刺足太阳经穴组的血清对正常兔胃窦平滑肌细胞的长度影响不明显.结论:足阳明经穴针刺血清能使离体胃窦平滑肌细胞产生明显的收缩效应,从离体细胞水平进一步证实了足阳明经与胃相关的特异性.
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人酪氨酸羟化酶基因在猴骨骼肌直接注射后的表达
为了对多途径治疗帕金森病(PD)提供研究依据,将带人酪氨酸羟化酶基因的质粒pRcTH与脂质体混合后直接注射至猴骨骼肌内,100d后取注射部位肌肉组织,以地高辛标记的hTHRNA探针进行Northern杂交,以检测该质粒在非人灵长类活体骨骼肌组织中表达的目的基因的mRNA水平.本研究结果表明,人酪氨酸羟化酶基因在猴体内有较高效率的表达.本研究提示,质粒可作为基因治疗的较理想的表达载体,而骨骼肌细胞则是一种能携带并表达外源基因的良好靶细胞.
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对"Channelopathy"定义及分类的一些看法
"Channelopathy",又称"Ionic Channelopathy".对于"Channelopathy"的中译名目前多为"离子通道病",也有译为"通道病理学",前者基本上得到了普遍公认,并无太多异议.然而对于"离子通道病"的定义及分类目前还无明确概念,存在较多混淆.现一般多将"离子通道病"定义为"神经元或肌细胞膜上阳离子Na+ 、K+、 Ca2+ 通道和阴离子Cl- 通道由于编码通道蛋白的基因发生突变导致通道功能和(或)结构异常的一类疾病".笔者认为这一定义存在较大缺陷,其缺点在于:(1)过于片面;(2)概念落伍,不能反映新研究进展.有必要对这一概念进行明确地再定义.
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体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化
目的 探讨生长因子在体外能否诱导大鼠骨髓来源的间充质干细胞(BM-MSC)向心肌样细胞分化,是否增强其旁分泌作用.方法 取4周龄雄性SD大鼠骨髓,贴壁法培养BM-MSC至第3代时,应用流式细胞仪检测其表面标志物CD29、CD44、CD105、CD34、CD45、CD31.将细胞随机分为间充质干细胞组(MSC组)和生长因子共培养组(GF-MSC组).MSC组继续培养传代;GF-MSC组与生长因子[其中包括培养基(IMDM)、2％胎牛血清(FBS)、20 nmol/L地塞米松、100μmo1/L维生素C(VitC)、50 μg/L成纤维细胞生长因子2(FGF-2)、10 μg/L成骨蛋白2(BMP-2)、2μg/L胰岛素样生长因子1(IGF-1)、青霉素和100 mg/L链霉素]共培养.1周后细胞免疫荧光染色检测两组细胞肌钙蛋白Ⅰ(TnⅠ)和结蛋白(Des)表达;反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测两组细胞Tn Ⅰ和Des mRNA的表达;ELISA法检测两组细胞裂解液以及细胞培养上清中的肝细胞生长因子(HGF)和血管内皮生长因子(VEGF)的蛋白水平.结果 体外培养的BM-MSC表达CD29、CD44、CD105,而不表达CD31、CD34、CD45.免疫荧光染色显示GF-MSC阳性表达TnⅠ和Des.RT-PCR结果显示TnⅠ和Des mRNA在GF-MSC有阳性表达,而MSC为阴性表达.GF-MSC组HGF、VEGF在细胞裂解液和细胞培养上清中的蛋白水平(ng/L)高于MSC组(HGF裂解液32.05±0.41比12.10±0.21,培养上清574.21±4.19比169.16±2.41;VEGF裂解液45.66±2.22比30.37±0.54,培养上清487.78±36.29比44.25±1.31;均P＜0.05).结论 体外与生长因子共培养,可诱导BM-MSC向心肌样细胞分化,并增强其旁分泌作用.
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迷迭香酸对H9C2心肌细胞氧化应激损伤的影响
目的 探讨迷迭香酸(RA)对H9C2心肌细胞氧化应激损伤的影响.方法 采用过氧化氢(H2O2)处理建立氧化应激损伤模型,体外培养H9C2心肌细胞并随机分为对照组、H2O2组、H2O2+RA组.H2O2组采用400μmol/L的H2O2处理4 h建立氧化应激损伤模型;H2O2+RA组在加入H2O2前分别用低剂量(5μg/ml)、中剂量(10μg/ml)、高剂量(20μg/ml)的RA预处理24 h,CCK-8法检测H9C2心肌细胞存活率,DCFH-DA探针联合酶标仪检测细胞内反应活性氧(ROS)含量,试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出量、细胞内丙二醛(MDA)含量以及过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性,免疫印迹和实时荧光定量PCR分别检测还原性辅酶II氧化酶2(NOX2)、超氧化物歧化酶2(SOD2)以及凋亡相关基因Bax、Bcl-2、cleavage-caspase 3(c-cas 3)和caspase 3(cas 3)的表达情况;TUNEL试剂盒检测细胞凋亡水平.结果 (1)各H2O2组细胞活力均低于对照组,低浓度RA对细胞生长无抑制作用,但RA浓度过高(≥30μg/ml)对H9C2心肌细胞的生长有明显的抑制作用;(2)与对照组相比,H2O2组细胞生存率下降52.9%,LDH漏出量增加73.8%,RA预处理可使细胞生存率升高、LDH漏出量减少,且这种保护作用随着RA浓度增加,更为显著;(3)与对照组相比,H2O2组细胞内氧化水平显著升高,MDA含量增加146.7%、ROS水平增加192.2%,RA预处理后,ROS产生显著减少,细胞内MDA含量下降,RA高浓度组的抑制作用更为显著;(4)与对照组相比,H2O2组细胞凋亡明显,RA预处理可改善H2O2诱导的凋亡水平,且高浓度组的改善程度更加明显.结论 RA对氧化应激条件下的H9C2心肌细胞具有明显的保护作用.
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老年高血压大鼠心肌细胞apelin-APJ系统的变化
目的 探讨体外培养48 h后的老年高血压大鼠心肌细胞apelin-APJ系统的变化.方法 雄性SD大鼠16只,采用两肾一夹方法制备老年高血压大鼠模型(老年高血压组,n=8),以假手术组作为对照组(n=8).术后20个月,心脏超声和血流动力学测定心功能和心室结构,检测血浆及心肌细胞培养48 h后上清中apelin含量(ELISA法),心肌细胞APJ蛋白水平(Western印迹法)及环磷酸腺苷(cAMP)蛋白水平(ELISA法).结果 与对照组比,老年高血压组mSP(平均收缩压)、mDP(平均舒张压)、PP(平均脉压差)、LVDP(左室舒张末期压)、IVSd(舒张期室间隔厚度)、LVIDd(左心室舒张末期内径)、LVPWd(左心室舒张末期后壁厚度)显著升高(P＜0.05)；体质量、±dp/dt(左室内压上升/下降大速率)、FS％(左心室短轴缩短率)、EF％(左室射血分数)明显降低(P＜0.05).大鼠左室心肌细胞培养48 h后,老年高血压组培养上清中apelin分泌显著高于对照组[(0.80±0.12) μg/L比(0.41±0.08) μg/L,P＜0.05]；血浆apelin含量、心肌细胞APJ及cAMP蛋白表达显著低于对照组(P＜0.05).结论 长期高血压造成老年大鼠心室重构,其中cAMP作为apelin-APJ系统的第二信使参与了心室重构的发生发展.
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神经肽Y对大鼠心肌细胞Ca2+-钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ的影响
目的 探讨神经肽Y对大鼠心肌细胞ca2+-钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMK Ⅱ)的影响.方法 原代培养SD乳鼠心肌细胞,分为对照组(n=6)和神经肽Y组(n=6),神经肽Y组加入终浓度为100 nmol/L的神经肽Y,对照组不进行处理.处理15 min后采用同位素32P掺人法检测心肌细胞CaMK Ⅱ活性,免疫印迹法(Western blotting)检测磷酸化CaMK Ⅱ(p-CaMK Ⅱ)蛋白表达;处理24 h后激光共聚焦显微镜下记录心肌细胞静息状态下细胞核Ca2+-浓度,实时定量PCR检测心肌细胞β-肌球蛋白重链(β-MHC)、心钠素mRNA表达.结果 神经肽Y刺激心肌细胞15 min后,神经肽Y组CaMK Ⅱ活性较对照组明显升高(336 094.80±10 744.61比273 301.50±16 737.99,P＜0.05),P-CaMK Ⅱ蛋白表达明显增加.神经肽Y刺激心肌细胞24 h后,神经肽Y组心肌细胞胞核Ca2+-浓度较对照组明显增加(226.87±17.37比84.04±6.50,P＜0.01);实时定量PCR显示β-MHC、心钠素mRNA表达亦明显增加.结论 神经肽Y通过增加心肌细胞胞核Ca2+浓度活化CaMK Ⅱ.CaMK Ⅱ可能在神经肽Y诱导心肌细胞肥大效应中起着重要作用.
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尼古丁对大鼠气道平滑肌细胞内钙离子浓度及膜瞬时受体电位通道mRNA表达的影响
目的 观察尼古丁刺激大鼠气道平滑肌细胞(ASMC)后细胞内基础钙离子浓度的改变及平滑肌细胞膜瞬时受体电位通道(TRPC1,TPRC6)mRNA表达水平变化.方法 不同浓度尼古丁[O(对照组)、10、20、50、100μg/L]刺激大鼠气道平滑肌细胞,作用24及48 h后,采用Incyte细胞内钙浓度检测系统观察细胞内钙离子浓度的变化.提取细胞总RNA,反转录成cDNA,实时定量PCR方法检测细胞TRPC1和TRPC6 mRNA表达量变化.结果 20、50、100μg/L的尼古丁刺激大鼠气道平滑肌细24和48 h后,细胞内基础钙离子浓度均较对照组明显升高[(117.99±19.39)、(122.89±17.91)、(124.70±17.93)nmol/L比(85.85±12.60)nmol/L;(142.07±18.99)、(162.27±19.91)、(207.30±26.56)nmol/L比(98.04±2.39)nmol/L,均P＜0.05].而细胞中TRPC1和TPRC6 mRNA相对浓度也均较对照组显著升高(P＜0.05),其中,100μg/L尼古丁刺激气道平滑肌细胞48 h后,细胞内基础钙离子浓度和TRPC6 mRNA相对表达量均较刺激24 h后的明显升高(P＜0.05).结论 尼古丁可能通过上调大鼠气道平滑肌细胞膜瞬时受体电位通道TRPC1和TPRC6的表达而导致大鼠气道平滑肌细胞内基础钙离子浓度增加.
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物理损伤与基质细胞衍生因子-1α对大鼠心肌细胞增殖和细胞因子表达的影响
目的 探索物理损伤与基质细胞衍生因子1α(stromal cell-derived factor-1α,SDF-1α)对大鼠心肌细胞增殖和细胞因子表达的影响.方法 培养大鼠心肌细胞,采用刮伤法建立物理损伤模型,添加80 μg/L SDF-1α进行联合培养；BrdU法检测各组心肌细胞的增殖能力；碘化丙啶(PI)染色联合流式细胞仪检测各组心肌细胞周期变化；免疫细胞化学法和Western印迹方法检测心肌细胞白细胞介素1α(IL-1α)、白细胞介素6(IL-6)和转化生长因子β1 (TGF-β1)的表达情况.结果 SDF-1α可提高物理损伤下心肌细胞的增殖能力,同时增加细胞周期中S期所占比例；物理损伤可增加心肌细胞IL-1α(1比2.53±0.54)、IL-6(1比1.47±0.12)和TGF-β1(1比1.36±0.09)的表达,物理损伤联合SDF-1α培养组心肌细胞IL-1α和IL-6的蛋白表达量有所增加(1比1.47±0.13,1比1.54±0.17)、TGF-β1的表达却略有下降(1比0.66±0.13).结论 SDF-1α可能通过上调细胞周期中S期所占比例,促进心肌细胞增殖,并可增加物理损伤引起的促炎作用.
关键词： 肌细胞 心脏 趋化因子CXCL12 白细胞介素类 -
JP2敲减抑制H9c2心肌细胞Caveolin-1膜蛋白的表达
目的 探讨JP2敲减对H9c2心肌细胞Caveolin-1表达的影响.方法 构建靶向大鼠JP2基因的siRNA重组腺病毒载体(Ad-JP2-siRNA)和对照腺病毒载体(Ad-NC-siRNA),分别感染H9c2细胞.Real-Time PCR检测各组细胞JP2 mRNA水平,Western blotting结合表面生物素检测JP2蛋白和Caveolin-1总蛋白及膜蛋白的表达,免疫细胞化学检测Caveolin-1在H9c2细胞中的亚细胞定位.结果 与control组相比,转染Ad-JP2-siRNA 48 h后H9c2细胞中JP2 mRNA(1.000±0.000 vs 0.2939±0.0796,P<0.05)及蛋白(0.806±0.144 vs 0.233±0.101,P<0.05)的表达水平显著下降.Caveolin-1总蛋白表达水平无显著改变(1.797±0.082 vs 1.157±0.134,P>0.05),膜蛋白表达显著降低(1.156±0.132 vs 0.196±0.059,P<0.05).Caveolin-1主要分布于H9c2细胞膜,与转染Ad-JP2-siRNA细胞比较,Caveolin-1的膜分布明显减弱.结论 敲减JP2抑制H9c2细胞Caveolin-1蛋白表达.
关键词： 肌细胞 心脏 膜蛋白质类 Junctophilin2 腺病毒 -
磁性分离法培养小鼠肺动脉平滑肌细胞
目的 建立磁性分离法培养小鼠肺动脉平滑肌细胞的方法.方法 成年C57BL/6J小鼠无菌条件下自右心室注入含铁粉的琼脂糖后,取肺组织并切碎,胶原酶消化,然后用磁铁通过磁力吸引分离含铁粉的肺动脉并进行肺动脉平滑肌细胞原代培养,待细胞融合80％以上进行传代.显微镜下观察培养的肺动脉平滑肌细胞并进行免疫荧光染色鉴定.结果 原代培养1d,显微镜下观察可见含铁的小血管碎片漂浮.培养3d后可见长梭形细胞从含铁小血管周围爬出.培养7～10d后可见细胞形态表现为长梭形、放射状,血管平滑肌细胞呈“峰-谷”状生长.免疫荧光染色显示培养的肺动脉平滑肌细胞平滑肌肌球蛋白重链阳性、平滑肌细胞特异性蛋白smoothelin阳性.结论 磁性分离法可以成功获得小鼠肺动脉平滑肌细胞,尤其是远端肺动脉平滑肌细胞.
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腺相关病毒介导血小板源性生长因子-B基因转染心肌细胞的研究
目的 探讨9型腺相关病毒介导血小板源性生长因子-B(PDGF-B)基因转染修饰大鼠心肌细胞的可行性、安全性及其抗凋亡功能.方法 将携带PDGF-B基因的9型腺相关病毒(rAAV9-PDGF-B)转染大鼠心肌细胞(H9C2),收集经转染后不同时间点(1、3、5、14、21、28 d)心肌细胞,提取蛋白质进行Western印迹测定,观察PDGF-B表达情况.细胞免疫荧光法检测rAAV9的转染效率,AlamarBlue法对rAAV9-PDGF-B转染心肌细胞进行安全性评估,并通过双氧水(H2O2)诱导凋亡,检测高表达PDGF-B的心肌细胞的凋亡相关蛋白及Tunel阳性率.结果 rAAV9-PDGF-B转染心肌细胞后第3天开始,PDGF-B表达上调,随后表达逐渐增强,到第5天蛋白持续平稳表达,持续表达至28 d.转染后第5天,表达PDGF-B的心肌细胞约为78.6％.不同时间点的心肌细胞的还原比率均接近于1.0.双氧水诱导凋亡后,可下调高表达PDGF-B心肌细胞的Bax及Tunel阳性率,同时上调Bcl-2及P-Akt的表达,与PDGF-B蛋白抗凋亡组相比差异无统计学意义(P＞0.05).结论 rAAV9-PDGF-B能成功转染大鼠心肌细胞,使心肌细胞持续高表达PDGF-B达28 d以上,对心肌细胞无明显不良反应.高表达PDGF-B的心肌细胞同样具有抗凋亡的功能.
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三种方法培养大鼠结肠平滑肌细胞的比较
目的 比较3种不同方法培养大鼠结肠平滑肌细胞(CSMC)的生长情况.方法 分离大鼠末端结肠,剥离浆膜层和黏膜层获得平滑肌组织层,将平滑肌组织层剪成小块,采用3种不同方法原代培养大鼠CSMC:(1)贴壁法:将组织块直接接种于培养瓶中.(2)酶解法①:使用0.1％Ⅱ型胶原酶和0.01％大豆胰蛋白酶抑制剂消化组织块2次,然后接种于培养瓶中.(3)酶解法②:使用0.25％胰蛋白酶消化组织块,然后用0.1％Ⅱ型胶原酶和0.01％大豆胰蛋白酶抑制剂消化2次,接种于培养瓶中.按上述3种方法进行大鼠CSMC的原代培养,待细胞长成致密单层后进行传代,观察细胞生长情况并进行免疫荧光检测鉴定细胞类型.结果 贴壁法培养6d可以见细胞从组织块周围游出,但由于细胞数少无法进行传代;酶解法①培养36 h可见少量细胞贴壁,培养15～20 d可以进行传代;酶解法②培养36 h可见较多细胞贴壁生长,培养l0d可以进行传代.酶解法①和酶解法②培养的细胞传代后,细胞形态和生长速度无明显区别.免疫荧光检测显示,3种方法培养的细胞均为α-平滑肌肌动蛋白阳性,90％以上为CSMC.结论 3种培养方法均可得到急性分离的大鼠CSMC,在细胞质量方面无明显差别,实验中可根据具体情况选用不同的培养方法.
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低频脉冲电磁场对C2C12细胞增殖过程中Pax7表达的影响
目的：探讨低频脉冲电磁场（PEMF）在肌卫星细胞C2C12增殖过程中对Pax7表达与合成的影响作用。方法培养C2C12细胞，将传代培养好的细胞分为对照组，0.5 mT磁场组，1.0 mT磁场组，1.5 mT磁场组4组，进行连续5 d内培养，同时分别于第1、2、3、4、5 d内细胞送检，用免疫化学染色法检测细胞表型的变化、用PCR、Western印迹检测细胞中Pax7的表达和合成水平。结果与对照组（0.45±0.07）相比较，不同强度低频脉冲电磁场能够诱导肌卫星细胞C2C12系体外细胞培养增殖过程中Pax7的表达，其中第4 d 0.5 mT组表达Pax7 mRNA（8.51±0.16）强，P<0.05，差异有统计学意义。结论在一定的条件下，不同强度低频脉冲电磁场在肌卫星细胞C2C12系体外细胞培养增殖过程中对Pax7 mRNA的表达有诱导促进作用，进而参与肌卫星细胞增殖分化过程。
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两种酶消化法培养小鼠气道平滑肌细胞的比较
目的 比较两种酶消化法原代培养小鼠气道平滑肌细胞(ASMC)的生长情况.方法取SPF级雄性昆明小鼠10只,处死后分离气管组织,分别采用Ⅰ型胶原酶消化法(单酶消化法)和链霉蛋白酶+Ⅰ型胶原酶消化法(双酶消化法)原代培养ASMC.倒置显微镜下观察细胞形态,免疫荧光鉴定细胞类型.结果单酶消化法培养2~3 d可见少量细胞贴壁伸展,15 d左右可进行传代.双酶消化法培养2~3d可见较多细胞贴壁伸展,7~9d可进行传代.免疫荧光检测显示,胞质中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)呈红色阳性反应,两种方法所培养的细胞95%以上为ASMC.结论两种方法均可获得高纯度的ASMC,在细胞质量方面无明显差异.单酶消化法操作简便,但细胞培养周期较长,双酶消化法细胞生长较快但操作相对复杂.
