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SARS灭活试验疫苗免疫小鼠后CD4+与CD8+T细胞动态变化
以甲醛灭活SARS冠状病毒F69株,分别与福氏佐剂、氢氧化铝、CpG佐剂配伍,制备灭活疫苗,免疫实验动物.SPF级BALB/c小鼠,雌雄各半,随机分为高、中、低3个剂量组;初次免疫时,疫苗接种体积分别为0.3ml、0.2ml和0.1ml,腹腔/皮下接种小鼠;14 d后进行第2次免疫,免疫剂量减半.2次免疫10 d后,以不含佐剂的疫苗进行加强免疫.初次免疫后第4、8、12、19、26、34天,各组小鼠取3只断尾取血,肝素抗凝,流式细胞仪分析CD4+、CD8+ T细胞百分比.
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类风湿关节炎患者淋巴细胞协同刺激分子和活化标志的表达及意义
类风湿关节炎(RA)是以多关节滑膜慢性炎症导致滑膜成纤维母细胞增生、大量淋巴细胞、巨噬细胞、浆细胞浸润为特征的一种常见自身免疫性疾病.研究发现,淋巴细胞活性及其信息传递异常[1]与RA的发生密切相关.我们采用流式细胞仪分析RA患者外周血和关节滑膜液淋巴细胞协同刺激分子CD28/B7(CD80或CD86)、CD154(CD40L)/ CD40和淋巴细胞活化标志CD25、人白细胞DR抗原(HLA-DR)的表达,以探讨这些指标在RA诊断和治疗中的应用价值.
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胆固醇对兔胆管成纤维细胞增生的影响
目的:研究胆固醇(CL)对兔胆管成纤维细胞增生的影响,并对其机制进行探讨.方法:分离、纯化、培养兔胆管成纤维细胞,完全随机分为两组:对照组、中等浓度胆固醇组(0.6 g/L)和高浓度胆固醇组(1.2g/L).以MTT法测定各组细胞的增生情况、并以流式细胞仪(FCM)测定细胞周期.进而采用免疫组化法定量分析各组细胞内增生细胞核抗原(PCNA)的表达情况.结果:中等浓度CL(0.4~0.8 g/L)可以使培养的兔胆管成纤维细胞MTT A490nm值显著升高,L(0.4 g/L)A490nm值为0.422±0.015,较对照组增加51.4%(P<0.05);CL(0.6 g/L)A490nm值达到大为0.486±0.019,较对照组增加95.2%(P<0.01);0.8g/LCL组A490nm值为0.472±0.017较对照组增加89.6%(P<0.01);高浓度CL(1.2 g/L)明显抑制细胞生长,490nm值为0.163±0.018,较对照组下降34.5%(P<0.05).流式细胞仪分析显示,与正常组相比,中等浓度CL(0.6 g/L)显著增加G2/M期细胞比例,从9.8%上升为13.0%,期细胞比例从11.7%上升为33.4%,而显著减少进入G0/G1期的细胞比例,从78.5%下降为53 6%高浓度CL(1.2 g/L)显著减少G2/M期细胞比例,从9.8%降低为6.7%,期细胞比例从11.7%下降为5.9%,而显著增加进入G0/G1期的细胞比例,从78.5%上升为87.4%,使更多的胆管成纤维细胞处于相对静止期.PCNA免疫组织化学实验表明,对照组胆管成纤维细胞的PCNA染色,核内无明显的阳性反应颗粒,染色强度为88.3±11.6%AU;0.6 g/L CL组胆管成纤维细胞的PCNA染色强阳性,染色强度为126.3±10.2%AU(P<0.05,vs 对照组),可见胞核内呈现棕褐色颗粒;1.2g/LCL可使胆管成纤维细胞核内棕褐色颗粒显著减少,染色强度为96.3±11.4%AU(P<0.05,s中浓度CL组)结论:中等浓度胆固醇促进兔胆管成纤维细胞增生,其机制可能与细胞内PCNA的表达有关.
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来源于人胎肝干细胞的肝癌细胞系建立及初步研究
目的:研究肝癌细胞发生发展及变化规律,探讨胎肝干细胞体外长期培养的变异归宿问题.方法:原代分离培养人胎肝干细胞,从中筛选出一生长旺盛之集落,体外长期培养,并对其生物学特性进行初步鉴定.进行了细胞倍体分析;应用流式细胞仪分析了细胞周期;在Scid鼠体内接种细胞进行成瘤性验证.结果:从人胎肝组织中成功分离出一胎肝干细胞集落,在体外长期培养下可分化为肝癌细胞.其细胞增值核抗原指数高达100%;倍体分析常见多倍体细胞;流式细胞仪分析细胞周期,结果G1期细胞约占48%,G2期细胞约占18%,S期细胞约占34%.Scid鼠体内成瘤实验显示,接种细胞后2-3 wk成瘤,具有100%的成瘤性.显微镜下所见细胞大小不一,异型性明显,核仁大,核分裂活跃.结论:人胎肝中存在具有干细胞特性的原始细胞,确实可分化为肝癌细胞.从人胎肝干细胞中分离培养出肝癌细胞对于肝癌发生发展及其变化规律的深入研究奠定了基础.
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腺病毒增强转铁蛋白受体介导的针对突变型P53的大酶转染可促进肝癌细胞凋亡
目的:通过腺病毒增强的转铁蛋白受体介导法(AVET)将针对突变型p53(mtp53)的大酶(Maxizyme)基因转入肝癌细胞后篌对肝癌细胞凋亡的影响,探索AVET用于肝癌基因治疗的可行性,为肝癌的基因治疗探索一条新途径.方法:以带有mtp53基因的人肝癌细胞株MHCC97细胞为模型,用腺病毒增强转铁蛋白受体介导法将针对mtp53的pEGFP-Maxizyme基因和空载体pEGFP分别导入MHCC97细胞,荧光显微镜观察细胞转染情况,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测mtp53 mRNA表达水平的变化,DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测转染后对细胞凋亡的影响.结果:转染后48h荧光显微镜下可见呈细胞形态的绿色荧光.收集细胞检测,实验组mtp53 mRNA表达水平与空载体组和空白对照组相比,基因扩增条带亮度明显减弱,mRNA表达水平下降(P<0.05);DNA琼脂糖凝胶电泳出现典型的凋亡梯带(DNA Ladder);流式细胞仪分析显示细胞凋亡水平增高,凋亡指数22.95%,显著高于对照组的2.37%(P<0.05).结论:腺病毒增强转铁蛋白受体介导的基因转移系统可将pEGFP-Maxizyme有效的转染到肝癌细胞株MHCC97中,Maxizyme在细胞内成功的切割了mtp53 mRNA,促进了肝癌细胞的凋亡,这为腺病毒增强转铁蛋白受体介导法在肝癌基因治疗中的应用提供了实验依据,也为肝癌的基因治疗提供了一条新途径.
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裸鼠肝内种植人肝癌组织的肿瘤特征
目的:观察裸鼠肝内种植人肝癌组织能否再现肿瘤特征,为在活体内研究肝癌的生物学特性,指导临床个体化治疗提供一种研究方式.方法:用组织学完整的新鲜人肝癌组织种植于裸鼠肝脏,观察种植瘤的存活率、生长曲线、组织细胞病理特征、转移情况以及肝癌的其他生物学特征,并与皮下、皮下-肝原位种植瘤模型比较.结果:来源于l例患者肝癌组织的第一代种植瘤存活率100%,自发性肝内转移75.0%,肺转移37.5%,骨转移37.5%;并保持分泌AFP的特性;流式细胞仪分析DI值为1.63.组织细胞病理、器官转移特征以及其他生物学特性与原肝癌相似.结论人肝癌组织裸鼠原位种植瘤的生物学特征与肝癌患者基本相似,基本模拟了人肝癌的自然过程,是目前体内研究人肝癌生物学特征、筛选有针对性敏感化疗药的较理想方法.
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鸦胆子油乳诱导肝癌细胞凋亡及对相关基因表达的影响
目的:研究鸦胆子油乳体外诱导人肝癌细胞SMMC-772l凋亡的作用及对细胞周期和凋亡相关基因p53和Bcl-2表达的影响,探讨其抗肿瘤机制.方法:MTT法检测鸦胆子油乳不同浓度和作用时间对肝癌细胞的抑制增生作用;透射电镜观察细胞形态学改变;琼脂糖凝胶电泳分析DNA特征;流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期分布;免疫细胞化学染色检测p53和Bcl-2的表达.结果:鸦胆子油乳对人肝癌细胞SMMC-772l具有显著的抑制增生作用,且有时间和浓度依赖性.透射电镜和凝胶电泳可观察到凋亡特征性的形态学和生化特征改变.0.10 g/L鸦胆子油乳作用12,24,48 h后,流式细胞仪分析可见典型的亚二倍体峰,细胞周期阻滞于G0/G1期,与对照组相比有显著性差异(P<0.05).p53和Bcl-2在经鸦胆子油乳作用后表达水平均下降,二者呈正相关(r=0.966,P<0.05),p53下降更为明显.结论:鸦胆子油乳体外对肝癌细胞SMMC-7721有显著的抑制增生作用,能诱导凋亡、阻滞细胞周期于G0/G1期,抑制p53和Bcl-2的表达是其重要机制,其中p53途径起主导作用.
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羟基磷灰石纳米粒子诱导人肝癌细胞凋亡模型的构建
目的:建立羟基磷灰石纳米粒子体外诱导人肝癌细胞凋亡的模型,为进一步研究纳米粒子诱导肝癌细胞凋亡的分子机制奠定基础.方法:用羟基磷灰石纳米粒子以不同终浓度、不同时间作用于人肝癌BEL-7402细胞,用细胞毒性实验(MTT比色法)观察其细胞毒性,倒置相差显微镜、荧光显微镜、透射电镜、DNA琼脂糖凝胶电泳等方法观察凋亡在形态学和生化方面的变化.流式细胞仪分析以进一步了解凋亡发生的时间和程度.结果:羟基磷灰石纳米粒子以剂量依赖和时间依赖的方式抑制BEL-7402细胞的生长.50-200mg/L的纳米粒子处理48h后,形态学上,肝癌细胞表现为细胞皱缩、核质浓缩、核碎裂、细胞起泡以及凋亡小体形成等凋亡特征.琼脂糖凝胶电泳观察到DNA"梯带".流式细胞仪定量分析,0,50、75、100、150、200mg/L浓度下凋亡率分别为2.2%,20.3%,25.3%,29.8%,45.1%和53.1%.50 mg/L作用12h后肝癌细胞出现凋亡,48h达高峰,12,24,36,48h细胞凋亡率分别为2.7%,3.5%,6.3%和21.4%.结论:羟基磷灰石纳米粒子既能抑制人肝癌BEL-7402细胞增生,又能诱导其凋亡,该凋亡模型的成功建立将有助于进一步探讨纳米粒子诱导肝癌细胞凋亡的分子机制.
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BAK基因过表达对胃癌细胞的诱导凋亡作用及其分子机制
目的:探讨转染外源性BAK基因及其过表达对胃癌细胞的诱导凋亡作用和分子机制.方法:构建携带有BAK基因的真核表达载体并转染胃癌MKN-45细胞1-5d后,RT-PCR和Western Blotting法检测BAK基因表达;细胞计数、MTT比色法检测癌细胞生长活性,流式细胞仪分析细胞周期时相改变,透射电镜、末端TdT酶标记技术检测癌细胞凋亡;比色法检测癌细胞内Caspase-3活性改变.结果:转染1-5 d后,癌细胞BAK mRNA和蛋白表达水平显著增强(P<0.01),癌细胞体外生长抑制11.6-35.3%(P<0.01),增生活性抑制10.2-32.4%(P<0.01),细胞周期出现G0/G1期阻滞,部分癌细胞出现胞体缩小、核固缩等凋亡形态学改变,凋亡率为21.4%(P<0.01);癌细胞Caspase-3活性增强4.45倍(P<0.01).结论:转染外源性BAK基因使其过表达能激活Caspase-3,显著诱导胃癌MKN-45细胞凋亡,有望成为胃癌治疗的新途径.
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奥曲肽对人胃癌细胞株SGC-7901生长和凋亡的影响
目的:研究生长抑素类似物奥曲肽对人胃癌细胞株SGC-7901生长和凋亡的作用.方法:取人胃癌细胞株SGC-7901,体外培养后以处于对数生长的细胞制成单细胞悬液,加入不同浓度的奥曲肽,以MTT法进行细胞增生试验,并以不含药物的培养液为阴性对照;通过HE染色和电子显微镜观察细胞形态,通过流式细胞仪测定SGC-7901细胞周期和凋亡率.结果:奥曲肽在一定浓度范围内(160-480 mg/L)对sGC-7901细胞的生长具有抑制作用(与对照组比较,均P<0.001),并存在量效关系和饱和性,大抑制率为25.4%(奥曲肽浓度400 mg/L).奥曲肽可诱导SGC-7901细胞凋亡,HE染色见奥曲肽作用48 h,细胞开始出现凋亡的形态学改变,72 h凋亡细胞明显增多,电镜下见有典型的凋亡小体出现.流式细胞仪分析可见Gl峰前出现亚二倍体峰,凋亡率为9.42±5.29%(P<0.05).结论:奥曲肽在体外能抑制人胃癌细胞株SGC-7901细胞的生长,其作用与诱导肿瘤细胞凋亡有关.
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槐耳清膏诱导人肺腺癌细胞A549凋亡的实验研究
槐耳清膏是药用真菌槐耳菌质的热水提取物,临床上证实有一定的抗癌效果。为进一步探讨其抗癌机制,我们研究了槐耳清膏在体外诱导人肺腺癌细胞系A549凋亡的作用。 材料与方法引进并培养人肺腺癌细胞系A549细胞株。制备不同浓度的槐耳清膏PRMI-1640含药培养液与接种成功、呈对数生长的A549细胞共同培养24 h后,每6 h进行以下观察及测定(设阳性对照组羟基喜树碱100 μg/ml,共同孵育10~12 h后进行测定)[1]。(1)荧光染色:收集培养细胞,清洗并均匀涂片自然风干24 h,置于0.05 mg/L的Hoechst33258及0.1 mg/L的硫柳汞的无钙、镁的磷酸缓冲染色液中作用40 min,封片后荧光显微镜下观察、拍照、计数;(2)电子显微镜观察:同上收集细胞6×106,磷酸缓冲液(PBS)清洗,戊二醛固定,再经锇酸染色、缩水包埋、切片后透射电子显微镜观察照相记录;(3)流式细胞仪分析:同法收集、清洗、固定细胞2×106,离心后加入100 μl磷酸二氢钠/柠檬酸缓冲液室温震荡30 min,在离心的细胞中加入含100 mg/L 核糖核酸酶A(Rnase A)和25 mg/L 碘化丙啶(PI)的染色液1 ml在暗处4℃染色3 h,用FACSort流式细胞仪分析细胞周期。实验数据通过SPSS For Windows软件进行统计学分析。
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重组诱导型一氧化氮合酶在V79细胞中的表达及其对血管平滑肌细胞增殖的影响
目的探讨成纤维细胞基因转染后产生的一氧化氮对血管平滑肌细胞增殖的影响.方法将诱导型一氧化氮合酶基因通过真核表达载体转入V79成纤维细胞中,用Griess法测定转染细胞生成的一氧化氮的量.将含有一氧化氮的细胞转染上清液加到培养的血管平滑肌细胞中,观察对平滑肌细胞生长状态的影响,用流式细胞仪分析细胞周期的变化.
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重组人诱导型一氧化氮合酶转染平滑肌细胞及对其增殖的影响
目的探讨血管平滑肌细胞基因转染后对血管平滑肌细胞增殖的影响.方法将诱导型一氧化氮合酶基因通过真核表达载体转入血管平滑肌细胞中,用Griess法测定转染细胞生成的一氧化氮的量;观察对平滑肌细胞生长状态的影响,用流式细胞仪分析细胞周期的变化.
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烧伤前后大鼠血清对骨髓基质细胞生物学行为的影响
目的:观察烧伤前后大鼠血清对体外培养的大鼠骨髓基质细胞的生物学行为的影响,为骨髓基质细胞在创伤修复中的应用奠定实验基础.方法:取Wistar大鼠,处死分离骨髓,原代培养骨髓基质细胞,传代后分别用含有10%胎牛血清、正常大鼠血清、烧伤后3d大鼠血清和烧伤后14d大鼠血清的F-12培养基培养,用MTT法测定其生长曲线,PI染色,流式细胞仪分析细胞周期、DNA含量和细胞凋亡率.结果:用含有10%大鼠血清的F-12培养基传代培养的细胞生长曲线相似,但与含有FCS的F-12培养基传代培养的明显不同.前者倍增时间缩短,N组、B1组、B2组细胞群体倍增时间分别为23.7h、18.6h、20.2h.平台期所能达到的细胞总数明显增加.烧伤后大鼠血清处理过的细胞中G0/G1期细胞比例明显低于其它两组,而S期细胞的比例则相反.正常大鼠血清处理过的细胞中G2+M期细胞的比例则比其它组明显升高.大鼠血清处理过的细胞中DNA含量明显高于胎牛血清培养的细胞,而烧伤后的大鼠血清处理过的细胞中DNA含量则明显高于正常大鼠血清处理过的细胞.而烧伤后3d的大鼠血清处理过的细胞的凋亡率比其它组细胞明显升高.结论:大鼠血清比胎牛血清能更好地促进大鼠体外培养的骨髓基质细胞生长;烧伤大鼠血清内可能含有多种能影响骨髓基质细胞生长的物质,且其含量随烧伤的时间改变而变化,对骨髓基质细胞生长的影响是复杂的.
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用流式细胞仪分析两例同胞脐血移植后的早期免疫重建
脐血造血干细胞移植(CBT)作为临床治疗的一个手段,已成功地治疗了一些遗传缺陷性疾病、白血病、恶性实体肿瘤等疾病.2001年5月~2002年5月,我们利用流式细胞仪,对2例急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿同胞脐血移植后3个月内免疫重建的过程进行了研究,现报道如下.
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哮喘儿童外周血淋巴细胞白细胞分化抗原23及19表达的研究
2001年4月~2002年3月我们运用流式细胞仪分析技术,检测儿童哮喘发作期及缓解期外周血白细胞分化抗原(CD)+23、CD+19、CD+23CD+19淋巴细胞的表达,以探讨其变化及相互关系.
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乙醇诱导胃上皮癌细胞株(BGC-823)细胞凋亡
在整体动物和离体培养细胞,乙醇都可引起胃粘膜组织细胞损伤.但乙醇是否引起胃粘膜细胞发生凋亡,其在胃粘膜损伤中的作用如何,目前尚不清楚.本研究用257~686 mmol/L的乙醇(主要为343 mmol/L)作用于离体培养的胃上皮癌细胞株(BGC-823), 在不同时间作Giemsa染色, DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪分析.
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粘附分子和中性粒细胞在烧伤早期心脏和肝脏损害中的作用
本项目研究的目的主要是探讨严重烧伤早期粘附分子和中性粒细胞在心脏和肝脏损害中的作用,进一步阐明烧伤后脏器损害的发病机制,特别是粘附分子和中性粒细胞在其中的关键作用,为烧伤后脏器损害的防治提供理论依据.项目采用多种现代化实验技术,如RT-PCR、原位杂交、流式细胞仪分析、激光共聚焦荧光显微镜、微管吸吮技术、免疫组化技术、细胞培养和细胞-ELISA等技术,从脏器、细胞及分子水平多层次的进行了研究,主要结果如下:
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MDS-RA患者外周血活化T细胞水平检测
骨髓增生异常综合征(MDS)是造血干细胞异常所致的恶性克隆性疾病,目前关于MDS异常造血和活化T细胞关系的研究甚少。为此,我们利用流式细胞仪双标记技术,检测18例MDS- RA患者外周血活化T细胞的水平,以探讨细胞免疫功能异常对造血的影响。对象和方法1 研究对象 MDS-RA患者18例,男12例,女6例,年龄9~58岁,中位年龄31岁,均符合MDS的诊断标准[1]。所有患者均为初治,2周内无感染、发热,亦未曾输过血,未用过细胞因子。正常对照12名,年龄20~42岁,中位年龄33.5岁。2 实验方法采用直接免疫法,取6个试管,分别向管中加入无关对照单抗和实验单抗CD3、 CD4CD25、CD8CD25、CD4HLA-DR、CD8HLA-DR各20?μl,CD3、CD 4、CD8(购于美国BD公司)标记FITC荧光素, CD25、HLA-DR(购于美国BD公司)标记PE荧光素。再加入肝素抗凝全血100?μl,孵育后加溶血剂,离心、洗涤、固定后上机检测。用流式细胞仪分析淋巴细胞,计算出标记CD4CD25、CD8CD25、CD 4HLA-DR、CD8HLA-DR的双阳性细胞百分率。3 血红蛋白的测定采用高铁氰化钾法。4 统计学处理采用两样本均数t检验及两组数据间相关性分析的显著性检验。结果1 MDS-RA患者外周血活化T细胞标志抗原表达 18例MDS-RA患者CD4+CD25+双阳性细胞表达略高于正常对照,差异无显著性(P>0.05);CD8+CD 25+双阳性细胞表达明显高于正常对照(P<0.05)。CD4+HLA-DR +双阳性细胞表达略高于正常对照,差异无显著性(P>0.05);CD8 +HLA-DR+双阳性细胞表达明显高于正常对照(P<0.05)(表1)。表1 MDS组与正常对照组活化T细胞水平比较(%,眘?
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Flt3配体诱导急性淋巴细胞白血病来源树突细胞及其功能的研究
树突细胞(DC)是迄今为止已知功能强的抗原呈递细胞(APC),白血病细胞来源的DC因能表达与异常染色体相关的白血病抗原,产生特异性的抗白血病细胞毒性T淋巴细胞(CTL)效应而成为新型的DC来源[1].fms样酪氨酸激酶3配体(Flt3-L)具有强大的刺激多能造血干细胞增殖的能力,是又一新兴的解决骨髓造血功能衰竭状态和肿瘤生物治疗的生长因子[2].我们收集急性淋巴细胞白血病(ALL)初治及复发患者骨髓单个核细胞(MNC),采用Flt3-L单因子培养,并分别加用TNF-o和IFN-α活化,通过流式细胞仪分析其表型特点,并行染色体检查DC的遗传学特征,检测健康供者T细胞DC激发活化T细胞能力.