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当前临床流式细胞分析的发展趋势
流式细胞分析,又称流式细胞术(Flow cytometry,FCM),是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒,测量其产生的散射光和发射荧光的强度,从而对细胞(或微粒)的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术,它具有如下几个特点:①标本只要是单细胞即可用于分析,如血液、骨髓、体液中的细胞、培养细胞等,实体组织只要经处理后制成单细胞悬液也能分析,因此,实际上所有组织细胞均可用于分析.②极短时间内可分析大量细胞,只要标本中的细胞数量足够,流式细胞仪(Flow cytometer)可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量,测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个.③可同时分析单个细胞的多种特征,当同时用多种分子探针,如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色,通过流式细胞分析,即可获得单细胞的多种信息,使细胞亚群的识别、计数更为准确.④定性或定量分析细胞:通过荧光染色对单细胞的某些成分如DNA含量、抗原或受体表达量、Ca2+浓度等均可进行单细胞水平的定性与定量分析.
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奥曲肽对人胃癌细胞株SGC-7901生长和凋亡的影响
目的:研究生长抑素类似物奥曲肽对人胃癌细胞株SGC-7901生长和凋亡的作用.方法:取人胃癌细胞株SGC-7901,体外培养后以处于对数生长的细胞制成单细胞悬液,加入不同浓度的奥曲肽,以MTT法进行细胞增生试验,并以不含药物的培养液为阴性对照;通过HE染色和电子显微镜观察细胞形态,通过流式细胞仪测定SGC-7901细胞周期和凋亡率.结果:奥曲肽在一定浓度范围内(160-480 mg/L)对sGC-7901细胞的生长具有抑制作用(与对照组比较,均P<0.001),并存在量效关系和饱和性,大抑制率为25.4%(奥曲肽浓度400 mg/L).奥曲肽可诱导SGC-7901细胞凋亡,HE染色见奥曲肽作用48 h,细胞开始出现凋亡的形态学改变,72 h凋亡细胞明显增多,电镜下见有典型的凋亡小体出现.流式细胞仪分析可见Gl峰前出现亚二倍体峰,凋亡率为9.42±5.29%(P<0.05).结论:奥曲肽在体外能抑制人胃癌细胞株SGC-7901细胞的生长,其作用与诱导肿瘤细胞凋亡有关.
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人尿道高分化鳞癌细胞系HUS-98的建立
我们从人尿道鳞癌患者转移性腹水中提取肿瘤细胞培养,3周开始传代,至今稳定培养15个月,已传120代,细胞系定名HUS-98.现就该细胞系的建立及其生物学特性报告如下.材料和方法 (1)肿瘤来源于一男性45岁患者.于1998年6月4日行尿道瘘手术,病理结果为尿道高分化鳞状上皮癌.第一次术后5个月肿瘤转移至腹腔.抽取腹水进行细胞培养.(2)实验动物为无特定病原体级裸小鼠,引种于中山医科大学动物中心,3批18只,7周龄,体重18~22 g,雌雄各半,分开饲养.(3)试剂:生长培养液RPMI 1640,消化液为0.25%胰蛋白酶、0.68mmol/L EDTA.(4)建系过程:取患者腹水,收集细胞接种于50 ml玻璃瓶常规培养,1周后开始1/2换液,第12代后每隔2~3 d传代1次,分种率为1∶2.(5)细胞生物学检测:光镜下观察活细胞形态结构及生长特点.取第108代,常规制作超薄切片,用日立H-600透射电镜观察细胞结构.取第116代单细胞悬液,按Patterson方法及文献方法计算细胞群体倍增时间及细胞贴壁率[1].染色体分析取第40、60、80代细胞,常规方法收集细胞制片及G带染色.异种接种取第68、108、120代单细胞悬液0.5×作者单位:510010 广州军区广州总医院肿瘤分子生物学研究所1010/L接种于6只裸鼠左腋皮下,每只注射0.3 ml.PCR方法定性检测第107代细胞的人乳头瘤病毒,单纯疱疹病毒,巨细胞病毒及乙型肝炎病毒.取第51代细胞裂解液,RIA法检测人类肿瘤相关抗原CEA、AFP.
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人脑胶质瘤干细胞的分离培养及初步鉴定的实验研究
一、材料与方法取10例胶质瘤患者术中切除的肿瘤组织,分离成单细胞悬液,接种于添加生长因子(EGF、bFGF、LIF等)的DMEM/F12无血清培养基中,观察各种细胞的生长增殖情况,对照组取3例同期癫痫患者(非脑肿瘤)手术切除病灶,做相同处理,对增殖形成的克隆球连续传代培养,部分克隆球细胞分散后做单克隆培养;
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低剂量辐射诱导蛋白对紫外线、电离辐射细胞损伤的保护作用
本研究通过直接提取低剂量辐射(LDR)诱导蛋白并观察其对紫外线、电离辐射所造成细胞损伤的保护作用。 一、实验方法 昆明小鼠随机分成非照射组和照射组,分别在20℃~24℃条件下接受0 cGy及10 cGy的γ射线照射,照射后2 h颈椎脱臼致死,无菌条件下取出脾脏,制成单细胞悬液,加蒸馏水以溶解红细胞,离心后按每6×107脾细胞2 ml比例加入含PMSF 4℃0.01 mol/L PBS,在冰浴下超声破碎脾脏细胞,破碎液在高速冷冻离心机上离心,上清液即为小鼠脾脏细胞蛋白提取液及含有LDR诱导蛋白的提取液,4℃冷藏待用。 取小鼠新鲜脾脏,制成RPMI 1640单细胞悬液,培养瓶培养细胞,各培养瓶装含10%小牛血清之RPMI 1640培养基2 ml,脾细胞悬液0.2 ml(脾细胞2×106个),接受UV(照射2 min,实测紫外线辐照强度为460 μW/cm2)或电离辐射损害(4 Gy)后分3组培养,分别加0.01 mol/L PBS、小鼠脾脏细胞蛋白提取液及含有LDR诱导蛋白的提取液0.1 ml,加3H-TdR20 μl,培养6 h、细胞收获、制膜后测放射线强度。
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流式细胞术检测小鼠主动脉组织中炎性反应细胞浸润的方法研究
目的:应用剪碎和混合酶消化法,建立一种有效的用于流式细胞术分析的小鼠血管组织单细胞悬液,用于检测血管紧张素Ⅱ刺激引起的血管组织中炎性细胞的浸润。方法采用皮下微量泵持续泵入血管紧张素Ⅱ(1000 ng·kg-1·min-1),于灌注3 d后将小鼠麻醉后立即处死,取出胸主动脉和腹主动脉,迅速剪碎,用混合酶消化小鼠血管组织,制备单细胞悬液,用于流式细胞技术检测。结果每只小鼠血管组织分离细胞数可达5×105个/mL;光镜下单细胞悬液细胞完整透明,分散排列,状态良好;流式细胞术检测显示血管紧张素Ⅱ处理后明显增加了血管组织中中性粒细胞、T淋巴细胞和巨噬细胞的数量。结论应用剪碎和混合酶联合消化法制备小鼠血管组织单细胞悬液简便可行,为血管炎性细胞浸润的研究提供了有效的组织单细胞悬液制备方法。
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胰腺组织单细胞悬液制备方法的比较研究
目的:寻找更好的胰腺组织单细胞悬液制备方法.方法:以大鼠冷缺血胰腺组织作为标本,分别采用剪碎和研磨法制备胰腺组织悬液.经台盼蓝染色测细胞存活率,并进行流式细胞术分析.结果:剪碎法细胞形态较完整、存活率高;两种方法细胞凋亡水平(APO)、CV值有显著性差异(P <0.01).结论:胰腺组织单细胞悬液制备剪碎法优于研磨法.
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剪碎法及匀浆法制备兔肌肉VX2肿瘤单细胞悬液的方法比较
目的:比较剪碎法和匀浆法制备兔肌肉VX2肿瘤单细胞悬液的效果.方法:实验于2006-10-25/2007-04-01在安徽医科大学第一附属医院中心实验室进行.切取兔肌肉VX2肿瘤组织块,分别采用剪碎法和匀浆法制备兔肌肉VX2肿瘤单细胞悬液.经苏木精-伊红染色,光学显微镜观察细胞形态学差异,并行Annexin V/PI双染法,流式细胞仪分析细胞凋亡率和细胞坏死率的差异.结果:①细胞形态:匀浆法细胞产率高,细胞形态完整,细胞分布均匀,细胞碎片及细胞团较少;而剪碎法所得细胞悬液在光镜视野中有较多的杂质和细胞团,完整的细胞相对较少.②流式细胞仪分析结果:匀浆法制备的单细胞悬液左下象限正常细胞分布较集中,右下象限凋亡细胞较少,左上象限坏死细胞及细胞碎片较少;所得细胞凋亡率和细胞坏死率值明显低于剪碎法[细胞凋亡率:(8.90±1.24)%,(15.75±1.53)%;细胞坏死率(35.22±1.56)%,(40.16±1.68)%,P均<0.01].结论:用匀浆法制备兔肌肉VX2肿瘤单细胞悬液优于剪碎法.
关键词: 单细胞悬液 流式细胞术 Annexin V/PI双染法 VX2肿瘤 -
胸腺增龄性萎缩的机理及其逆转
由第Ⅲ、Ⅳ对咽囊胚层发育而来的胸腺是重要的中枢免疫器官、T细胞分化成熟场所.动物在出生后胸腺的重量均与年龄增长呈负相关[1]. 成年Sprague-Dawley大鼠胸腺结构光镜和电镜观察见坏死和纤维化的区域随年龄增长而逐渐扩大,皮质区域进行性缩小,胸腺细胞体积显著下降,有丝分裂趋于静止[2].M arusic等人应用流式细胞仪分析了39例人体胸腺单细胞悬液样本[3],发现随年龄增长每克胸腺组织中单核细胞总数呈指数级下降,但不同龄的个体胸腺中细胞比例几乎一致 ,说明随年龄变化而退化萎缩的胸腺作为T淋巴细胞分化的场所仍然是重要的免疫器官.
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肝病患者的肝组织单细胞悬液与外周血中淋巴细胞亚群的分析比较
目的探讨肝脏组织单细胞悬液的制备方法,了解慢性肝病患者的肝组织和外周血的淋巴细胞亚群差异.方法分别选择慢性乙型肝炎(CHB)14例、自身免疫性肝炎(AIH)4例和原发性肝细胞癌(HCC)3例,在超声引导下经皮作肝脏穿刺活检,用单细胞制备仪或物理研磨方法将肝组织制备成单细胞悬液,肝组织中淋巴细胞经4种特异性荧光抗体标记,在流式细胞仪(FCM)上作四色荧光分析,并与外周血测定结果比较.结果单细胞制备仪和物理研磨方法制备的肝组织单细胞悬液,细胞成活率分别为92.4%和91.5%;检测肝组织单细胞悬液中淋巴细胞亚群,正常对照组和慢性肝病各组间差异均有显著性(P<0.05),AIH组和CHB组间差异有显著性(P<0.05).而外周血中淋巴细胞亚群检测,HCC组和CHB组间差异有显著性(P<0.05).肝组织和外周血相应项目比较差异均有显著性(P<0.05).结论用2种方法制备单细胞悬液能满足FCM检测的特殊需要;肝脏组织中淋巴细胞与外周血的淋巴细胞亚群比例差异有显著性.
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人胃癌原代细胞的甲硫氨酸依赖性
探索人胃癌和胃粘膜上皮原代细胞在体外不含甲硫氨酸(Met)而含同型半胱氨酸(Hcy)培养基(Met- Hcy+)中能否正常生长及是否存在Met依赖性.将新鲜人胃癌肿瘤组织及胃粘膜组织制成单细胞悬液,分别置于Met-Hcy+和Met+Hcy-培养基中培养,利用细胞计数和流式细胞仪检测各组细胞增殖状态.
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人胚中脑神经干细胞的体外分离培养及分化的研究
本文对人胚中脑神经干细胞体外分离培养及分化进行了初步研究,以期为神经干细胞临床应用提供实验依据.材料和方法一、原代中脑神经干细胞的分离培养:取胚龄10~13周水囊引产的新鲜人胚胎,在显微镜下无菌分离出胚胎中脑组织,剥除脑膜及表面血管,在PBS液中漂洗三次,用细吸管反复吹打组织碎块至完全散开,离心洗涤后吹打制成细胞悬液,经100目不锈钢滤网过滤,制成单细胞悬液,加入含B27(1∶50)(GibcoBRL)和EGF(Serotec.)20 ng/ml、bFGF(Chemicon)20 ng/ml的DMEM/F12(1∶1)(GibcoBRL)无血清培养基,台盼蓝染色计数活细胞,调整活细胞浓度为1×105/ml,将原代细胞种植于25平方厘米培养瓶(8 ml细胞悬液/瓶),37℃,5%CO2条件下静置培养.
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大鼠肺组织单细胞悬液制备方法的研究
流式细胞术(flow cytometry, FCM)中细胞的分析检测均以单个细胞为基础,而各种单细胞悬液的制备是其中的关键环节,若细胞数量不足、细胞粘连成块、样品中杂质碎片过多均可造成分析失败[1-5].本实验采用胰酶消化法和研磨法制备新鲜大鼠肺实体组织单细胞悬液,通过细胞活力测定、FCM检测分析比较两种方法优劣.
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实体组织单细胞悬液制备方法
在实际工作中由于机器操作和手工操作均不能保证每张玻片的条件一致,因此到目前为止还没有有效可靠的对照方法,故其标准化问题日益受到大家的重视.我们以新鲜组织和固定组织为标本,探讨实体组织单细胞悬液制作的具体过程,为实现一一对照式原位玻片检测技术寻求一套全面、可靠的技术方法.
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用Medimachine系统制备实体组织的单细胞悬液
流式细胞术(flow cytometry, FCM)作为一种可在单细胞水平上对大量细胞进行快速、准确、多参数定量分析和分选的高技术,在细胞生物学、免疫学、肿瘤学等方面的应用日趋广泛和深入.进行FCM分析的前提是样品为单细胞悬液,而大多数实体组织都难以制成高质量的单细胞悬液样本,因而大大限制了FCM对实体组织特别是实体瘤的分析和研究[1].
关键词: 单细胞悬液 medimachine系统 流式细胞术 -
流式细胞术新鲜实体瘤检测样本的制作
目的 旨在建立一种流式细胞术新鲜实体瘤单细胞悬液检测样本的制作方法.方法 采用剪碎法将新鲜实体瘤组织剪至匀浆状,用自制过滤装置过滤,白细胞计数板显微镜下计数并调单细胞浓度在106以上;取该单细胞悬液做免疫荧光染色,上流式细胞仪检测.结果 流式细胞术检测结果与常规免疫组化检测结果经统计学处理,无显著性差异(P>0.05).结论 剪碎法处理新鲜实体瘤标本能获取满足流式细胞术检测要求的单细胞悬液,可应用于临床病理研究.
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FCM石蜡包埋涎腺粘液表皮样癌细胞DNA含量样品的制备
采用10例涎腺粘液表皮样癌石蜡包埋组织标本,以Hedley报道的方法为基础,进行单细胞悬液样品的制备和流式细胞术检测.经反复实验,每例组织块必须经切片、托蜡、水化、漂洗、消化、离心等过程,具体针对,严格操作.10例涎腺粘液表皮样癌上机测定成功,DNA组方图峰形锐利,CV值小.
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48例陈旧性脊髓损伤嗅鞘细胞移植术后护理
嗅鞘细胞是近年来人们从四个月以上中期引产胚胎的嗅球,进行细胞分离培养成单细胞悬液,能终生产生维持神经存活和轴突延长的神经营养因子及神经突促因子.嗅鞘细胞膜上表达出很多与细胞粘合和轴突生长相关的分子,嗅鞘细胞移植为损伤的神经修复和再生及功能重建提供了良好的内环境.现将2004年6月~2005年7月48例陈旧性脊髓损伤患者进行嗅鞘细胞移植后的护理体会报道如下.
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立体定向建立大鼠C6脑胶质瘤模型
我们采取不同细胞数C6单细胞悬液建立模型,探讨各种接种细胞数量的优劣.一、材料和方法1.材料:雄性Wistar大鼠65只,体重200~250g;大鼠胶质瘤C6细胞系由华中科技大学附属协和医院杨林博士后惠赠.苏木素-伊红(HE)染色试剂、兔抗人C-erbB1蛋白多克隆抗体和S-100B蛋白多克隆抗体及SABC试剂盒购于武汉博士德公司.
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腹腔镜中不同膨腹气体抑制肿瘤细胞生长的体外对比研究
本实验旨在研究CO2、He、N2O等不同膨腹气体在模拟气腹条件下,对肿瘤组织体外生长的影响,结果报道如下。 一、材料与方法 肿瘤细胞为人类肝癌细胞株SMMC7721(购于中国科学院细胞研究所),体外培养于RPMI 164 0完全培养液(含体积分数为10%小牛血清及10万U/L青链霉素)中。传2~3代(至少1周以上)后,以台盼蓝染色后在荧光显微镜下记数,制成5×102个/L的单细胞悬液。悬液分别注入4个( 4组)无菌医用引流袋(带防漏阀)中,用自动气腹仪(Laproflator electronic 3509,WE STGmbH,Germany)自引流袋入口管分别注入CO2、He及N2O,对照组不附加任何气体。 3个实验组气体压力达15 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa),于37 ℃孵育箱中维持模拟气腹状态45 min,对照组为大气压力,37 ℃孵育箱中孵育45 min。取出后的细胞悬液用台酚蓝染色后在荧光显微镜下记数4个组存活细胞的比值,同时4个组细胞悬液分别加入96 孔板内。每孔细胞数为5×104个,每组做12复孔,于模拟气腹后24、48、72 h分别用四唑蓝(MTT,美国Sigma公司,微量酶反应于分光光度计在波长为570 nm测定比色值以检测细胞抑制率。 统计学方法:各组间比色值用Student t检验。 二、结果 “气腹’后4个组细胞存活百分比差异无显著性(P>0.05),其中CO2组为(92.3±1.2)%,He组为(89.6±2.5)%, N2O组为(90.5±±3.1)%,对照组为(90.7±3. 1)%。在观察的72 h中,肿瘤细胞均生长。气腹后测定各组pH值结果: CO2组为6.6, He组为9.8, N2O为8.2, 对照组为7.3。以MTT法对细胞进行抑制率测定(图1), CO 2组在“气腹”后第24小时与He组、N2O组和对照组相比, MTT值(对照孔-用药孔 /对照孔×100)上升,差异有非常显著性(P<0.01); He组较 N2O组和空白组明显下降(P<0.05), N2O和对照组之间MTT值差异无显著性(P>0.05)。第48小时CO2组与其他3个组相比,MTT值亦上升,其中较 H e组差异有非常显著性(P<0.01),较N2O和对照组差异有显著性(P<0.05),He组较N2O和对照组下降,差异有显著性(P<0.05),N2O和对照组之间差异无显著性(P>0.05)。第72小时,各组MTT值差异均无显著性(P>0.05)。