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幽门螺杆菌诱导大鼠胃粘膜细胞分泌胃蛋白酶原
为研究幽门螺杆菌(Hp)超声提取物对大鼠胃粘膜细胞系合成与分泌胃蛋白酶原的影响,大鼠胃粘膜细胞OUMS-37(34代)在DMEM培养基中培养3*!d后细胞生长到紧密状态时,换以新鲜的培养基,加入Hp超声提取物或试剂后,采用酸变性法,按指定时间取培养上清及细胞裂解液测定胃蛋白酶原活力。
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丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白5反式调节基因的筛选
目的:应用基因表达谱芯片技术研究丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白5的反式调节基因.方法:以分子生物学技术构建NS5ATP5的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP5,以表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ATP5转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA.应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析.结果:HepG2细胞经转染NS5ATP5后,有17条基因表达增强,12条基因表达降低.结论:成功筛选了NS5ATP5的反式调节基因,为进一步阐明NS5ATP5的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.
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应用抑制性消减杂交技术筛选rhALR调节基因
目的:筛选与克隆重组人肝再生增强因子激活基因,了解其在体内的调节功能线索及机制.方法:应用大肠杆菌系统,表达、纯化重组人肝再生增强因子蛋白.刺激HepG2细胞,以溶剂PH7.8的磷酸盐缓冲液为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建重组人肝再生增强因子激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到30个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-1000 bp插入片段.对插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得19种编码基因,包括15种已知基因和4种未知基因.结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、肿瘤免疫发生及物质代谢密切相关的蛋白编码基因,推测了重组人肝再生增强因子在体内可能存在的调控机制的线索,尚需进一步的实验证明.
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应用抑制性消减杂交技术克隆HBV全S蛋白反式激活蛋白1的反式激活基因
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)全S蛋白反式激活蛋白1(CSTP1)的反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HBV CSTP1反式激活相关基因.方法:以HBV CSTP1表达质粒pcDNA3.1(-)-CSTP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人HBV CSTP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到86个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到100-1000 bp插入片段.挑取25个含有插入片段的阳性克隆测序分析,获得23个已知基因序列和2个未知基因.未知基因的功能还正在研究中.结论:应用SSH技术成功构建了HBV CSTP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为进一步阐明HBV CSTP1反式调节的靶基因及致肝病发生的分子生物学机制提供理论依据.
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基因表达谱芯片筛选双环醇作用HepG2细胞后的差异表达基因
目的:应用基因表达谱芯片技术了解双环醇在肝细胞中可能上调或下调的基因,了解其可能的调节功能线索.方法:以双环醇处理HepG2细胞,同时以二甲基硫氧化物(DMSO)处理的相同细胞系作为对照;24h后制备细胞裂解液,提取mRNA.应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析.结果:经基因表达谱芯片分析,12种基因的表达水平上调,9种基因的表达水平下调.结论:筛选到的一些与细胞周期、蛋白质的翻译合成、能量代谢、体内免疫调节、细胞凋亡及细胞内的信号传导方面的起重要作用及肿瘤发生相关的基因,推测了双环醇可能存在的调控机制的线索,尚需进一步的实验证明.
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应用表达谱芯片技术筛选HBcAg反式调节基因
目的:筛选与克隆HBcAg激活基因,了解其在体内的调节功能线索及机制.方法:以分子生物学技术构建HBcAg的真核表达载体pcDNA3.1(-)-HBcAg,以表达质粒pcDNA3.1(-)-HBcAg转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA.应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析.结果:HBcAg表达质粒pcDNA3.1(-)-HBcAg经酶切鉴定和DNA测序鉴定正确.经基因表达谱芯片分析,29种基因的表达水平上调,17种基因的表达水平下调.结论:筛选到一些与细胞内信号传导、免疫调节、细胞凋亡、蛋白质翻译合成、肿瘤发生相关的HBcAg反式调节的靶基因.
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基因表达谱芯片技术筛选TAHCCP1转染细胞差异表达基因
目的:应用基因芯片技术,检测丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白反式激活基因TAHCCP1的表达对肝母细胞瘤细胞系HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明TAHCCP1在肝细胞中上调或下调的基因,探索其可能的调节功能.方法:设计并合成TAHCCP1基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增TAHCCP1基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的TAHCCP1编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-TAHCCP1,转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA,逆转录为cDNA,应用基因表达谱芯片技术对两组间差异表达mRNA进行检测和分析.结果:在筛选的1 152点cDNA芯片中,有110种基因的表达水平上调(占9.55%),98种基因的表达水平下调(8.51%),包括一些与体内免疫调节、脂类代谢、蛋白质的翻译合成、氧化反应、细胞凋亡及细胞内的信号传导方面的基因.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了TAHCCP1转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明TAHCCP1蛋白可能的生物学功能提供依据.
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乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP7的克隆
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术筛选乙型肝炎病毒X蛋白(HBxAg)反式激活基因差异表达的cDNA,克隆HBxAg反式激活相关靶基因.方法:以HBxAg表达质粒pcDNA3.1(-)-X转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次杂交消减及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析,发现其中之一为未知基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性.通过序列同源性搜索比对,电子拼接成功,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,初步确定新型基因序列.从转染了pcDNA3.1(-)的HepG2细胞提取总RNA,以RT-PCR技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序加以证实.结果:发现新基因,命名为XTP7,在GenBank中注册,注册号为AF490256.XTP7基因的编码序列全长为588个核苷酸(nt),编码产物由196个氨基酸残基(aa)组成.结论:应用SSH成功筛选与克隆HBxAg反式激活新型靶基因XTP7,为进一步阐明HBxAg反式调节作用及其在HBV感染中的分子生物学机制提供理论依据和研究方法.
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乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP8的克隆
目的:应用抑制性消减杂交技术筛选乙型肝炎病毒X蛋白(HBxAg)反式激活基因差异表达的cDNA,克隆HBxAg反式激活相关靶基因.方法:以HBxAg表达质粒pcDNA3.1(-)-X转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析,发现其中之一为未知基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性.通过序列同源性搜索比对,电子拼接成功,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,初步确定新型基因序列.从转染了pcDNA3.1(-)的HepG2细胞提取总RNA,以RT-PCR技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序加以证实.结果:发现新基因,命名为XTP8,在GenBank中注册,注册号为AF49257.XTP8基因的编码序列全长为1590个核苷酸(nt),编码产物由530个氨基酸残基(aa)组成.结论:应用抑制性消减杂交技术成功筛选与克隆HBxAg反式激活新型靶基因XTP8,为进一步阐明HBxAg反式调节作用及其在HBV感染中的分子生物学机制提供理论依据和研究方法.
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应用抑制性消减杂交技术克隆和筛选HCVp7蛋白的反式调节基因
目的:构建丙型肝炎病毒HCV p7蛋白反式激活相关基因差异表达的差异cDNA,克隆HCV p7蛋白反式激活相关基因.方法:以HCV p7表达质粒pcDNA3.1(-)-p7转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并合成cDNA,经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人HCV p7蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA.扩增后得到56个200-1000 bp插入片段的克隆,随机挑选其中33个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得15种编码基因,其中1个为未知功能的新基因.结论:筛选到的cDNA全长序列,包括与细胞生长调节、物质代谢、和细胞凋亡密切相关的一些蛋白编码基因.
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乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒反式调节靶基因的抑制性消减杂交和基因芯片分析结果的比较
目的:筛选与克隆HBV和HCV蛋白反式调节靶基因,阐明HBV和HCV感染后慢性肝脏疾病的发病机制.方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及表达谱基因芯片(cDNA microarray)技术筛选并克隆HBV和HCV蛋白反式调节的靶基因.以HBV和HCV蛋白的表达质粒转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.同时进行表达谱基因芯片技术分析.结果:成功构建人HBV和HCV蛋白反式调节基因差异表达的cDNA消减文库,对HBV和HCV蛋白反式调节的靶基因同时进行基因表达谱芯片的分析.在SSH分析中,文库扩增后均得到200-800 bp插入片段.对插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列.对于不同的肝炎病毒蛋白反式调节的靶基因类型,以及不同的分析技术研究的结果进行比较分析,发现了一系列的共同调节的靶基因,说明不同的肝炎病毒蛋白反式调节具有共同的作用途径.结论:筛选到的反式调节靶基因,包括一些与细胞生长调节、信号转导、肿瘤免疫发生及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了HBv和HCV蛋白可能存在的调控机制,有助于阐明HBV和HCV蛋白的反式调节在慢性肝脏疾病的发生发展中的作用.
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应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活的相关基因
目的:应用抑制性消减杂交技术(SSH)构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式激活的相关基因cDNA消减文库,克隆HCV NS3反式激活相关基因.方法:以HCV NS3表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:文库扩增后得到70个白色克隆,经菌落PCR分析,得到56个200-1 000 b插入片段.对所得片段测序,并进行同源性分析,获得6个差异表达的未知序列,可能是NS3反式激活的新的靶基因.结论:成功构建HCV NS3反式激活的相关基因cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定基础.
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基因表达谱芯片技术筛选丙型肝炎病毒核心蛋白反式调节基因TAHCCP2的调节基因
目的:应用基因表达谱芯片技术了解TAHCCP2在肝细胞中可能上调或下调的基因,了解其可能的调节功能线索.方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinfo-rmatics)技术筛选并克隆HCV核心蛋白反式激活的新型靶基因TAHCCP2.以TAHCCP2表达质粒pcDNA3.1(-)-TAHCCP2转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA.应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析.结果:TAHCCP2表达载体pcDNA3.1(-)-TAHCCP2经酶切鉴定和DNA测序鉴定正确.经基因表达谱芯片分析,4种基因的表达水平下调.结论:筛选到的一些与体内氧化应激、细胞生长和能量代谢相关的基因,推测了TAHCCP2可能存在的调控机制的线索,尚需进一步的实验证明.
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应用抑制性消减杂交技术筛选TAHCCP2的反式调节基因
目的:筛选与克隆TAHCCP2的反式激活基因,了解其可能存在的调节功能线索.方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆TAHCCP2反式激活的新型靶基因.以TAHCCP2表达质粒pcDNA3.1(-)-TAHCCP2转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取muRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人TAHCCP2反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到70个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-1000 bp插入片段.对插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得15种编码基因.结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢、免疫及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了TAHCCP2可能存在的调控机制的线索,尚需进一步的实验证明.
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应用抑制性消减杂交技术筛选HBV DNA聚合酶中RNase H的反式调节基因
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建HBV DNA聚合酶(DNAP)末端蛋白反式激活基因.方法:以RNase H表达质粒pcDNA3.1(-)-RNase H转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:文库扩增后得到38个白色克隆,经菌落PCR分析,得到36个200-1 000bp插入片段.对所得片段测序,并进行同源性分析,显示33种已知基因编码蛋白和3种未知功能基因序列,可能是RNase H反式激活靶基因.结论:成功构建HBV RNase H反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.
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应用抑制性消减杂交技术筛选双环醇调节靶基因
目的:应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybrid-ization,SSH)技术构建双环醇处理的人肝癌细胞系HepG2差异表达基因的cDNA消减文库,筛选并克隆双环醇调节相关基因,阐明双环醇对肝细胞调节作用的分子生物学机制.方法:以双环醇处理HepG2细胞,同时以二甲基硫氧化物(DMSO)处理的相同细胞系作为对照;24 h后制备细胞裂解液,提取muRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性多聚酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建双环醇处理HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库.文库扩增后得到46个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到2 0-1 000bp插入片段.挑取含有插入片段的30个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得14种已知基因序列.结论:应用SSH技术成功构建了双环醇处理HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库.该文库的建立为进一步阐明双环醇在体内的调节机制提供依据.
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应用抑制性消减杂交技术克隆和筛选丙型肝炎病毒NS3蛋白反式激活基因1的反式调节基因
目的:筛选与克隆丙型肝炎病毒(HCV)NS3反式激活基因1的反式激活基因,了解其可能存在的调节功能线索.方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioin-formatics)技术筛选并克隆NS3TP1反式激活的新型靶基因.以NS3TP1表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3TP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人NS3TP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到68个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-1000 bp插入片段.随机挑选其中36个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得23种编码基因,其中3个为未知功能的新基因.结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢、免疫及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了NS3TP1可能存在的调控机制的线索.
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应用抑制性消减杂交技术克隆HCV NS3蛋白反式激活基因2的上调基因
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)NS3蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HCV NS3蛋白反式激活相关基因.方法:以HCV NS3表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并合成cDNA,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人HCV NS3蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到61个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到100-1 000bp插入片段.挑取30个插入片段测序分析,得到30个已知功能基因序列.结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢、免疫及细胞凋亡密切相关的蛋白编码因,推测了NS3TP2可能存在的调控机制的线索.
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应用抑制性消减杂交技术筛选乙型肝炎病毒核心抗原反式调节基因
目的:筛选与克隆HBcAg反式调节基因,了解其在体内的调节功能线索及机制.方法:以分子生物学技术构建HBcAg的真核表达载体pcDNA3.1(-)-HBcAg,以表达质粒pcDNA3.1(-)-HBcAg转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人HBcAg激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到33个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-800 bp插入片段.对插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得17种编码基因.结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢及肿瘤发生密切相关的蛋白编码基因,推测了HBcAg在体内可能存在的调控机制的线索,尚需进一步的实验证明.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因6的反式激活基因的筛选
目的:筛选与克隆NS5A反式激活的新型靶基因NS5ATP6的反式激活基因,探讨其可能存在的调节功能.方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆NS5ATP6反式激活的新型靶基因.以NS5ATP6表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ATP6转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人NS5ATP6反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到33个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-2000 bp插入片段.对插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得26种编码基因,包括24种已知基因和2种未知基因.结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、信号转导、肿瘤免疫发生及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了NS5ATP6可能存在的调控机制的线索,尚需进一步的实验证明.