首页 > 文献资料
-
一种高通量筛选结直肠癌转移相关cDNA文库的方法
我们已利用抑制消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH),构建了结直肠癌转移相关cDNA消减文库,为进一步开展结直肠癌转移相关研究提供了大量的信息[1].如何高效、便捷、高通量地差异筛选该文库,成为目前急需解决的问题.以往多用Northern blot和反向Northern印迹进行差异片段的检测,但筛查量有限.cDNA微阵列用于文库筛查具有明显的优越性,但成本较高、对小插入片段的检出率还有待提高.本研究利用并改进了差异筛选方法,实现了对SSH消减文库的高通量筛选.该方法不仅有利于发现低丰度的差异基因片段,还能大大提高筛选正确率,加快基因鉴定的过程.
-
伤寒活疫苗Ty21a免疫相关新基因的克隆及其组织分布
粘膜免疫在机体的免疫防御系统中起着重要的作用.寻找粘膜免疫防御相关的分子,对于揭示粘膜免疫的规律具有重要的意义.在通过抑制消减杂交,建立cDNA消减文库的过程中,发现了几条在Ty21a免疫后基因表达发生改变的新的ESTs.为了揭示这些ESTs对应的基因在粘膜免疫中的作用,我们利用RACE-PCR技术扩增了其中1条EST对应基因的全长.
-
应用抑制性消减杂交技术筛选rhALR调节基因
目的:筛选与克隆重组人肝再生增强因子激活基因,了解其在体内的调节功能线索及机制.方法:应用大肠杆菌系统,表达、纯化重组人肝再生增强因子蛋白.刺激HepG2细胞,以溶剂PH7.8的磷酸盐缓冲液为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建重组人肝再生增强因子激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到30个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-1000 bp插入片段.对插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得19种编码基因,包括15种已知基因和4种未知基因.结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、肿瘤免疫发生及物质代谢密切相关的蛋白编码基因,推测了重组人肝再生增强因子在体内可能存在的调控机制的线索,尚需进一步的实验证明.
-
应用抑制性消减杂交技术克隆HBV全S蛋白反式激活蛋白1的反式激活基因
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)全S蛋白反式激活蛋白1(CSTP1)的反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HBV CSTP1反式激活相关基因.方法:以HBV CSTP1表达质粒pcDNA3.1(-)-CSTP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人HBV CSTP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到86个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到100-1000 bp插入片段.挑取25个含有插入片段的阳性克隆测序分析,获得23个已知基因序列和2个未知基因.未知基因的功能还正在研究中.结论:应用SSH技术成功构建了HBV CSTP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为进一步阐明HBV CSTP1反式调节的靶基因及致肝病发生的分子生物学机制提供理论依据.
-
应用抑制性消减杂交技术克隆NS5A-TP2(615)反式激活基因
目的:应用抑制性消减杂交技术构建人类新基因NS5ATP2(615)反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆NS5ATP2反式激活相关基因,了解该基因的可能生物学功能.方法:构建NS5ATP2表达质粒pcDNA3.1(-)NS5ATP2-TP2转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照;提取转染后细胞的mRNA,反转录为cDNA.半定量RT-PCR显示实验组NS5ATP2的转录水平明显高于对照组.cDNA经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制多聚酶链反应(PCR),将产物与pEGM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人类新基因NS5ATP2反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到76个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-1000 bp插入片段.挑取含有插入片段的32个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得17种已知功能基因序列,和2个未知功能基因.结论:应用SSH技术成功构建了NS5ATP2反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为阐明NS5ATP2生物学功能提供理论依据.
-
应用抑制性消减杂交技术克隆乙型肝炎病毒前-X蛋白反式激活基因
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)前-X基因反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆前-X反式激活相关基因,了解该段基因的可能生物学功能.方法:构建表达质粒pcDNA3.1(-)-前-X,转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照;提取转染后细胞的mRNA,反转录为cDNA.cDNA经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制多聚酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建前-X基因反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到45个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-1000 bp插入片段.挑取含有插入片段的30个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得13种已知功能基因序列.结论:应用SSH技术成功构建了前-X基因反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为阐明该基因生物学功能提供理论依据.
-
应用抑制性消减杂交技术克隆和筛选HCVp7蛋白的反式调节基因
目的:构建丙型肝炎病毒HCV p7蛋白反式激活相关基因差异表达的差异cDNA,克隆HCV p7蛋白反式激活相关基因.方法:以HCV p7表达质粒pcDNA3.1(-)-p7转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并合成cDNA,经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人HCV p7蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA.扩增后得到56个200-1000 bp插入片段的克隆,随机挑选其中33个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得15种编码基因,其中1个为未知功能的新基因.结论:筛选到的cDNA全长序列,包括与细胞生长调节、物质代谢、和细胞凋亡密切相关的一些蛋白编码基因.
-
乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒反式调节靶基因的抑制性消减杂交和基因芯片分析结果的比较
目的:筛选与克隆HBV和HCV蛋白反式调节靶基因,阐明HBV和HCV感染后慢性肝脏疾病的发病机制.方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及表达谱基因芯片(cDNA microarray)技术筛选并克隆HBV和HCV蛋白反式调节的靶基因.以HBV和HCV蛋白的表达质粒转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.同时进行表达谱基因芯片技术分析.结果:成功构建人HBV和HCV蛋白反式调节基因差异表达的cDNA消减文库,对HBV和HCV蛋白反式调节的靶基因同时进行基因表达谱芯片的分析.在SSH分析中,文库扩增后均得到200-800 bp插入片段.对插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列.对于不同的肝炎病毒蛋白反式调节的靶基因类型,以及不同的分析技术研究的结果进行比较分析,发现了一系列的共同调节的靶基因,说明不同的肝炎病毒蛋白反式调节具有共同的作用途径.结论:筛选到的反式调节靶基因,包括一些与细胞生长调节、信号转导、肿瘤免疫发生及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了HBv和HCV蛋白可能存在的调控机制,有助于阐明HBV和HCV蛋白的反式调节在慢性肝脏疾病的发生发展中的作用.
-
应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活的相关基因
目的:应用抑制性消减杂交技术(SSH)构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式激活的相关基因cDNA消减文库,克隆HCV NS3反式激活相关基因.方法:以HCV NS3表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:文库扩增后得到70个白色克隆,经菌落PCR分析,得到56个200-1 000 b插入片段.对所得片段测序,并进行同源性分析,获得6个差异表达的未知序列,可能是NS3反式激活的新的靶基因.结论:成功构建HCV NS3反式激活的相关基因cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定基础.
-
应用抑制性消减杂交技术筛选TAHCCP2的反式调节基因
目的:筛选与克隆TAHCCP2的反式激活基因,了解其可能存在的调节功能线索.方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆TAHCCP2反式激活的新型靶基因.以TAHCCP2表达质粒pcDNA3.1(-)-TAHCCP2转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取muRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人TAHCCP2反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到70个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-1000 bp插入片段.对插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得15种编码基因.结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢、免疫及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了TAHCCP2可能存在的调控机制的线索,尚需进一步的实验证明.
-
截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白上调c-myc基因表达的研究
目的:应用抑制性消减杂交方法构建截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBst)反式调节基因的消减文库,用免疫印迹方法验证截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白对c-myc基因的上调表达.方法:构建羧基末端截短的乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白的真核表达载体pcDNA3.1(-)-Mt,分别以重组表达质粒pcDNA3.1(-)-Mt和空载体pcDNA3.1(-)瞬时转染HepG2细胞,提取细胞mRNA并逆转录为cDNA,用抑制性消减杂交技术,将实验组与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性多聚酶链反应(PCR),构建eDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.生物信息学分析结果显示部分与肿瘤发生密切相关的基因,如癌基因c-myc.结果:显示截短型乙肝病毒表面抗原中蛋白可以反式激活c-myc基因,并上调其表达.结论:成功构建截短型乙肝病毒表面抗原中蛋白反式调节基因的消减文库,细胞原癌基因c-myc是MHBst反式激活作用的靶基因,为进一步阐明乙型肝炎病毒致癌的分子生物学机制提供理论基础.
-
应用抑制性消减杂交技术筛选HBV DNA聚合酶中RNase H的反式调节基因
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建HBV DNA聚合酶(DNAP)末端蛋白反式激活基因.方法:以RNase H表达质粒pcDNA3.1(-)-RNase H转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:文库扩增后得到38个白色克隆,经菌落PCR分析,得到36个200-1 000bp插入片段.对所得片段测序,并进行同源性分析,显示33种已知基因编码蛋白和3种未知功能基因序列,可能是RNase H反式激活靶基因.结论:成功构建HBV RNase H反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.
-
丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因2基因组DNA结构分析及其不同剪切体的克隆化研究
目的:HCV NS5A病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因NS5ATP2及其不同剪接体基因序列的确立、克隆化研究.方法:依据我室构建的NS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,利用生物信息学技术获得,提取HepG2细胞的总RNA,进行反转录(RT-PCR),扩增产物与原核表达载体连接,进行测序鉴定.结果:经测序鉴定成功获得新基因的编码序列,并意外发现了NS5ATP2的不同剪接体,对NS5ATP2基因组进行分析,获得剪接体的编码序列,并成功进行了克隆化研究.结论:利用分子生物信息学技术,发现并鉴定了HCVNS5A反式激活作用的新的靶基因NS5ATP2(615)及其可变剪接体NS5ATP2(216),为研究新基因的生物学功能及丙肝发病机制提供新的依据.
-
应用抑制性消减杂交技术筛选双环醇调节靶基因
目的:应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybrid-ization,SSH)技术构建双环醇处理的人肝癌细胞系HepG2差异表达基因的cDNA消减文库,筛选并克隆双环醇调节相关基因,阐明双环醇对肝细胞调节作用的分子生物学机制.方法:以双环醇处理HepG2细胞,同时以二甲基硫氧化物(DMSO)处理的相同细胞系作为对照;24 h后制备细胞裂解液,提取muRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性多聚酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建双环醇处理HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库.文库扩增后得到46个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到2 0-1 000bp插入片段.挑取含有插入片段的30个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得14种已知基因序列.结论:应用SSH技术成功构建了双环醇处理HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库.该文库的建立为进一步阐明双环醇在体内的调节机制提供依据.
-
应用抑制性消减杂交技术克隆和筛选丙型肝炎病毒NS3蛋白反式激活基因1的反式调节基因
目的:筛选与克隆丙型肝炎病毒(HCV)NS3反式激活基因1的反式激活基因,了解其可能存在的调节功能线索.方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioin-formatics)技术筛选并克隆NS3TP1反式激活的新型靶基因.以NS3TP1表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3TP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人NS3TP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到68个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-1000 bp插入片段.随机挑选其中36个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得23种编码基因,其中3个为未知功能的新基因.结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢、免疫及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了NS3TP1可能存在的调控机制的线索.
-
应用抑制性消减杂交技术克隆HCV NS3蛋白反式激活基因2的上调基因
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)NS3蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HCV NS3蛋白反式激活相关基因.方法:以HCV NS3表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并合成cDNA,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人HCV NS3蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到61个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到100-1 000bp插入片段.挑取30个插入片段测序分析,得到30个已知功能基因序列.结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢、免疫及细胞凋亡密切相关的蛋白编码因,推测了NS3TP2可能存在的调控机制的线索.
-
应用抑制性消减杂交技术筛选乙型肝炎病毒核心抗原反式调节基因
目的:筛选与克隆HBcAg反式调节基因,了解其在体内的调节功能线索及机制.方法:以分子生物学技术构建HBcAg的真核表达载体pcDNA3.1(-)-HBcAg,以表达质粒pcDNA3.1(-)-HBcAg转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人HBcAg激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到33个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-800 bp插入片段.对插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得17种编码基因.结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢及肿瘤发生密切相关的蛋白编码基因,推测了HBcAg在体内可能存在的调控机制的线索,尚需进一步的实验证明.
-
丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因6的反式激活基因的筛选
目的:筛选与克隆NS5A反式激活的新型靶基因NS5ATP6的反式激活基因,探讨其可能存在的调节功能.方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆NS5ATP6反式激活的新型靶基因.以NS5ATP6表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ATP6转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人NS5ATP6反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到33个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-2000 bp插入片段.对插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得26种编码基因,包括24种已知基因和2种未知基因.结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、信号转导、肿瘤免疫发生及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了NS5ATP6可能存在的调控机制的线索,尚需进一步的实验证明.
-
胃癌癌前病变相关基因的筛查及表达研究
目的:胃黏膜异型增生是一种公认的重要癌前病变,筛查癌前病变相关基因并研究这些基因在胃癌不同阶段的表达,探讨胃癌发生分子机制.方法:手工显微切割取胃异型增生和正常组织,应用cDNAPCR方法对少量组织全基因组扩增后进行双向抑制性消减杂交,消减后片段与载体连接、克隆、筛选、测序及同源性检索.应用斑点杂交检测基因在胃癌不同阶段的表达,并用半定量RT-PCR方法进一步验证检测结果.结果:正常和异型增生组织互为tester和driver成功构建了两个cDNA消减文库,测序的26个克隆中21个片段在胃癌不同阶段有表达异常,特别是其中4个基因(P125,cytochrome coxidase subunitI,meprin A,acidic calponin)在异型增生、早癌、进展期胃癌中皆有表达改变,可能是重要的胃癌癌前病变相关基因.结论:发现4个新的与胃癌发生相关基因,其具体机制有待进一步研究.
-
膀胱移行细胞癌差异表达基因的克隆与鉴定
应用抑制消减杂交(SSH)构建膀胱移行细胞癌差异表达的消减文库,再应用Dot blot方法筛选出差异表达的基因,为研究膀胱癌发生、发展提供实验依据.现报告如下.