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PCR衍生技术在鼠疫耶尔森菌基因鉴定和分型中的应用
运用PCR衍生技术对不同生态型的鼠疫耶尔森菌(简称鼠疫菌)进行基因鉴定和分型,使高通量实验结果能反映鼠疫流行历史,易于比较其基因组、致病力等方面的差异,为鼠疫菌的临床诊断、治疗和溯源提供重要依据.但每种PCR衍生技术各有优缺点,实验需综合考虑分型的能力、可操作性、经费预算等因素和实验条件.
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传染病防控研究：机遇与挑战
进入21世纪，我们仍然面临着“老传染病持续存在、曾一度被控制的传染病又死灰复燃、新传染病不断出现、已知病原的耐药性急剧增加”等严峻挑战。社会的发展和技术的进步，对传染病的预防和控制提出了更高的要求[1]。2001年美国“911”恐怖袭击后的“炭疽芽孢邮件”事件促进了以精确溯源为目标的新学科——微生物法医学的诞生[2]。由中华医学会中华预防医学杂志编委会和中国微生物学会分析微生物专业委员会联合发起的“传染病防控基础研究与应用技术论坛”于2010年在舟山召开了第1届研讨会，2011年在厦门召开了第2届研讨会[3]，旨在围绕传染病的监测与预警、检测与鉴定、分型与溯源、预防与控制等不同领域开展学术交流，促进国内传染病防控能力的提高。本期推出的传染病重点号稿件是从第2届会议投稿中遴选的具有代表性的论文，涵盖了监测、分子分型、病原毒力基因鉴定、疫苗相关研究等内容，希望这些论文对读者有所帮助。
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灵芝精氨酸甲基转移酶基因鉴定及表达分析
目的:在灵芝转录组基础上,对灵芝蛋白质精氨酸甲基转移酶(PRMTs) GLPRMT1,GLPRMT2和GLPRMT3基因进行全面的生物信息学分析.方法:利用生物信息学方法对灵芝GLPRMT1,GLPRMT2和GLPRMT3基因编码氨基酸序列的理化特性、亲/疏水性、功能域、二级结构、三级结构和系统发育进化等进行分析和预测;利用转录组FPKM分析灵芝不同生长时期GLPRMT1,GLPRMT2和GLPRMT3基因的相对表达量.结果:GLPRMT1和GLPRMT2均具有完整的开放阅读框且为全长,而GLPRMT3不为全长互补脱氧核糖核酸;GLPRMT1,GLPRMT2和GLPRMT3都具有蛋白质精氨酸甲基转移酶保守的AdoMet-MTases结构域;GLPRMT1,GLPRMT2,GLPRMT3分别与真菌的PRMT3家族,PRMT1家族和PRMT5家族聚为—支;GLPRMT2的表达量明显高于GLPRMT1和GLPRMT3,且3个蛋白质精氨酸甲基转移酶基因表达随着灵芝个体的发育均呈上升趋势.结论:本研究结果为揭示灵芝的表观调控机制提供理论基础.
关键词： 灵芝 组蛋白甲基化 蛋白质精氨酸甲基化转移酶 生物信息学 基因鉴定 -
我国嗜人按蚊不同地理株基因鉴别的初步研究
目的分析不同地区嗜人按蚊的基因特征. 方法选择13种随机引物对嗜人按蚊江苏、广西和四川实验株以及从湖北和广东现场捕获的嗜人按蚊进行随机引物PCR扩增,并以中华按蚊江苏实验株为对照. 结果 13种随机引物中有7种随机引物对中华按蚊和5个地区的嗜人按蚊PCR扩增的结果存在差别.S-随机引物对中华按蚊和不同地区嗜人按蚊的扩增结果出现明显差异.中华按蚊和不同地区的嗜人按蚊均出现450 bp 较强扩增条带.但240 bp的强扩增条带为中华按蚊所特有.嗜人按蚊江苏和四川实验株分别在230 bp和320 bp处有1条强扩增条带,而从湖北和广东现场采集的嗜人按蚊分别在400 bp和260 bp处出现较强的扩增条带. 结论采用随机引物PCR技术对不同地区嗜人按蚊的基因分析已显示明显差异.已发现的一些特有的DNA扩增条带可被用作进一步的基因特征分析和鉴别.
关键词： 嗜人按蚊 随机引物聚合酶链反应 基因鉴定 -
转基因蚊研究进展
目前,疟疾、登革热、黄热病、丝虫病和尼罗河病毒病等蚊媒性疾病,仍是全球严重的公共卫生问题.20世纪70年代以来,由于蚊虫对杀虫剂及其所携带病原体对治疗药物抗性的产生,使蚊媒性疾病广泛存在,某些疾病则呈上升趋势.而目前对蚊传播的大多数疾病尚无有效的控制方法,其仍是世界医学界亟待解决的一大课题.1991年一个研究小组和相关机构及基金会代表在美国Tucson召开会议,制订了一个研究计划,提出采用分子遗传工具,遗传修饰媒介,从而达到控制媒介传播疾病的目的.尽管会议对许多媒介与传播疾病做了讨论,但是WHO/TDR作为主要指导机构,提议研究的焦点主要放在疟疾及其传播媒介方面,并制订了一个文件,使遗传控制策略付诸实施[1].近年来,在转基因蚊研究方面主要进展包括胚克隆转染、启动子鉴定、抗病原体效应基因鉴定、转基因昆虫种群繁殖和性遗传机制等.
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一种高通量筛选结直肠癌转移相关cDNA文库的方法
我们已利用抑制消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH),构建了结直肠癌转移相关cDNA消减文库,为进一步开展结直肠癌转移相关研究提供了大量的信息[1].如何高效、便捷、高通量地差异筛选该文库,成为目前急需解决的问题.以往多用Northern blot和反向Northern印迹进行差异片段的检测,但筛查量有限.cDNA微阵列用于文库筛查具有明显的优越性,但成本较高、对小插入片段的检出率还有待提高.本研究利用并改进了差异筛选方法,实现了对SSH消减文库的高通量筛选.该方法不仅有利于发现低丰度的差异基因片段,还能大大提高筛选正确率,加快基因鉴定的过程.
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偏振荧光法定量测定细菌染色体的同源性
定量DNA-DNA杂交技术在细菌基因鉴定和分类方面发挥着重要作用,固相微孔板法,因其简便而被国内外微生物学工作者广泛应用[1-3].但因残留的多糖对DNA包板的影响,导致两种DNA杂交后同源性计算的误差,有碍细菌的鉴定和分类.液相杂交可避免这一不足.本研究应用一种新的荧光染料SYBR Green1特异性结合双股DNA的特性,并借助偏振荧光技术的敏感性,对10株临床分离菌进行了种间同源性测定,报告如下.
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HeLa细胞感染痢疾杆菌前后差异表达的新EST序列的电子延伸及验证
目的:研究痢疾杆菌福氏2a入侵前和入侵后3 h的人上皮细胞差异表达的新基因.方法:采用增毒的痢疾杆菌福氏2a 2457T侵袭HeLa细胞,检查HeLa细胞中细菌的数量并用RT-PCR方法从HeLa细胞中提取总RNA,制备探针.采用含有约3000个代表新基因的芯片进行芯片杂交,分析杂交结果.将所获得的新的156条EST序列为种子序列用cDNA微阵列实验,以人类EST数据库为基础库,应用SiClone软件进行EST拼接、校对并尽可能延长获得大片段或全长cDNA.选取基因组未注释的编码区序列作为新基因进行RT-PCR实验验证.结果:共鉴定到≥3倍或≤0.33的差异表达的代表新基因的EST序列45条,其中25个延伸序列鉴定为与重要的肠道功能相关的已知基因,并有3个在痢疾杆菌侵袭期间高表达的存在显著差异的新EST序列,他们分别名为:NPCCKHl2、ADBCSB02和HTBAMG05,这3个基因是新的人基因或假基因.结论:鉴定出了在HeLa细胞感染痢疾杆菌前后差异表达的新EST序列,为进一步研究痢疾杆菌与寄主相互作用奠定了基础.
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骨质疏松症的遗传学研究及其基因定位的方法和现状
(上接第5期第282页)三、寻找决定骨质密度基因的分子遗传学研究1.候选基因的关联分析:对导致骨质疏松风险的基因鉴定,开始于维生素D受体基因(VDR)与脊柱和髋骨骨质密度相关联的报道[79].从那以后,大量关于候选基因的分子标记与骨质密度变异相关联的论文不断出现.不同学科(例如分子生物学、细胞生物学)对骨学的几十年研究,揭示越来越多的基因对骨骼生物学有重要作用[80].同时,一些与人类骨骼直接相关的重要候选基因的功能,以及它们和骨质密度之间的关联性研究结果已有全面的总结[18-23],在这不作类似介绍.
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视神经脊髓炎转基因(2D2)鼠的繁殖和鉴定
目的 建立视神经脊髓炎转基因(2D2)小鼠的繁育方法 ,并对其子代鼠进行基因鉴定.方法将雌雄2D2转基因小鼠各1只与C57BL/6野生型小鼠(1:1)进行交配,由鼠尾血提取基因组DNA,应用PCR技术扩增,电泳后观察2D2转基因传代小鼠的基因表型.结果 共繁育产生56只子代小鼠,其中36只子代小鼠基因组DNA扩增出657 bp的2D2条带,阳性率为64.3%.结论 成功利用杂交方式有效繁殖2D2转基因鼠和应用PCR技术进行基因鉴定,为后续视神经脊髓炎的实验研究奠定了基础.
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LRP16转基因小鼠的繁殖与鉴定
目的：繁殖和鉴定携带有外源LRP16基因的转基因小鼠，为体内研究LRP16的生物学功能提供动物模型。方法首先将构建好的LRP16转基因重组质粒转染到293T细胞，鉴定该质粒是否可以有效表达目的蛋白，随后利用原核显微注射方法将线性化的重组质粒注射入品系为FVB的小鼠受精卵中，获得F0代小鼠。应用PCR方法对F0代小鼠进行鉴定，并将阳性F0代小鼠继续繁殖。结果 LRP16转基因重组质粒在293T细胞中可以有效表达，经PCR鉴定获得3只阳性F0代小鼠，阳性率为6.23%，选取其中1只整合有LRP16基因的F0代雄鼠，通过其与野生型FVB小鼠杂交获得7只F1代子鼠，其中4只为阳性鼠，阳性率为57.14%。从F1代中再次选取其中1只阳性雄鼠与野生型小鼠杂交繁殖获得5只F2代子鼠，PCR鉴定结果显示2只为阳性，阳性率为40%。结论 LRP16基因成功整合到小鼠基因组中，并且能够稳定遗传，为后续在动物整体水平研究LRP16的功能奠定了基础。
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基因鉴定技术在拟钉螺亚科物种鉴定中的应用进展
拟钉螺亚科内物种是多种并殖吸虫及亚洲组血吸虫的中间宿主,对其进行准确的分类鉴定对防控相关寄生虫病有重要作用.然而受限于个体小、形态特征不明显等问题,传统方法难以对拟钉螺亚科内物种作出准确的鉴定.随着近年分子生物学及生物信息学相关技术的高速发展,基因鉴定法变得日趋成熟,这使得快速、准确的鉴定拟钉螺亚科物种成为了可能.本文回顾了近年来基因鉴定法中常用的基因片段及其在拟钉螺亚科分类鉴定方面的应用情况,讨论了目前应用中存在的问题并提出了未来进一步的研究方向.
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黑龙江省1株汉滩型汉坦病毒的分离及基因鉴定
目的 从鼠肺中获得汉坦病毒分离株并进行基因鉴定与分型.方法 用组织培养法分离病毒,并进行RT-PCR鉴定,之后对目的 片段进行序列测定和序列分析.结果 从黑线姬鼠鼠肺中分离到一株汉坦病毒,编号HL83.用汉滩型(HTN)汉坦病毒M基因特异性引物检测得到预计大小的片段,此片段的核苷酸序列分析表明,HL83与HTN型参考毒株的同源性较高,与汉城型(SEO)参考毒株的同源性较低,进化树分析表明HL83位于HTN型所在的支系.结论 HL83为HTN型汉坦病毒.
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MicroRNA-150基因敲除小鼠鉴定
①目的 通过基因组特异PCR扩增鉴定MicroRNA-150基因敲除小鼠.②方法 利用碱裂解法提取鼠尾基因组DNA,在小鼠MicroRNA-150基因两端设计特异引物,PCR扩增检测.③结果 正常对照小鼠DNA经PCR扩增产生长度为866个碱基对的DNA片段,MicroRNA-150基因敲除小鼠产生长度为262个碱基对的DNA片段.④结论 通过碱裂解法提取鼠尾DNA并采用特异引物扩增能够准确鉴定MicroRNA-150基因敲除小鼠.
关键词： MicroRNA-150 基因敲除 基因鉴定 -
单亲与双亲亲子鉴定结果的比较分析
[目的] 研究单亲和双亲亲子鉴定结果的准确性.[方法] 采用AmpFe STRTM Identifiler PlusTM荧光标记复合系统,通过310遗传分析仪对213例亲子鉴定进行基因型分型.[结果] 双亲排除案例的排除指标均为3个以上.单亲排除案例中,观察到3例排除指标小于3个,后经增加检测母亲遗传信息,排除指标均大于3个.排除案例中双亲组的排除指标比单亲组平均多2个.不排除案例中,双亲组的RCP均大于99.9999%;在单亲组中RCP值明显偏低,有29.3%案例低于99.73%,只有24%的案例RCP大于99.99%.[结论] 缺少一方的单亲鉴定对鉴定结果有明显影响.
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人脐带间充质干细胞的成脂诱导分化及其相关基因鉴定
目的:探讨人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的分离提取、体外诱导分化为脂肪细胞的能力及其相关基因的表达情况.方法:取新生儿脐带经组织培养法提取后分离培养于αMEM完全培养基中,经大量纯化与扩增后,采用倒置显微镜观察其形态与细微结构;流式技术检测其细胞周期及表面标志;以含有成脂诱导剂的αMEM培养基对P3的hUC-MSCs进行培养,诱导其向脂肪细胞方向分化,对其对诱导后的细胞进行检测.应用油红“O”染色对其进行定性鉴定;应用实时定量RT-PCR对LPL、Leptin的基因含量进行测定.结果:经过组织培养法后,细胞呈贴壁生长,细胞呈梭性或旋涡状,形态不规则,多数有凸起,细胞核较大,核仁明显;第7代以前的细胞具有较强的生长活性;流式技术检测发现此类细胞高表达CD44、CD73和CD105等细胞表面标记,而几乎不表达CD34、CD45、CD31和HLA-DR.培养至第3代的细胞约72.724％的细胞处G1期、S期的细胞仅占18.069％,第7代时G1期细胞约为83.875％、S期为9.606％左右;经成脂诱导剂诱导分化后,细胞经油红“O”染色,分化为脂肪细胞的细胞着色并呈红色,实时定量RT-PCR结果显示该部分细胞表达脂肪细胞的标志性基因LPL和Leptin.结论:P7以前的hUC-MSCs具有较强的生长分化能力,可以向脂肪细胞进行分化并表达一定量的特定标志性基因.
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红色毛癣菌的研究进展
红色毛癣菌是常见的也是世界范围内传播广的一种皮肤癣菌，属毛癣菌属。本文简述了近几年在该菌的基因鉴定、基因分类、基因结构的分子生物学研究和免疫学研究方面的主要进展。在基因鉴定中发展了红色毛癣菌特异性探针TR20S和毛癣菌属特异性引物TR1、TR2和NS5、NS6；利用测序方法对毛癣菌属进行了重新分类，并且用探针、限制性片段多态性分析等方法对红色毛癣菌进行了种内分型研究。
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PCR衍生技术在刚地弓形虫基因鉴定和分型中的应用
不同基因型刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)的致病力及对药物的敏感性等均存在较大的差异.运用PCR衍生技术对不同弓形虫株进行基因鉴定和分型,可为弓形虫病的临床诊断和治疗提供重要依据.本文就PCR衍生技术在弓形虫基因鉴定及分型中的应用进展作一综述.
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DMD免疫缺陷型小鼠模型的建立及其基因型鉴定
目的 建立假肥大型肌营养不良症(DMD)免疫缺陷型小鼠(scid/mdx双基因缺陷型,scid-/-/ mdx-/-),以及其抗肌萎缩蛋白基因(dystrophin)和scid基因的PCR鉴定方法.方法 利用经典遗传学的杂交-互交方法,将非糖尿病-严重联合免疫缺陷(NOD-scid)雄鼠(scid-/-)和mdx雌鼠(mdx-/-)进行交配,提取杂合子F2代小鼠的基因组DNA,对dystrophin以及scid基因进行片段扩增,电泳后观察结果.结果 46只杂合子F2代小鼠中共鉴定出13只dystrophin和scid双基因缺陷型的纯合小鼠,将人骨髓间充质细胞移植入小鼠,能整合分化成骨骼肌细胞.结论 实验成功的得到了DMD免疫缺陷型小鼠,并提供了一种简单快速准确的PCR鉴定方法,为DMD的实验研究中的异种间移植提供了有效的动物模型.
关键词： scid/mdx小鼠 基因鉴定 动物模型 假肥大型肌营养不良症 异种移植 -
红色毛癣菌菌株的聚合酶链反应鉴定
目的用聚合酶链反应(PCR)扩增红色毛癣菌和须癣毛癣菌临床分离株的DNA,观察PCR指纹的差异以及基因型与传统表型的关系,建立一种红色毛癣菌分子生物学鉴定方法.方法采用寡核苷酸重复序列(GACA)4、(GTG)5及M13中心序列(5' - GAGGGTGGCGGTTCT-3')等3种引物,扩增20株红色毛癣菌和须癣毛癣菌临床分离株的DNA, 观察产物电泳带型的差异.结果在3种引物的扩增中,均可见红色毛癣菌和须癣毛癣菌呈现出具有种特异性的DNA指纹,并检出其中2株原据表型鉴定为须癣毛癣菌的红色毛癣菌.结论红色毛癣菌可以用PCR方法加以鉴定,以(GACA)4作引物区分这两种菌为合适.
