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利用量子点免疫荧光双标法在石蜡包埋组织中进行抗原的检测
在组织切片中利用免疫荧光标记抗原是一种广泛使用的方法.在大多数研究中,使用的荧光染料是一些有机分子如F1TC、TBITC、Cy3等.
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支气管哮喘患者外周血T淋巴细胞凋亡及相关基因的表达
我们对哮喘患者的外周血T淋巴细胞的活化诱导细胞凋亡(AICD)及影响细胞凋亡的分子调控机制进行了检测和分析，以期为揭示哮喘的慢性气道炎症机制提供依据。 对象与方法按1997年《支气管哮喘防治指南》［1］，选择初治哮喘患者10例为哮喘组，男、女各5例，平均 (35.8±10.3)岁。选择10名无吸烟史的健康人为对照组，男、女各5例，平均(35.9±11.0)岁。于淋巴细胞分离液中分离外周血单个核细胞（PBMC），尼龙毛柱分离出T淋巴细胞。一部分加入PHA-P液（终浓度为10 μg/ml）和IL-2（终浓度为50U/ml），另一部分仅加入IL-2（终浓度为50 U/ml），然后同时体外培养24 h。回收培养T细胞用AnnexinV法和碘化丙啶(PI)染色法检测T细胞凋亡。AnnexinV凋亡检测试剂盒购自美国Pharmingen公司，按说明书进行免疫荧光标记和流式细胞分析。PI染色法：将细胞加入75%乙醇，-20℃冻存12 h以上。检测前取出细胞加入PI、RNAase，避光孵育15 min后行流式细胞分析。用荧光素(FITC)-Fas单抗及藻红素（PE）-CD3单抗标记，流式细胞检测T细胞膜表面Fas受体的表达情况。用TRIZOL反应剂提取培养T细胞的总RNA，用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增Bax、Bcl-XL特异性基因片段。特异性引物序列（Bax：5′GGACCCGGTGCCTCAGGA，3′CAAAGATGGTCACGGTCTGC；Bcl-XL：5′TTGGACAATGGAC TGGTTGA，3′GTAGAGTGGATGGTCAGTG）及反应条件参照文献［2］。通过凝胶图像扫描及分析系统，以扩增的特异性DNA片段的荧光强度与同时扩增的内参照GAPDH片段的荧光强度比值作为特异性扩增片段的半定量检测值。统计学分析采用F检验、t检验、直线相关分析。
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量子点-CK19抗体荧光探针对乳腺癌细胞免疫荧光标记及毒性研究
目的:制备量子点-细胞角蛋白19抗体(cytokeratin,CK19)荧光探针,利用其光学性质和特异性识别能力对乳腺癌细胞株MDA MB-231进行荧光标记,并探讨其细胞毒性.方法:用水热法合成CdTeS量子点,并将其与CK19抗体连接.通过直接免疫荧光法,利用合成的量子点-CK19抗体探针对乳腺癌细胞株MDA MB-231进行荧光标记,并观察探针在细胞内的分布.分别采用流式细胞术和MTT法,检测探针作用后细胞凋亡情况和增殖变化.结果:量子点-CK19抗体探针能与抗原特异性结合,荧光显微镜和激光共聚焦显微镜示,该探针能有效对乳腺癌细胞株MDA-MB-231进行特异性荧光标记,荧光主要位于细胞质和细胞膜,荧光清晰明亮,持续时间长.与对照组相比,量子点-CK19抗体探针浓度≤2 nmol/L时,对照组乳腺癌细胞株MDA-MB-231的凋亡率为(3.763±0.130)％,0.25 nmol/L组为(3.760±0.161)％,0.5 nmol/L组为(3.827±0.107)％,1 nmol/L组为(3.947±0.081)％,2 nmol/L组为(4.013±0.055)％.单因素方差分析结果显示,各剂量组与对照组比较,差异无统计学意义,F=3.023,P=0.071.量子点CK19抗体探针可抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖,F=133.407,P＜0.001;且存在时间-效应(F=299.142,P＜0.001)和剂量-效应(F=9.105,P＜0.001)关系,随着探针浓度的增加和作用时间的延长,A值逐渐减小,但除了浓度2 nmol/L作用48 h外,其余各组的抑制率均＜7％.结论:成功制备了量子点-CK19抗体荧光探针,该探针能有效对乳腺癌细胞株MDA-MB-231进行荧光标记,且具有良好的光学性质和较低的细胞毒性.
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OVA-CdTe/ZnSe核壳量子点探针的制备及其应用
目的:制备CdTe/ZnSe核壳量子点标记卵清白蛋白(OVA)探针OVA-CdTe/ZnSe,并检测其特异性荧光示踪作用.方法:将CdTe/ZnSe核壳量子点与OVA偶联制备荧光探针,通过凝胶电泳和光谱分析鉴定偶联效果;然后示踪OVA致敏的小鼠外周血嗜碱粒细胞(BASO)表面IgE高亲和力受体FcεRI.结果:偶联OVA后的量子点分子量增加,荧光增强且荧光峰位从628 nm红移至635 nm.通过激光共聚焦显微镜能清晰观测到OVA-CdTe/ZnSe探针对BASO表面IgE-FcεRI复合物的荧光标记.结论:OVA-CdTe/ZnSe探针能示踪OVA特异性IgE-FcεRI复合物,此探针在OVA致敏动物模型的特异性IgE检测中具有一定应用价值.
关键词： CdTe/ZnSe核壳量子点 免疫荧光标记 鸡卵清白蛋白 IgE -
免疫荧光双标记法在子宫平滑肌肿瘤中的应用
随着激光共聚焦显微镜及其技术的推广，石蜡组织免疫荧光标记的方法也日益广泛运用，尤其是荧光双标或多标的方法，因其具有敏感性高、信号分明的特点，成为广大科研工作者喜欢使用的技术方法。荧光双标实验过程较为复杂，它的成功与否会受到很多因素的影响，如果某些环节处理不恰当，会直接导致实验失败[1]。本研究以子宫平滑肌肿瘤为研究对象，分为子宫平滑肌肉瘤组（LMS）、普通型子宫平滑肌瘤组（OUL）、正常子宫平滑肌组（NUSM）3组，选择Survivin和Ki-67两种与细胞增殖和凋亡相关的蛋白，采用免疫荧光双标记法检测各组中2种蛋白的表达情况，取得了较为满意的效果，现以异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）与四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethyl rhodamine isothio-cyanate，TRITC）的荧光双标为例，介绍免疫双荧光切片制备及运用激光共聚焦显微镜采集信号数据的方法。
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粘附分子P选择素在肾病综合征患者中表达水平的变化及临床意义
有关外周血和肾组织中P选择素CD62p临床研究报告尚少[1,2].我们用免疫荧光标记单克隆抗体、免疫组化染色技术,检测了36例肾病综合征(NS)患者肾活检组织中CD62p的分布并对其外周血中表达水平以流式细胞仪分析,并就其临床意义进行探讨.1对象和方法1.1 NS组36例,为1998年1月～2000年4月我院住院患者,男21例,女15例,年龄18～65岁,平均44.5岁,临床诊断均符合NS诊断标准,并排除继发性因素,其中合并高血压者12例,尿蛋白定量3.6～28.2g/24h,平均5.8g/24h,血清白蛋白含量14.6～28.2g/24h,平均26.2g/24h,36例均行肾活检,肾活检组织作常规光镜(HE、PAS、Masson、PASM染色)、免疫酶标(兔抗人IgG、IgA、IgM、C3、HBsAg等LSAB法检测,DAKO产品)和透射电镜检查.病理类型(WH0 1982年分型标准)系膜增生性肾炎(MsPGN)17例、膜型肾病(MN)8例、膜增性肾炎(MPGN)7例、局灶节段性肾小球硬化(FSGS)4例.病程0.5～30个月,36例患者均行激素、环磷酰胺、雷公藤多甙、肝素及潘生丁、复方丹参等治疗.
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水溶性CdTe量子点-广谱抗细胞角蛋白单克隆抗体荧光探针的制备及其对肝癌细胞HepG2的免疫荧光标记
目的 制备水溶性CdTe量子点-广谱抗细胞角蛋白单克隆抗体(QDs-MAb)荧光探针,并对其特异免疫性识别能力和荧光稳定性进行检测.方法 在EDC偶联剂的作用下,将水溶性CdTe量子点与广谱细胞角蛋白单克隆抗体(Pan CK)进行了连接;对肝癌细胞HepG2采用免疫细胞化学法和QDs-MAb单抗荧光探针直接免疫荧光标记法观察比较Pan CK蛋白在细胞内的分布;将量子点与传统的荧光染料FITC的荧光强度和荧光稳定性进行了比较.结果 QDs-MAb单抗荧光探针对HepG2细胞内的Pan CK分子具有特异性的识别能力;与FITC相比,QDs-MAb荧光探针荧光度更强,光化学稳定性更好,激发光连续照射30 min及室温放置3 d后均未见明显淬灭.结论 本实验成功制备了QDs-MAb荧光探针,为半导体量子点用于上皮来源的肿瘤细胞内Pan CK分子的相关检测提供了科学依据.
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牛磺酸对高糖培养下视网膜Mü ller细胞GFAP和TAUT表达的影响
目的:通过检测高糖培养条件下视网膜Mü ller细胞神经纤维酸性蛋白(glial fibrillary acid protein,GFAP)和牛磺酸转运蛋白(taurine transporter,TAUT)的表达变化,观察葡萄糖对Mü ller细胞牛磺酸(taurine)转运功能的影响,探讨牛磺酸对早期糖尿病视网膜病(DR)可能的保护作用.方法:高糖培养大鼠视网膜Mü ller细胞,用免疫细胞荧光化学双染色、Western blotting技术检测不同浓度牛磺酸干预下Mü ller细胞GFAP及TAUT的蛋白表达.结果:高糖可引起Mü ller细胞GFAP表达增强,TAUT表达减弱;牛磺酸可减弱高糖引起的Mü ller细胞GFAP表达增强,TAUT在0.1mmol/L～10 mmo1/L的牛磺酸干预后表达增强.结论:牛磺酸可以抑制高糖导致的Müller细胞功能改变.
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溃疡性结肠炎T淋巴细胞亚群检测及其意义
溃疡性结肠炎(UC)的发病与免疫反应的异常有关.为探讨国人UC免疫调节功能及其在UC发病中的作用,我们采取双色直接免疫荧光标记和流式细胞仪检测方法,对不同病程、轻中度活动期直肠及直肠乙状结肠UC患者的外周血T淋巴细胞亚群进行测定.现报道如下.
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pDCs在狼疮肾炎患者外周血和肾脏组织中的表达
目的 研究浆细胞样树突细胞(pDCs)在狼疮肾炎患者外周血和肾脏组织的表达和分布情况,探讨pDCs在狼疮肾炎发病中的作用.方法 31例狼疮肾炎患者,其中17例为活动期(14例行肾活检),14例为缓解期.分离患者外周血单个核细胞,流式细胞术检测pDCs的表达;设立正常对照组(n=12).应用免疫荧光抗体标记及激光扫描共聚焦显微镜技术,观察14例行肾活检患者肾脏组织中pDC8的分布;设立正常对照(n=4).结果 活动期狼疮肾炎患者外周血pDCs表达的百分数为0.039±0.052,显著低于缓解期的0.168±0.174和正常对照组的0.134±0.079(均P＜0.01).正常对照肾脏组织未见pDCs浸润,而狼疮肾炎患者肾脏组织肾小球pDCs呈高水平表达,在Ⅳ型狼疮肾炎的肾脏组织中,pDCs呈局灶节段分布于系膜区.pDCs表面可见趋化因子受体CCR7表达.结论 狼疮性肾炎的发生可能与其肾组织趋化因子受体水平上调,增强了外周血中pDCs向肾组织的迁移能力有关.外周血pDCs的变化可作为狼疮性肾炎治疗效果的评价指标之一.
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尖锐湿疣患者白细胞功能相关抗原 1及其配体细胞间粘附分子 1的表达
为了探讨白细胞功能相关抗原－ 1（ leukocyte function associated antigen－ 1,LFA－ 1）及其配体细胞间粘附分子－ 1（ intercellular adhesion molecule－ 1, ICAM－ 1）在尖锐湿疣（ CA）发病过程中的作用，我们采用免疫荧光标记单克隆抗体－流式细胞分析技术，对 CA患者外周血淋巴细胞 LFA－ 1及 ICAM－ 1的表达进行了研究，现报道如下。
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系统性红斑狼疮患者外周血B淋巴细胞CD40、TRAF1的表达及其意义
目的 探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血B淋巴细胞CD40和肿瘤坏死因子受体相关因子1(TRAF1)的表达及两者间的相互关系.方法 采用免疫荧光标记和流式细胞仪技术检测28例SLE患者及14名正常人外周血B细胞CD40、TRAF1的表达.结果 (1)活动期SLE患者外周血B细胞CD40、TRAF1的表达高于缓解期SLE患者及正常对照组,差异有高度统计学意义(P<0.01).缓解期SLE患者外周血B细胞CD40的表达与正常对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05);但TRAF1的表达高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05).(2)活动期和缓解期SLE患者外周血B细胞CD40的表达与TRAF1的表达成正相关(P<0.05).结论 外周血B细胞CD40、TRAF1在SLE的发病机制中可能参与免疫调节作用.
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不稳定型心绞痛冠脉病变与血小板功能的关系
近年来血管镜检查发现不稳定型心绞痛（UAP）冠脉病变具有多样性，相当部分患者并无血栓形成，显然对常规抗血小板及抗凝治疗不合适，故筛选适于抗血小板及抗凝治疗的病例尤为重要。本研究旨在阐述UAP患者心电图异常和冠脉造影（CAG）所示病灶特征与血小板膜GPⅡb／Ⅲa表达率的联系。对象与方法 对象：（1）我院1998年8月～2000年6月收住院的UAP患者38例，男21例，女17例。平均年龄61.4±3.7岁。入院前至少一周未接受阿斯匹林、肝素等药物治疗，均备有近期（≤3天）心绞痛发作时和缓解期心电图资料，心肌酶谱检测、血小板计数均正常。无陈旧性心肌梗塞或经皮冠脉成形术史。入院后4天内全部接受选择性CAG。（2）健康对照组8例，男女各4人，平均年龄58±7.9岁，静息ECG、CAG正常。 ECG分析：记录标准12导联，必要时加右胸及后壁导联。根据胸痛发作时可逆性ECG变化分（1）ST-T变化组：两个相邻导联短暂性ST抬高≥0.1mv或压低≥0.05mv，伴或不伴T波改变。（2）单纯T波变化组：仅有可逆性T波改变，两个相邻导联上T波倒置、高尖或"假性正常化"，而不伴ST抬高≥0.1mv或压低≥0.05mv。 CAG分析：结合胸痛发作时ECG异常来判断，病灶形态特征分为（1）复杂病变：指偏心性病变Ⅱ型、多节段不规则病变或伴有血栓性病变。腔内卵圆形或圆形充盈缺损，或造影剂滞留均提示血栓形成。（2）简单病变：指同心性狭窄、偏心性病变Ⅰ型。 血小板膜GPbⅡ／Ⅲa受体检测：入院后药物治疗前取静脉血2ml，用免疫荧光标记PAC-1多克隆抗体（Becton-Dickinson公司提供）流式细胞仪（Becton-Dickinson公司Facscalibur型）检测，阳性表达血小板百分率（＋p1％）、平均颗粒荧光强度（MFI），计算结合指数（BI＝＋p1％×MFI）。 统计学处理：数据以±s表示，计量资料组间比较用t检验，计数资料比较用χ2检验。
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ZnSe∶Mn/ZnSe-IgG掺杂量子点探针对人肝癌细胞的免疫荧光成像的影响
目的 利用水溶性ZnSe:Mn/ZnSe掺杂量子点优良的光学特性实现对肝癌细胞株HCCLM9甲胎蛋白(AFP)抗原的特异性免疫荧光标记成像.方法 用巯基丙酸修饰的ZnSe∶Mn/ZnSe掺杂量子点,制备水溶性ZnSe∶Mn/ZnSe-IgG复合物探针.荧光、紫外光光谱分析及透射电镜研究其特性.通过间接免疫荧光法,用水溶性ZnSe∶Mn/ZnSe-IgG复合物探针标记肝癌细胞株HCCLM9 AFP抗原.噻唑蓝(MTT)法检测该复合物探针的细胞毒性,并同传统量子点探针比较.双光子共聚焦激光显微镜观察成像,并进行连续激发实验,同传统量子点探针及有机荧光探针比较光稳定性.结果 该水溶性ZnSe∶Mn/ZnSe-IgG复合物探针具有激发光谱宽、荧光强度高的特点,生物相容性较传统量子点好,无明显细胞毒性.用该探针对肝癌细胞成像清晰,其荧光在共聚焦激光连续激发情况下无明显衰减.结论 ZnSe∶Mn/ZnSe掺杂量子点是一种较理想的荧光材料,比传统量子点毒性更小,并且比传统的有机荧光染料具有更优良的光学特性.
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siRNA干扰IL－13Rα2表达对人肺成纤维细胞TGF－β表达的影响
目的：比较观察siRNA沉默IL－13Rα2基因前后人肺成纤维细胞（ HFL） IL－13Rα1、IL－13Rα2和TGF－β的表达情况，探讨IL－13Rα2与TGF－β和纤维化之间的关系。方法：不同浓度的IL－13外源性刺激HFL细胞，real－time PCR检测siRNA瞬时转染沉默IL－13Rα2基因前后IL－13Rα1、IL－13Rα2和TGF－β的mRNA表达量的变化；细胞免疫荧光标记观察IL－13Rα2和TGF－β的荧光蛋白的表达水平。结果：IL－13外源性刺激能增强HFL细胞IL－13Rα2的表达，其表达量随IL－13浓度的增加而增高，但IL－13Rα1和TGF－β的表达量则无明显变化；siRNA干扰后IL－13Rα2 mRNA的表达量显著下降，TGF－β的表达量明显增高（ P＜0．05）；细胞免疫荧光标记亦显示，沉默后IL－13Rα2蛋白表达显著降低，而TGF－β的表达量升高。结论： IL－13Rα2很可能通过竞争性抑制IL－13Rα1与IL－13结合，进而抑制IL－13所致的纤维化作用。
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一氧化氮合成酶在培养海马神经细胞上的分布及其激活对细胞兴奋性的影响
目的:观察一氧化氮合成酶(NOS)在培养海马神经细胞上的分布情况和酶激活时对细胞兴奋性的影响.方法:NOS的分布情况采用免疫荧光标记方法,细胞兴奋性的变化采用膜片钳全细胞的模式来记录膜电位的变化.结果:发现两种结构型NOS包括nNOS和eNOS均分布在神经元上.另外,eNOS还分布在胶质细胞上.当给予NOS的底物L-精氨酸时,海马神经元的膜电位出现去极化,并产生动作电位.结论:以上结果显示NOS广泛分布在海马神经细胞中,当其激活时对海马神经元有兴奋作用.
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牛磺酸对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞凋亡的防护研究
目的 观察高糖培养条件及牛磺酸干预视网膜Müller细胞的凋亡变化,探讨牛磺酸对早期糖尿病视网膜Müller细胞的保护作用.方法 取出生后3 d的SD大鼠视网膜,分离纯化培养视网膜Müller细胞;经预实验选取25 mmol/L葡萄糖作为高糖培养条件,实验分为6组:正常组;高糖+0.1 mmol/L牛磺酸组;高糖+1 mmol/L牛磺酸组;高糖+5 mmol/L牛磺酸组;高糖+10 mmol/L牛磺酸组,用原位缺口末端标记法(TUNEL)法检测视网膜Müller细胞凋亡并观察牛磺酸的防护效应.结果 神经胶质酸性蛋白(glia1 fibrillary acid protein, GFAP)和S-100荧光双染鉴定纯化培养的视网膜Müller细胞均被双染;牛磺酸干预后TUNEL阳性细胞数量明显减少,并呈一定剂量的关系效应,1～10 mmol/L牛磺酸干预TUNEL阳性细胞显著低于高糖培养组(P＜0.01).结论 牛磺酸能够呈剂量依赖性地抑制高糖所致视网膜Müller细胞凋亡.
