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支气管哮喘患者外周血T淋巴细胞凋亡及相关基因的表达
我们对哮喘患者的外周血T淋巴细胞的活化诱导细胞凋亡(AICD)及影响细胞凋亡的分子调控机制进行了检测和分析,以期为揭示哮喘的慢性气道炎症机制提供依据。 对象与方法按1997年《支气管哮喘防治指南》[1],选择初治哮喘患者10例为哮喘组,男、女各5例,平均 (35.8±10.3)岁。选择10名无吸烟史的健康人为对照组,男、女各5例,平均(35.9±11.0)岁。于淋巴细胞分离液中分离外周血单个核细胞(PBMC),尼龙毛柱分离出T淋巴细胞。一部分加入PHA-P液(终浓度为10 μg/ml)和IL-2(终浓度为50U/ml),另一部分仅加入IL-2(终浓度为50 U/ml),然后同时体外培养24 h。回收培养T细胞用AnnexinV法和碘化丙啶(PI)染色法检测T细胞凋亡。AnnexinV凋亡检测试剂盒购自美国Pharmingen公司,按说明书进行免疫荧光标记和流式细胞分析。PI染色法:将细胞加入75%乙醇,-20℃冻存12 h以上。检测前取出细胞加入PI、RNAase,避光孵育15 min后行流式细胞分析。用荧光素(FITC)-Fas单抗及藻红素(PE)-CD3单抗标记,流式细胞检测T细胞膜表面Fas受体的表达情况。用TRIZOL反应剂提取培养T细胞的总RNA,用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增Bax、Bcl-XL特异性基因片段。特异性引物序列(Bax:5′GGACCCGGTGCCTCAGGA,3′CAAAGATGGTCACGGTCTGC;Bcl-XL:5′TTGGACAATGGAC TGGTTGA,3′GTAGAGTGGATGGTCAGTG)及反应条件参照文献[2]。通过凝胶图像扫描及分析系统,以扩增的特异性DNA片段的荧光强度与同时扩增的内参照GAPDH片段的荧光强度比值作为特异性扩增片段的半定量检测值。统计学分析采用F检验、t检验、直线相关分析。