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一株HIV1变异株的发现
我们在进行序列分析过程中发现一株不同于以往国内外报道的新型HIV1的变异毒株。现报道如下:1 材料和方法1.1 前病毒DNA的提取某HIV1感染者300μLEDTA抗凝血,使用Promega公司的DNA提取试剂盒(Wizard GenomicDNA Purification Kit)提取HIV1前病毒DNA。1.2 HIV env基因c2-v3区的套式PCR扩增 以所提的HW1前病毒DNA为模板,利用一对外侧引物EP1,EP2(序列为,EP1:5'-GGCAGTCTAGCA-GAAGAAGAGG-3':EP2:5'-CCTACTTC-C TGCCACATG-3')和一对内侧引物EP3,EP4(序列为,EP3:5'-GATCTGA-CAATTTCACGAACAAT TGC-3';EP4:5'-C TGGGTCCCCTCCTGAAGGATG-3')进行nested-PCR反应。反应条件为94qC30s,55℃30s,72℃30s,35个循环;72℃C5min结束扩增。1.3 PCR扩增片段的克隆P CR扩增的特异性片段经Promega公司的PCR产物纯化试剂盒(WizardPCRprepsDNA pu-rification system)纯化后,与PGEM-T载体连接克隆于JM109宿主菌中
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先天性巨结肠症RET和EDNRB基因的突变
目的:了解中国人群先天性巨结肠症(HD)发病与RET基因,EDNRB基因突变的关系,及同一患者是否两个基因同时突变的状况.方法:随机将HD患者分2组,即检测RET/EDNRB组(A组)56例及EDNRB组(B组)40例,同时设二个相同数量对照组(C组).每人采集外周静脉血2-3 mL经盐析法提取DNA后,应用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)方法,对RET基因20个外显子中的第6,13,15,17外显子(E6,13,15,17)和EDNRB基因7个外显子中的第4,5,6外显子(E4,5,6)进行基因突变的检测,将突变样品进行自动测序分析.结果:A组中2例散发性患者的E13,E17扩增片段在SSCP分析时有泳动变位,并经DNA自动测序仪检测为基因多态,CTG→CTT,Leu769→Leu,散发性突变频率为4%(2/48);2例家族性患者的E15扩增片段在SSCP分析有泳动变位,DNA测序1例为错义突变Lys889→Thr,另1例为两个同义突变GTGAAGAGGAGCCA→GTTAAGAGGAGTCA分别在V906和S909密码子上,家族性突变频率为25%(2/8);1例散发性短段型患者EDNRB基因E5在SSCP分析时有泳动变位未能测序;B组中1例散发性短段性患者EDNRB基因的E4在SSCP分析有泳动变位,经DNA测序证实在核苷酸位点831,密码277上G→A的置换,Leu277→Leu为司义突变,突变频率为2.7%(1/37),家族性3例患者未检测出突变.C组未检出RET,EDNRB基因的突变.家族性患者与散发性患者RET突变结果经统计学处理x2=4.95,P<0.05,OR=8,OR95CI=1.28-49.87.结论:中国人群的先天性巨结肠症发生确实与RET和EDNRB基因突变有关,家族性HD患者RET基因突变达25%,散发性HD患者主要以EDNRB基因突变为主,无1例患者有RET和EDNRB两个基因同时突变.同时显示有家族史比没有家族史发生HD的危险性大8倍,其可信限在95%.
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支气管哮喘患者外周血T淋巴细胞凋亡及相关基因的表达
我们对哮喘患者的外周血T淋巴细胞的活化诱导细胞凋亡(AICD)及影响细胞凋亡的分子调控机制进行了检测和分析,以期为揭示哮喘的慢性气道炎症机制提供依据。 对象与方法按1997年《支气管哮喘防治指南》[1],选择初治哮喘患者10例为哮喘组,男、女各5例,平均 (35.8±10.3)岁。选择10名无吸烟史的健康人为对照组,男、女各5例,平均(35.9±11.0)岁。于淋巴细胞分离液中分离外周血单个核细胞(PBMC),尼龙毛柱分离出T淋巴细胞。一部分加入PHA-P液(终浓度为10 μg/ml)和IL-2(终浓度为50U/ml),另一部分仅加入IL-2(终浓度为50 U/ml),然后同时体外培养24 h。回收培养T细胞用AnnexinV法和碘化丙啶(PI)染色法检测T细胞凋亡。AnnexinV凋亡检测试剂盒购自美国Pharmingen公司,按说明书进行免疫荧光标记和流式细胞分析。PI染色法:将细胞加入75%乙醇,-20℃冻存12 h以上。检测前取出细胞加入PI、RNAase,避光孵育15 min后行流式细胞分析。用荧光素(FITC)-Fas单抗及藻红素(PE)-CD3单抗标记,流式细胞检测T细胞膜表面Fas受体的表达情况。用TRIZOL反应剂提取培养T细胞的总RNA,用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增Bax、Bcl-XL特异性基因片段。特异性引物序列(Bax:5′GGACCCGGTGCCTCAGGA,3′CAAAGATGGTCACGGTCTGC;Bcl-XL:5′TTGGACAATGGAC TGGTTGA,3′GTAGAGTGGATGGTCAGTG)及反应条件参照文献[2]。通过凝胶图像扫描及分析系统,以扩增的特异性DNA片段的荧光强度与同时扩增的内参照GAPDH片段的荧光强度比值作为特异性扩增片段的半定量检测值。统计学分析采用F检验、t检验、直线相关分析。
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阿尔茨海默病患者线粒体CO2基因片段的突变分析
长片段和短片段的巢式聚合酶链反应(PCR)已经成为监测DNA片段缺失的常用手段,2000年,我们利用PCR及巢式PCR技术扩增了阿尔茨海默病(AD)患者29例老年人(65~84岁)的编码910 bp细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ的mtDNA片段(CO2),通过扩增片段的多态性分析和CO2片段的序列分析进一步探讨CO2基因缺失、重排和碱基突变在AD发生发展中的作用.
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人类X染色体短串联重复序列基因座在群体遗传学中应用的研究进展
人类X-染色体短串联重复序列(short tandem repeat,STR)是指存在于X-染色体上特异碱基短串联重复片段,其重复单位为2~6个核苷酸,又称微卫星DNA(microsatellite DNA).由于人类染色体STR,拥有扩增片段短、稳定性好、多态信息含量高、分型技术简单快速、所得结果可靠、灵敏度高、并且普遍存在等优点,因此常染色体和Y染色体STR在人类群体遗传学及相关领域已得到了广泛的应用.人类X染色体STR在过去受到的关注和应用相对较少,但是由于其除具备上述特点外,还具有某些独特性,因此近些年来在相关领域也逐渐受到重视,并初露锋芒.现将人类X-STR在群体遗传学中应用的研究进展情况综述如下.
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临床诊断中的实时PCR技术(文献综述)
目前,DNA分析技术已被广泛应用于临床,包括分子遗传学、肿瘤学、微生物学、血液学及免疫学,其中许多技术依赖于靶分子的PCR扩增及扩增后分析,如限制性酶切与凝胶电泳以检测特异性扩增片段.这种定性检测重复性差,可靠性低,易给临床诊断带来混乱,而实时PCR的出现实现了DNA的定量分析,明显提高了诊断的特异性、灵敏度,快速、简单、自动、有效.有多种反应平台可以完成实时PCR分析,如Roche Light Cycler、ABI Prism7700、PE5700和超速热循环仪等.
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雌激素受体β基因多态性与血脂水平的研究
雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)是配体依赖转录活性因子超家族成员之一,该家族中还包括类固醇激素受体、甲状腺激素受体、维生素D3受体及维甲酸受体等等[1].研究发现,ER可分为两种亚型,即ERα和ERβ.人ERβ基因在5号外显子的配体结合区(1 082号核苷酸)可发生G→A点突变,8号外显子的3'非编码区(1 730号核苷酸)可发生A→G点突变,当这两处点突变发生后则分别出现限制性内切酶RsaI和AluI的识别位点,因此酶切ERβ基因的扩增片段便可区分出ERβ的不同基因型.ERβ基因的这种多态性可能会影响不同个体ERβ的表达水平或功能上的差异,进而影响体内雌激素生物学作用的发挥,例如雌激素预防动脉粥样硬化的作用.故ERβ基因多态性可能与心血管疾病的发生存在一定的联系[2].
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PCR定点突变法构建人抗菌肽FALL-39基因突变体及其功能的研究
目的:用PCR定点突变法构建人抗菌肽FALL-39基因突变体,并比较研究FALL-39及其突变肽的功能.方法:采用PCR体外定点突变技术(PCR-SDM),设计一对方向相反的引物,其中一个引物引入一个突变点,应用高保真的Polybest DNA 多聚酶进行含FALL-39肽的PGEXλ1T质粒的PCR扩增,使FALL-39第22位密码子由CAG突变为AAG,将扩增片段自身连接后克隆入工程菌JM109中使其表达其突变肽(FALL-39-lys22),纯化后与FALL-39进行抗菌活性比较.结果:DNA测序结果表明在预期位点发生突变,突变后FALL-39-lys22抗菌活性增强,在抗菌剂量时对红细胞的溶解作用未见明显增加,较大剂量时对红细胞的溶解作用略有增加.
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新疆柯尔克孜族pMCT118、apoB、p33.6三个位点的扩增片长段度多态性的研究
目的:通过对柯尔克孜族VNTR三个位点的调查研究,了解柯尔克孜族pMCT118、apoB、p33.6的扩增片段的长度多态性.方法:使用PCR技术分析检测,并对检测结果进行遗传学统计分析.结果:pMCT118检出23个等位基因,65个基因型;apoB检出13个等位基因,37个基因型;p33.6检出14个等位基因,32个基因型.结论:柯尔克孜族存在汉族没有的基因,所谓查的数据可作为个人识别和亲子鉴定的计算参数.
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广东汉族人群ABO扩增片段限制性长度多态性调查
1990年,Yamamoto等[1]首次报道了ABO各等位基因核苷酸序列的差异.随后,Lee和Chang等[2]采用PCR-RFLP方法进行ABO基因型检测.
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广西壮汉群体3个STR基因座的遗传多态性
STR广泛存在于人类基因组中.其多态性好,易于扩增,且扩增片段短 (100~500bp),多个STR基因座的联合使用完全能达到同一认定[1、2].国内有关D16S539、D7S820、D13S317基因座的人群调查资料相对较少.本文作者对上述基因座在广西壮、汉群体中的遗传多态性进行了研究.
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STR FGA基因座变异 1例
在采用 PCR-STR技术进行亲子鉴定的案例中,发现 1例 FGA基因座变异,现报道如下。 1 案情摘要 某男( 35岁,汉族)和某女( 32岁,汉族)携 " 儿子 " 来本室要求做亲子鉴定。 2 检验过程 分别抽取该女、 " 儿子 " 及该男静脉血各 1ml,用 Na2EDTA. 2 H2O抗凝,分别标明 1号 " 、 2号 " 、 3号 " ,备检。用 Chele x-100 提取 1号、 2号、 3号检材的 DNA,然后进行 F13A01、 FES/FPS、 D1 9S253、 TPOX、 D7S820、 D12S391、 CYP19、 TH01、 FGA、 D3S1359、 D13S317、 FOLP2 3、 GABRB15、 CSF1P0、 vWA、 D5S818、 D7S2846、 D2S441、 D3S1358、 D7S221共 20个座位的 PCR扩增,扩增产物用含 4mol/L尿素、 0.5mm厚的变性聚丙烯酰胺凝胶( T6%、 C5%)电泳分离、银染,得到各位点的扩增片段长度多态性图谱。根据扩增片段电泳迁移的距离,借用顶蓬原则,参考各座位在中国汉族人群的基因频率分布资料进行各位点基因型命名,并计算父权概率( RCP)小值。结果显示,本案检验的 20个 STR座位除 FGA外有 19个座位的结果符合孟德尔遗传定律,经计算 RCP大于 99.99%,认定亲权关系。孩子仅 FGA 座位在父亲的基因型中(杂合子)找不到相同的基因,不符合孟德尔遗传定律 ,推测 FGA座位存在突变。