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人防御素-α克隆表达纯化及生物活性初步检测
防御素(Defensin)是一类阳离子大环形多肽,在人体多种器官和组织广泛存在,起着重要的屏障防御作用,对G+/-菌、真菌及病毒都有杀灭作用.临床观察表明,测定血浆及各种体液中防御素的改变有助于某些炎症性疾患的诊断,如脓毒症、细菌感染及早产等.此外,提纯或重组防御素作为"超级抗生素"来取代传统的抗生素已成为药学界的研究热点.本研究拟在大肠杆菌中表达人防御素-α,建立稳定表达的工程菌和纯化、复性技术途径,获得活性蛋白,为进一步研究提供材料.
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幽门螺杆菌细胞毒素相关抗原A的表达纯化及其临床研究
目的:cagA+Hp的感染与胃癌的相关性在亚洲有不同报道,本研究应用重组幽门螺杆菌毒素相关抗原A(cagA)建立检测血清中抗CagA抗体的方法,以探讨本地区cagA+Hp的感染与胃癌的相关性.方法:构建表达幽门螺杆菌Cagg抗原的表达载体,工程菌经IPIG诱导,表达的CagA包含体经Ni柱纯化,变性、复性、透析并经活性鉴定后,抗原被点在硝酸纤维素膜上或用以包被ELISA板,建立检测正常人及胃癌患者血清抗Cag3抗体的DIGFA(斑点金免疫渗滤试验,简称滴金法)和ELISA法.结果:重组克隆pltSETcagA的工程菌可表达M36000的目的蛋白,表达形式为包含体;CagA包含体经纯化后SDS-PAGE显示纯度达98%以上,活性经ELISA证实;正常人64例及胃癌患者血清50例中,cagA+Hp的感染率分别为29.7%和62%,胃癌患者cagA+Hp的感染率明显高于正常人(P＜0.01).结论:我们建立的检测血清抗CagA抗体的DIGFA和ELISA均具有良好的可重复性;胃癌患者cagA+Hp的感染比例明显高于正常人,CagA阳性幽门螺杆菌的感染与胃癌有关,CagA可作为制备防治caen+Hp感染的疫苗的后备抗原.CagA可作为幽门螺杆菌疫苗制备的候选抗原,检测患者血清幽门螺杆菌CagA抗体,有可能为胃癌的发生提供预警作用.
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紫穗槐-4,11-二烯合酶及其代谢工程研究进展
紫穗槐-4,11-二烯合酶催化FPP(farnesyl pyrophosphate,法尼基焦磷酸)生成青蒿素前体紫穗槐4,11-二烯.是青蒿素生物合成途径中的关键酶.本文对紫穗槐-4,11-二烯合酶的分子生物学和代谢工程研究进行了综述.紫穗槐-4,11-二烯合酶编码基因及其相关核酸序列已经得到了克隆.紫穗槐-4,11-二烯合酶cDNA全长1 641bp,编码546 aa.紫穗槐-4,11-二烯合酶适pH范围较宽,但需要二价金属离子作为辅酶才能发挥作用,其产物和底物的特异性不高.在紫穗槐-4,11-二烯合酶作用下,FPP首先进行的足1,6-合环,然后是1,1O-合环,形成紫穗槐-4,11-二烯.由于紫穗槐-4,11-二烯介酶在青蒿素生物合成中具有重要的意义,自从其基因被克隆测序后,先后被导入E.coli、S.cereviseae、烟草、拟南芥和A.nidulans,获得了能产生紫穗槐-4,11-二烯的各种工程菌或细胞,研究通过不同方式提高工程菌中紫穗槐-4,11-二烯产量的方法.
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重组人锰超氧化物歧化酶工程菌高效表达培养工艺的研究
目的确定重组人锰超氧化物歧化酶(rhMn-SOD)工程菌高效表达的适培养工艺条件.方法通过摇瓶培养研究了包括接种量、诱导时机、Mn2+浓度、诱导后培养时间、发酵过程中pH变化以及初始pH值对发酵的影响.结果该工程菌的佳接种量为3%,佳诱导时机为接种后3h,确定Mn2+浓度为6000μmol@L-1,诱导后培养5 h,在培养过程中当pH为6.83时外源蛋白可获得高效表达,初始pH确定为8.0.结论:诱导和培养基的pH是影响工程菌发酵的主要因素,尤其是Mn2+的加入表达有活性的rhMn-SOD是必需的.
关键词： 重组人锰超氧化物歧化酶 工程菌 培养工艺 -
工程菌表达融合型酯酶B1发酵条件的优化
目的 提高酯酶B1融合蛋白的表达量,研究pThioHisA-B1/DH5a工程菌株的优发酵条件.方法 依次在不同的培养基(LB,SOB,YT,TB)、诱导时间(1-8 h)、诱导剂浓度(0.3-1 mmol/L)、诱导温度(25～37℃)等因素变化下,研究融合蛋白的表达量;目的 产物经SDS-PAGE电泳和薄层凝胶扫描,以获得佳表达条件.结果 工程菌优化的发酵条件为,适宜的培养基为TB,诱导剂IPTG的佳浓度为0.4 mmol/L,佳诱导时间为6 h,佳诱导温度为28℃.工程菌在佳条件下表达时,融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的40.3%,其中66.2%为可溶性蛋白.结论 本实验筛选出了工程菌的优化发酵条件,利用本实验的优化条件可获得高产量、可溶性的酯酶B1融合蛋白,为酯酶B1的进一步放大生产和实际应用奠定了基础.
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去除重金属的工程菌对小鼠的毒性
目的研究去除重金属的工程菌R32被排放到环境中后对小鼠的毒性.方法采用4种受试物(处理液1:分别含1、2、5、10g/L纯培养的R32菌体;处理液2:取处理20 mg/L铬液2 h的R32按处理液1方法配制;处理液3:含50 g纯培养的R32菌体在1、3、5和7 d内的分泌物溶液;处理液4:取处理20 mg/L铬液2 h的R32按处理液3方法配制)分别对昆明种小鼠进行急、慢性毒性实验,蓄积毒性实验,小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验和小鼠精子畸变试验,观察吸附重金属铬前后的工程菌R32及其分泌物对小鼠的毒性.结果急性毒性实验的各实验组的小鼠全部存活,进食增加且精神状态和生长发育良好,活动、排便、外观均未见异常.慢性毒性实验的各实验组的小鼠全部存活,进食量有不同程度增加,精神状态良好,活动和反应能力无异常.给予处理液1、3、4的各实验组小鼠未见中毒症状,全部存活,而给予处理液2的各实验组小鼠在染毒12 d后开始出现进食量减少,体重增长减缓;14 d后部分小鼠体重开始降低;19 d后开始出现2只死亡雌性小鼠.给予处理液1、3、4的各实验组小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率与阴性对照组差异无统计学意义(P＞0.05),可见,未吸附铬的R32及其吸附铬前后的分泌物均不会引起小鼠骨髓嗜多染红细胞微核发生率升高.给予处理液2的各实验组小鼠中,1、2、5 mg/L投菌量的实验组与阴性对照组相比,微核率差异无统计学意义(P＞0.05);10mg/L投菌量的实验组微核率高于对照组且有统计学意义(P＜0.01).给予处理液1、2、3、4的各实验组精子畸变率与阴性对照相比,差异均无统计学意义(P＞0.05).结论吸附铬前的R32及其在吸附前后所分泌的分泌物对小鼠均无急性毒性、慢性毒性和蓄积毒性;吸附铬后的R32对小鼠的急性毒性、慢性毒性以及精子畸变的影响不明显,但有一定的蓄积毒性,对小鼠的微核率也有一定的影响.
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从工程菌中纯化重组钙调素的方法建立
钙调素(CaM)是从低等到高等生物中普遍存在的一种蛋白质,参与众多的刺激-反应偶联和介导许多钙依赖的生理过程,是普遍存在于真核细胞内的Ca2+受体蛋白,由148个氨基残基组成的小分子酸性蛋白,是细胞内信号传导系统的重要成分[1].
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重组人胰岛素样生长因子1工程菌的高密度发酵
背景:胰岛素样生长因子1是人体内重要的细胞调控因子,已用于治疗糖尿病等多种疾病,工程菌发酵生产工艺研究是胰岛素样生长因子1实现产业化从而扩大临床应用的关键因素.目的:探讨表达重组人胰岛素样生长因子1工程菌的高密度发酵与表达条件.设计、时间及地点:酶基因工程实验,于2007-05/2008-05在浙江树人大学生物技术实验室完成.材料:重组人胰岛素样生长因子1大肠杆菌表达菌株E. coil BL21(DE3)/pET22a-IGF-1由浙江树人大学生物技术实验室保存.高密度发酵补料培养基为:葡萄糖300 g/L,蛋白胨40 g/L,酵母粉10 g/L,Na2HPO4280 mmol/L,NaH2PO4·2H2O 120 mmol/L,MgSO4 10 mmol/L,氨苄青霉素100 mg/L.方法:菌株活化后,进行摇瓶发酵试验,分别改变培养基种类、诱导剂异丙基硫代半乳糖苷浓度、诱导时间等参数,优化摇瓶发酵条件.依据摇瓶发酵优化条件,采用自控5 L发酵罐进行分批补料发酵试验.培养分分批培养和分批补料2个阶段.采用pH反馈流加的方式补料,在对数生长中后期开始诱导,加入异丙基硫代半乳糖苷至设计终浓度,培养4-6 h.主要观察指标:重组人胰岛素样生长因子1工程菌的发酵与产物表达情况.菌体浓度与菌体干重测定,目的蛋白表达量的测定,发酵液葡萄糖浓度的测定.结果:以2×YT+5 g/L葡萄糖为发酵培养基.经0.8 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷诱导5 h,通过控制溶解氧以及pH反馈补料方式,实现工程菌高密度发酵与目的蛋白高效表达,每升发酵液收获干菌体50.1 g/L,重组人胰岛素样生长因子1含量达5.25 g/L.结论:实验成功建立了重组人胰岛素样生长因子1工程菌优化的高密度发酵工艺,为重组人胰岛素样生长因子1的卜游纯化和工业化生产奠定了基础.
关键词： 人胰岛素样生长因子1 工程菌 高密度发酵 -
bFGF发酵中以乳糖为诱导剂初探
重组牛碱性成纤维细胞生长因子(融合蛋白,bFGF)是被广泛应用的基因工程产品.在bFGF发酵生产中所采用的菌种含有乳糖操纵子,对抗生素具有抗性的工程菌.常用方法采用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)做为诱导剂,可调节Lac启动子,使目的基因片段得以表达获得所需要的目的蛋白.
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GX1-rmhTNFα 工程菌发酵及表达产物的纯化
目的:全面检定GX1-rmhTNFα工程菌,并建立稳定的发酵及纯化工艺.方法:对GX1-rmhTNFα工程菌进行全面检定,挑取目的蛋白表达水平高的菌种扩大培养；采用5L发酵罐,32℃培养工程菌至菌体A600值达4～6时,42℃诱导约4h后收菌,发酵过程控制pH值在7.2,溶氧在30％左右,采用梯度流加的方法补料,连续发酵3批,验证发酵工艺的稳定性；发酵产物经硫酸铵分段盐析及透析处理后,经SP-Sepharose FF及Q-Sepharose FF层析纯化,收集洗脱峰进行纯度、浓度、活性及Western blot分析.结果:工程菌经全面检定,证实构建正确,目的蛋白表达量不低于10％,菌种稳定性较好,呈典型的大肠杆菌特征,适合建立工程菌菌库；连续发酵3批,湿菌收量均不低于200g,目的蛋白表达水平均在10％以上；目的蛋白经柱层析纯化,终纯化产物蛋白含量为0.901mg/ml,活性为5.97x108IU/ml,纯度可达95％以上,Western blot分析显示,目的蛋白可与鼠抗人TNF单抗特异性结合.结论:初步建立了稳定可行的GX1-rmhTNFα融合蛋白的发酵及纯化工艺.
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响应面法优化产低温脂肪酶工程菌Cl02的发酵条件
目的 采用响应面法优化产低温脂肪酶工程菌C102的 发酵条件.方法 通过单因素试验考察培养基中酵母氮源含量、pH值、甘油含量和甲醇含量对酶活的影响,确定产酶的主要影响条件,在此基础上,根据Box-Benheken中心组合试验设计原理,采用三因素三水平的响应面分析法,综合考察各因子对低温脂肪酶酶活的影响,建立低温脂肪酶酶活的二次回归模型.结果 培养基中酵母氮源含量、pH值和甲醇含量对酶活的影响显著.适产低温脂肪酶条件为:酵母氮源含量7.3 g/L、pH6.0、甲醇含量9.1 g/L,在此条件下,低温脂肪酶酶活可达42.25 IU/ml,比优化前(28.0 IU/ml)提高了50.9％.结论 利用响应面法优化的发酵条件可显著提高工程菌的产酶能力,为规模化生产低温脂肪酶奠定了基础.
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pUC118-ski/DH5α工程菌发酵工艺的优化
目的 优化pUC118-ski/DH5α工程菌的发酵工艺.方法 筛选高拷贝质粒工程菌,通过优化培养基组分、发酵温度、补料成分和补料方式及培养时间,确定佳发酵参数；以佳发酵参数在50 L发酵罐中连续发酵3批,验证优化的发酵工艺的重复性.结果 佳发酵参数为:以甘油为碳源的培养基,发酵温度25℃,以50％Glycerol梯度恒速流加方式补料,培养时间为12 h；以佳发酵参数在50 L发酵罐中连续发酵3批工程菌,菌体湿重和质粒含量分别达52.7～60.3 g/L和1.79～1.95 mg/g湿菌,质粒拷贝数为1012 copies/μl,超螺旋质粒的比例达90％以上.结论 优化了pUC 118-ski/DH5α工程菌的发酵工艺,为重组质粒的规模化生产及下游纯化奠定了基础.
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重组人干扰素α2b工程菌的生物学特性检测
目的观察和了解重组人干扰素α2b(以下简称rhIFN-α2b)工程菌的生物学性质,保证产品质量稳定. 方法通过对rhIFN-α2b工程菌的微生物学、分子生物学和免疫学检测,全面了解工程菌的性质.结果 rhIFN-α2b工程菌呈现典型的大肠杆菌形态,在甘油中可以贮存1年,在冻干条件下可以保存2年,其生物学特性比较稳定.结论 rhIFN-α2b工程菌生物学特性稳定不变.
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重组铜绿假单胞菌外毒素A 工程菌发酵及表达产物的纯化
目的建立稳定、高效表达重组铜绿假单胞菌外毒素A(rEPA)的工程菌发酵及表达产物纯化工艺.方法规模化发酵表达rEPA的重组大肠杆菌rPE553D,离心收集菌体,渗透压调解使菌体周质间隙蛋白释放后,高速离心收集蛋白溶液.经DEAE Sepharose FF、Phenyl Sepharose 6FF疏水层析和SOURCE 30Q强离子交换层析,超滤浓缩纯化rEPA.用HPLC、SDS-PAGE和Western blot等方法检定生化和免疫学特性,并用小鼠和Vero细胞检定毒性.结果每55 L培养基中rEPA产量超过4 g,纯度在95%以上,细胞毒性降低了至少32 000倍.其余各项指标均符合<中国生物制品规程>要求.结论已建立了收率高、纯度好、稳定、适合规模化生产rEPA的工艺.
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重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵及表达产物的纯化
目的 建立重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵和目的蛋白纯化工艺.方法 在三角烧瓶中,探讨不同的诱导剂浓度和培养基对菌体密度和目的蛋白表达量的影响;在10 L发酵罐中,探讨诱导时间、补料方式、溶氧量对菌体密度和目的蛋白表达量的影响.根据目的蛋白的理化特性建立纯化工艺.结果 重组HEV抗原工程菌在10 L发酵罐分批补料培养中,采用0.1 mmol/L的IPTG诱导4 h,目的蛋白表达量约为25%,目的蛋白产率约为2.88g/L,且以包涵体形式存在.经过对包涵体粗纯、复性、纯化,SDS-PAGE分析,纯度可达95%以上.结论 建立了周期短、产率高且稳定可靠的发酵及纯化工艺,为重组HEV抗原的大规模生产奠定了基础.
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重组质粒DNA D-GPEi工程菌发酵工艺的优化
目的 优化重组质粒D-GPEi工程菌发酵工艺条件.方法 控制相关发酵参数,观察溶解氧浓度、比生长速率和培养时间对工程菌生长和质粒浓度的影响.结果 发酵培养对数生长期溶解氧浓度控制在30%～50%.补料前比生长速率为0.5～0.7/h,6 h开始补料,比生长速率下降,12 h后比生长速率为0.1～0.2/h.连续发酵3批工程菌,21 h后收集菌体,得到菌体平均产量为89.4 g/L(A=52.6),质粒平均产量为359.8 mg/L.3批工程菌浓度和质粒拷贝数差异无显著意义.结论 此发酵工艺得到工程菌浓度和质粒拷贝数较高,重复性好,适用于大规模工业化生产.
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重组人B7-H1IgV工程菌生物学特性的稳定性
目的 检测重组人B7-H1IgV(rhB7-H1)工程菌生物学特性的稳定性.方法 将重组质粒pQE30-B7-H1IgV转化的大肠杆菌rhB7-H1/DH5α工程菌连续传代50代,每隔10代进行工程菌B7-H1IgV蛋白表达量检测、扫描电镜观察、革兰染色、各项生化反应及质粒的酶切鉴定.结果 各代工程菌中B7-H1IgV蛋白的表达量均为菌体总蛋白的10％左右；各代工程菌提取的质粒双酶切后均可见381 bp的目的基因片段；各代工程菌均呈典型的大肠杆菌形态,革兰染色显示为阴性杆菌,各项检测结果与原始菌种无显著差异.结论 该工程菌生物学特性稳定,可作为生产用菌种用于大规模生产.
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重组人aFGF工程菌发酵条件的优化
目的 优化重组人酸性成纤维细胞生长因子(rhaFGF)工程菌的发酵条件.方法 采用分批补料方式,在菌体快速生长阶段,通过变速流加碳源和氮源,控制流加比例,调节pH值和溶解氧(DO)含量,实现工程菌的高密度发酵及目的 蛋白的高效表达.结果 当碳源与氮源流加比例为3∶1时,菌体湿重可达145 g/L,干重达36 g/L,目的 蛋白表达量达28.9%;DO控制在20%时,全菌体和裂解液中目的 蛋白的表达量均高,分别可达29.11%和44.28%.结论 已初步优化了rhaFGF工程菌的发酵条件.
关键词： 人酸性成纤维细胞生长因子 工程菌 发酵 溶氧量 -
治疗性双质粒HBV DNA疫苗工程菌的中试发酵工艺研究
目的 研究双质粒HBV DNA疫苗工程菌的中试发酵工艺.方法 首先通过计算质粒拷贝数,检测工程菌DH5α/pS2.S和DH5α/pFP在传代过程中的遗传稳定性,通过摇瓶培养确定培养基组成,再在30 L发酵罐内,通过改变培养基成分、培养时间、补料方式,确定佳发酵参数.并将确定的佳发酵参数应用于50 L发酵罐连续3批中试规模的发酵,同时考察在发酵培养过程中质粒稳定性和超螺旋质粒DNA的比例.结果 工程菌DH5α/pS2.S和DH5α/pFP在连续传代30次后,质粒拷贝数保持稳定.确定佳发酵参数为以甘油为碳源的培养基培养,梯度恒速流加方式补料,培养时间为10 h.通过3批稳定发酵,终可获得湿菌58.0～71.8 g/L,质粒含量可达到1.11～1.58 mg/g菌,超螺旋质粒DNA的比例达93%以上.结论 已建立了稳定的双质粒HBV DNA疫苗工程菌中试发酵工艺,为进一步规模化生产奠定了基础.
关键词： 治疗性HBV DNA疫苗 工程菌 发酵 -
重组HIV-1DNA疫苗工程菌中试发酵工艺的优化
目的 优化重组HIV-1 DNA疫苗工程菌的中试发酵工艺.方法 优化质粒转化条件,制备工程菌Jm109/pVAX1-MEGp24种子液,连续传30代,检测其遗传稳定性;优化培养基成分、补料基质、补料方式和培养时间,确定佳发酵参数;并应用佳发酵参数,于50 L发酵罐进行3批中试规模的发酵,考察在发酵培养过程中质粒的稳定性和超螺旋质粒的比例.结果 工程菌在连续传代30次后,质粒拷贝数基本保持稳定;佳发酵参数为:采用以甘油为碳源的培养基,以梯度恒速流加方式补料,培养时间13 h;通过3批稳定发酵.终可获得湿菌67.0～68.6 g/L,质粒含量可达1.62～1.73 mg/g菌,超螺旋质粒的比例达93%以上.结论 已建立了稳定的重组HIV-1 DNA疫苗工程菌中试发酵工艺,为进一步规模化生产奠定了基础.
