首页 > 文献资料
-
胰岛素样生长因子1的体内表达对BXSB小鼠发病影响的研究
目的初步研究人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)对系统性红斑狼疮BXSB小鼠发病的影响。方法用肌肉介导的电脉冲转基因技术，使得含有hIGF-1 cDNA的重组真核表达质粒在小鼠体内表达，然后系统检测自身免疫相关性实验指标。结果虽然hIGF-1促进雄性BXSB小鼠IgG类型抗DNA抗体的产生，但是明显阻止其尿蛋白浓度的继续升高，抑制巨噬细胞分泌IL-1以及降低脾脏重量。结论 IGF-1具有减缓雄性BXSB小鼠狼疮性肾炎的作用，其作用机制之一可能与巨噬细胞分泌炎性介质的功能下降有关。
关键词： 人胰岛素样生长因子1 BXSB小鼠 系统性红斑狼疮 -
人胰岛素样生长因子1基因在海绵体平滑肌细胞中的表达及定位
目的观察人胰岛素样生长因子1基因在海绵体平滑肌细胞中的表达及定位情况,为阴茎勃起功能障碍的基因治疗提供理论和实验依据.方法采用Lipofectamine 2000包裹PCDB-hIGF-1质粒和PCDB空载体,转染原代培养的大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞,转染后24 h分别采用RT-PCR法检测hIGF-1基因mRNA表达,Western blot法检测hIGF-1蛋白表达,荧光免疫细胞化学法检测hIGF-1细胞定位及蛋白表达.结果RT-PCR检测到hIGF-1 mRNA表达,Western blot和荧光免疫细胞化学法均检测到hIGF-1蛋白表达,荧光免疫细胞化学法可见hIGF-1蛋白定位于阴茎海绵体细胞胞质中.结论PCDB-hIGF-1成功转染入大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞,大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞可表达hIGF-1基因,蛋白定位于胞质.
关键词： 人胰岛素样生长因子1 海绵体平滑肌细胞 -
胰岛素样生长因子1基因转染成肌细胞促小鼠胫骨骨折愈合的作用
背景:随着基因治疗的研究发展,将转有胰岛素样生长因子1基因的细胞移植入损伤区,达到该基因在体内的持续表达已可行,并有可能解决骨折患者骨不连及骨延迟愈合等难题.目的:观察携带人胰岛素样生长因子1基因的成肌细胞体内局部多点注射对C57BL/6J小鼠胫骨骨折愈合的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-01/2008-04在汕头大学医学院完成.材料:8周龄雄性C57BL/6J小鼠42只,体质量22～25 g,建立左胫骨骨折的动物模型.方法:42只小鼠随机数字表法分为2组,每组21只.实验组于骨折处周围肌肉中多点注射0.3 mL转人胰岛素样生长因子1基因成肌细胞悬液;对照组注射0.3 mL生理盐水.分别在造模后2,3,4周每组各随机取7只小鼠处死,取材,行苏木精-伊红染色.主要观察指标:各组动物骨折部位形成骨痂面积的大小和组成成分的变化;外源性细胞在体内存活及表达人胰岛素样生长因子1情况;各组动物骨密度及骨痂细胞生长情况.结果:①实验组转基因成肌细胞BrdU及人胰岛素样生长因子1免疫组织化学染色均阳性,4周实验组平均灰度值虽稍高于2周实验组,但差异无显著性意义(P＞0.05).②携人胰岛素样生长因子1基因的成肌细胞移植入C57BL/6J小鼠胫骨骨折处周围肌肉中可存活4周以上,并能稳定地分泌人胰岛素样生长因子1.③实验组造模后各时间点外骨痂中小梁骨占骨痂总面积的百分比均高于对照组,其中第3,4周经F检验差异有显著性意义(P＜0.05);4周实验组骨痂骨密度高于对照组(P＜0.05).④电镜观察可见实验组骨生成细胞的数量、活跃程度和胶原纤维的数量、分布均优于对照组.结论:局部注射转人胰岛素样生长因子1基因的成肌细胞可以促进C57BL/6J小鼠胫骨骨折的愈合.
关键词： 人胰岛素样生长因子1 成肌细胞 骨折 小鼠 -
重组人胰岛素样生长因子1工程菌的高密度发酵
背景:胰岛素样生长因子1是人体内重要的细胞调控因子,已用于治疗糖尿病等多种疾病,工程菌发酵生产工艺研究是胰岛素样生长因子1实现产业化从而扩大临床应用的关键因素.目的:探讨表达重组人胰岛素样生长因子1工程菌的高密度发酵与表达条件.设计、时间及地点:酶基因工程实验,于2007-05/2008-05在浙江树人大学生物技术实验室完成.材料:重组人胰岛素样生长因子1大肠杆菌表达菌株E. coil BL21(DE3)/pET22a-IGF-1由浙江树人大学生物技术实验室保存.高密度发酵补料培养基为:葡萄糖300 g/L,蛋白胨40 g/L,酵母粉10 g/L,Na2HPO4280 mmol/L,NaH2PO4·2H2O 120 mmol/L,MgSO4 10 mmol/L,氨苄青霉素100 mg/L.方法:菌株活化后,进行摇瓶发酵试验,分别改变培养基种类、诱导剂异丙基硫代半乳糖苷浓度、诱导时间等参数,优化摇瓶发酵条件.依据摇瓶发酵优化条件,采用自控5 L发酵罐进行分批补料发酵试验.培养分分批培养和分批补料2个阶段.采用pH反馈流加的方式补料,在对数生长中后期开始诱导,加入异丙基硫代半乳糖苷至设计终浓度,培养4-6 h.主要观察指标:重组人胰岛素样生长因子1工程菌的发酵与产物表达情况.菌体浓度与菌体干重测定,目的蛋白表达量的测定,发酵液葡萄糖浓度的测定.结果:以2×YT+5 g/L葡萄糖为发酵培养基.经0.8 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷诱导5 h,通过控制溶解氧以及pH反馈补料方式,实现工程菌高密度发酵与目的蛋白高效表达,每升发酵液收获干菌体50.1 g/L,重组人胰岛素样生长因子1含量达5.25 g/L.结论:实验成功建立了重组人胰岛素样生长因子1工程菌优化的高密度发酵工艺,为重组人胰岛素样生长因子1的卜游纯化和工业化生产奠定了基础.
关键词： 人胰岛素样生长因子1 工程菌 高密度发酵 -
人胰岛素样生长因子-1真核双顺反子表达载体pIRSES2-EGFP-hIGF-1的构建与鉴定
目的:利用基因工程原理构建人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)全长基因的真核表达栽体pIRES2-EGFP-hIGF-1,并观察其在人胚肾293细胞中的表达.方法:应用PCR方法从人肝细胞文库中提取人hIGF-1全长cDNA序列,克隆入T-pMD18载体中,经测序证实序列正确后,利用XhoI/EcoRI进行双酶切并定向插入真核表达载体pIRES2-EGFP中,利用双酶切、电泳和PCR进行鉴定证实插入片段的正确性.应用高效转染试剂X-treme GENE HP DNA Transfection reagent介导真核表达载体pIRES2-EGFP-hIGF-1转染人胚肾细胞(HEK293),转染后利用倒置荧光显微镜与RT-PCR观察目的基因在靶细胞中的表达.结果:经酶切和测序证实重组质粒栽体构建正确,转染后48小时可观察到绿色荧光的表达,RT-PCR结果证实转染pIRES2-EGFP-hIGF-1后可有hIGF-1基因靶细胞中表达.结论:成功构建真核表达载体pIRES2-EGFP-hIGF-1,目的基因与标记基因可同时在靶细胞中表达,为后续研究奠定基础.
关键词： 人胰岛素样生长因子1 基因 载体 转染 -
胰岛素样生长因子1稳定表达CHO细胞株的建立
目的 建立稳定的高效表达胰岛素样生长因子1(IGF-1)的中国仓鼠卵巢细胞株(CHO),以便于大量生产纯化IGF-1蛋白.方法 采用脂质体将IGF-1的表达载体pSec-IGF-1导入CHO-K1细胞中.转染后用含潮霉素B(hygromycin B)的选择性培养液进行筛选,挑取耐药克隆,收集细胞培养上清,用Western blot法及ELISA法进行检测,并用免疫组化法对阳性克隆进行分析.结果 转染细胞在选择性培养液中生长出多个耐药克隆,Western blot检测示8个克隆表达上清出现与预计值相符的约7.7kDa的特异性条带;ELISA结果显示有2株表达量在2.0μg/ml以上;免疫组化检测,筛选到的阳性克隆细胞有IGF-1的表达.结论 建立了稳定的高效表达IGF-1的CHO细胞株.
关键词： 人胰岛素样生长因子1 基因转染 CHO细胞株 -
人胰岛素样生长因子1基因转染关节软骨细胞及其稳定表达
目的研究人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)基因转染关节软骨细胞获得稳定表达的可行性.方法用脂质体转染法将含有hIGF-1 cDNA的真核表达载体转染兔关节软骨细胞,经G418筛选,形成阳性细胞克隆.继续培养4周,原位杂交检测hIGF-1的表达,免疫细胞化学检测Ⅱ型胶原的表达.结果 G418筛选后所获得的阳性细胞克隆,原位杂交检测表明hIGF-1基因得到稳定表达,免疫细胞化学检测显示转染后的软骨细胞仍表达Ⅱ型胶原.结论外源性hIGF-1基因能够在软骨细胞内获得稳定表达,而转染后的软骨细胞仍能稳定表达Ⅱ型胶原.
关键词： 人胰岛素样生长因子1 软骨细胞 基因转染 表达
