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腺病毒载体介导shRNA抑制大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞PDE5基因表达的研究
磷酸二酯酶5型(PDE5)作为基因治疗勃起功能障碍(ED)的分子靶点目前已逐渐成为研究热点.我们构建了以大鼠PDE5(rPDE5)为靶基因的重组腺病毒表达载体,将重组腺病毒转染大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞后,通过细胞内转录产生的短发夹RNA(shRNA)来诱导针对rPDE5基因的RNA干扰(RNAi),并分别从mRNA和蛋白水平检测其对rPDE基因表达的抑制情况.现报告如下.
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人胰岛素样生长因子1基因在海绵体平滑肌细胞中的表达及定位
目的观察人胰岛素样生长因子1基因在海绵体平滑肌细胞中的表达及定位情况,为阴茎勃起功能障碍的基因治疗提供理论和实验依据.方法采用Lipofectamine 2000包裹PCDB-hIGF-1质粒和PCDB空载体,转染原代培养的大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞,转染后24 h分别采用RT-PCR法检测hIGF-1基因mRNA表达,Western blot法检测hIGF-1蛋白表达,荧光免疫细胞化学法检测hIGF-1细胞定位及蛋白表达.结果RT-PCR检测到hIGF-1 mRNA表达,Western blot和荧光免疫细胞化学法均检测到hIGF-1蛋白表达,荧光免疫细胞化学法可见hIGF-1蛋白定位于阴茎海绵体细胞胞质中.结论PCDB-hIGF-1成功转染入大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞,大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞可表达hIGF-1基因,蛋白定位于胞质.
关键词： 人胰岛素样生长因子1 海绵体平滑肌细胞 -
人降钙素基因相关肽重组腺相关病毒在原代培养大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞中的表达及其作用
目的:观察腺相关病毒载体介导的人降钙素基因相关肽(hCGRP)基因在原代培养的大鼠阴茎海绵体平滑肌(CCSM)细胞的表达及其作用,探讨其应用于勃起功能障碍(ED)基因治疗的可行性.方法:原代培养的SD大鼠CCSM细胞随机分为4组:实验组、空病毒组、示踪剂组和对照组,分别以可分泌表达hCGRP重组腺相关病毒VssH-GCMV-hCGRP、空病毒VssHGCMV和表达绿色荧光蛋白(GFP)重组腺相关病毒VssCMV-GFP进行体外转染或不予任何处理.采用斑点印迹试验检测培养液中的hCGRP和放射免疫法检测转染细胞中的环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷(cGMP)水平,观察hCGRP和示踪剂GFP的表达及其对CCSM细胞的影响.结果:重组腺相关病毒载体能有效地将外源基因hCGRP导入大鼠CCSM细胞并稳定表达,与空病毒组和对照组相比,该病毒明显刺激大鼠CCSM细胞中cAMP水平升高[(48.7±1.1)nmol/L对(12.3±1.2)nmol/L和(7.8±1.4)nmol/L,P均＜0.01],培养液中可检测到免疫反应性hCGRP.结论:可分泌表达生物活性肽重组腺相关病毒基因转移系统可有效进行多肽类在CCSM细胞过表达,并影响该细胞的cAMP水平,可被应用于ED的基因治疗.
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PDE5基因反义寡脱氧核苷酸对人阴茎海绵体平滑肌细胞cNMP的影响
目的: 观察PDE5基因反义寡脱氧核苷酸对人阴茎海绵体平滑肌细胞内cAMP和cGMP的影响,为阴茎勃起功能障碍的基因治疗提供理论和实验依据. 方法: 将PDE5基因反义寡脱氧核苷酸(含第1外显子部分序列)与脂质转染试剂DOTAP共同转染人阴茎海绵体平滑肌原代细胞,以酶联免疫法分别检测转染后不同时间(1～48 h)海绵体平滑肌细胞内cAMP和cGMP的浓度变化,观察反义寡脱氧核苷酸对平滑肌细胞内cNMP的影响. 结果: 转染后,反义实验组平滑肌原代细胞内cGMP水平(1～6 h)显著高于对照组(P<0.01). 结论: PDE5基因反义寡脱氧核苷酸可以增加人阴茎海绵体平滑肌细胞cGMP水平,本研究有助于了解PDE5基因与cNMP在阴茎勃起中的作用,并为阴茎勃起功能障碍的基因治疗提供理论和实验基础.
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中药益坎胶囊对动脉性勃起功能障碍大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞表型转化的影响
目的:探讨中药益坎胶囊对动脉性勃起功能障碍(ED)大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞表型转化的影响,以揭示益坎胶囊治疗ED的机制. 方法:选取SD大鼠50只,其中10只设为正常组,另40只通过结扎双髂内动脉造成动脉性ED模型.造模后将其中10只设为模型对照组,其余30只灌胃给予ED治疗中药益坎胶囊,浓度分别为1.88、0.94、0.47 g/kg.给药1个月后,经腹腔注射阿朴吗啡,观察大鼠呵欠次数和阴茎勃起次数;切取大鼠的阴茎组织标本,通过免疫组化法观测海绵体平滑肌细胞收缩型性标志物碱性调宁蛋白(calponin l)和合成型标志物骨桥蛋白(OPN)的表达,实验组结果与正常组和对照组进行比较. 结果:注射阿朴吗啡后,正常组大鼠勃起次数为(4.48±1.25)次,模型对照组为(1.63±0.22)次,两组比较,差异有统计学意义(P＜0.01);给药后,中药益坎胶囊高、中、低剂量组大鼠勃起次数有明显改善[高剂量:(3.05±1.37)次;中剂量:(2.98±0.16)次;低剂量:(1.75±0.40)次].免疫组化结果显示,模型对照组大鼠海绵体平滑肌细胞calponin 1表达减少,而OPN表达增多,与正常组相比差异有统计学意义(P＜0.05);与模型对照组相比,给药后,中药益坎胶囊高、中、低剂量组大鼠海绵体平滑肌细胞calponin 1表达增多,OPN表达减少. 结论:中药益坎胶囊能改善动脉性ED大鼠的勃起功能,抑制海绵体平滑肌细胞表型由收缩型向合成型转化.
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红景天苷对低氧诱导大鼠海绵体平滑肌细胞凋亡的抑制作用
目的:探讨红景天苷对低氧诱导的大鼠海绵体平滑肌细胞(CCSMCs)凋亡的影响. 方法:采用酶消化法体外培养大鼠CCSMCs,抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和结蛋白(Desmin)免疫荧光鉴定CCSMCs纯度;通过MTT法筛选红景天苷无毒剂量;以低氧混合气体(1％O2,5％ CO2,94 ％N2)通入缺氧小室建立细胞低氧模型;细胞分为3组:正常组,低氧组,红景天苷(32μg/ml)干预组,采用流式细胞术观察各组CCSMCs凋亡的情况,Western印迹检测caspase-3蛋白表达水平. 结果:成功培养大鼠CCSMCs,免疫荧光显示绝大部分细胞α-SMA、Desmin阳性;≤32 μg/ml的红景天苷对细胞无明显的毒性;低氧组CCSMCs早期凋亡[(18.69±1.29)％]较正常组[(12.77±1.41)％]明显增多(P＜0.01),低氧组晚期凋亡[(21.03±1.53)％]较正常组[(14.63±2.00)％]亦增加(P＜0.05),同时,活化型caspase-3蛋白表达上升(P ＜0.01);32 μg/ml红景天苷剂量下可有效降低低氧诱导的CCSMCs早期凋亡率[(13.46 1.87)％](P＜0.01),活化型caspase-3蛋白表达下降(P＜0.01). 结论:红景天苷能够降低低氧诱导的CCSMCs活化型caspase-3蛋白的表达,抑制了低氧诱导的CCSMCs凋亡.
关键词： 红景天苷 低氧 海绵体平滑肌细胞 凋亡 蛋白Caspase-3 -
津力达对高糖环境下大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞表型转化的影响
目的 探讨津力达颗粒对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞(corpus cavernosum smooth muscle cells,CCSMCs)表型转化的影响及机制.方法 将原代SD大鼠CCSMCc进行传代培养,实验分为正糖组(NG组),高糖组(HG组),高渗组(HC组),高糖+PD98059组(HG+PD组),高糖+低、中、高浓度津力达组(HG+LJLD组、HG+MJLD组、HG+HJLD组),分别于0、24、48 h在高倍镜下观察细胞形态变化.Western blot检测各组α细胞平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)、碱性调宁蛋白1(calponin 1)和骨桥蛋白(osteopontin,OPN)以及信号通路蛋白细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinases 1/2,ERK1/2),磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(phosphorylated extracellular signaling regulates kinases 1/2,p-ERK1/2)的表达.结果 与NG组比较,HG组α-SMA、calponin 1表达均显著减少(P<0.05);OPN表达显著增多(P<0.05),p-ERK1/2表达增多(P<0.01),HC组无上述改变.加入ERK抑制剂后p-ERK1/2表达减低(P<0.05),α-SMA、calponin 1表达回升(P<0.05);OPN表达减少(P<0.05).高糖加入津力达干预后,与HG组比较,HG+LJLD组、HG+MJLD组、HG+HJLD组calponin 1表达增多,p-ERK1/2表达减少(P均<0.05),津力达浓度越大,逆转越明显;HG+HJLD组OPN表达显著减少(P<0.05).结论 高糖可能通过上调ERK1/2的磷酸化进而诱导CCSMCs从收缩型向合成型转化;津力达可能通过抑制ERK1/2的磷酸化,改善高糖诱导的上述变化.
