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重组人α-2b干扰素发酵及粗提条件的优化研究
目的:探讨从基因工程菌Escherichia coli发酵表达和提取α-2b干扰素的优化方法.方法:采用高密度发酵表达α-2b干扰素,并对发酵培养条件进行优化.用8M尿素提取包涵体,在复性液中加入适量的还原剂,探索提取干扰素的佳条件.结果:湿菌体平均产量22g/L,生物活性7.92×108IU/L.复性后α-2b干扰素纯度达到80%,收率为62%.结论:发酵、提取效果令人满意,收率较高.
关键词： 重组人α-2b干扰素 高密度发酵 包涵体 精氨酸 -
重组毕赤酵母菌高密度表达人源抗-HBs Fab抗体的研究
目的探讨抗-HBs Fab抗体发酵工程菌GS115/Fab的高密度发酵及对发酵产物的纯化与活性鉴定方法.方法采用补料分批培养方法,在5L发酵罐中对发酵工程菌GS115/Fab进行高密度发酵,发酵温度28～30℃,pH值范围为5.0～5.5,溶氧范围20%以上;3次发酵分别于OD600值达到400～450、200～250、300～350时开始诱导,甲醇诱导浓度为0.5%～1%,经96h左右的诱导后终止发酵,对发酵上清进行亲和纯化,并通过ELISA法对纯化产物进行活性鉴定.结果在OD600为300～350时开始诱导有利于发酵过程条件的控制和目的蛋白的表达,目的蛋白表达量为245mg/L.发酵上清通过亲和层析纯化,获得纯度为98%的重组Fab抗体,该抗体经ELISA分析具有较高的HBsAg抗原亲和力及特异性.结论 Fab酵母菌工程菌在5L发酵罐高密度发酵成功,为抗-HBs Fab抗体的产业化生产及临床研究奠定了基础.
关键词： 抗-HBs Fab抗体 高密度发酵 毕赤酵母菌 亲和层析 -
重组人组织激肽释放酶结合蛋白的高密度毕赤酵母表达、纯化和生物学活性
研究重组人组织激肽释放酶结合蛋白(rHKal)的高密度毕赤酵母表达、纯化以及生物学活性.以质粒pPIC9-Kal/GS1 15 (His4)转化毕赤酵母细胞,在7.5L培养罐内高密度细胞发酵,以1％～2％的甲醇诱导表达rHKal.发酵上清液经疏水层析、亲和层析和凝胶层析分离rHKal.通过MTT及小管形成实验评价rHKal对HUVEC的生物学活性.收获发酵上清液内rHKal的表达水平为50 mg·L-1,纯化后rHKal原液的纯度达98％以上.rHKal对HUVEC的增殖抑制活性呈剂量依赖性,但对其小管形成抑制作用的量效关系呈U型曲线.rHKal 具有新生血管形成抑制活性,本研究为rHKal的生产提供了有效方法.
关键词： 组织激肽释放酶结合蛋白 高密度发酵 纯化 生物学活性 -
重组人胰岛素样生长因子1工程菌的高密度发酵
背景:胰岛素样生长因子1是人体内重要的细胞调控因子,已用于治疗糖尿病等多种疾病,工程菌发酵生产工艺研究是胰岛素样生长因子1实现产业化从而扩大临床应用的关键因素.目的:探讨表达重组人胰岛素样生长因子1工程菌的高密度发酵与表达条件.设计、时间及地点:酶基因工程实验,于2007-05/2008-05在浙江树人大学生物技术实验室完成.材料:重组人胰岛素样生长因子1大肠杆菌表达菌株E. coil BL21(DE3)/pET22a-IGF-1由浙江树人大学生物技术实验室保存.高密度发酵补料培养基为:葡萄糖300 g/L,蛋白胨40 g/L,酵母粉10 g/L,Na2HPO4280 mmol/L,NaH2PO4·2H2O 120 mmol/L,MgSO4 10 mmol/L,氨苄青霉素100 mg/L.方法:菌株活化后,进行摇瓶发酵试验,分别改变培养基种类、诱导剂异丙基硫代半乳糖苷浓度、诱导时间等参数,优化摇瓶发酵条件.依据摇瓶发酵优化条件,采用自控5 L发酵罐进行分批补料发酵试验.培养分分批培养和分批补料2个阶段.采用pH反馈流加的方式补料,在对数生长中后期开始诱导,加入异丙基硫代半乳糖苷至设计终浓度,培养4-6 h.主要观察指标:重组人胰岛素样生长因子1工程菌的发酵与产物表达情况.菌体浓度与菌体干重测定,目的蛋白表达量的测定,发酵液葡萄糖浓度的测定.结果:以2×YT+5 g/L葡萄糖为发酵培养基.经0.8 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷诱导5 h,通过控制溶解氧以及pH反馈补料方式,实现工程菌高密度发酵与目的蛋白高效表达,每升发酵液收获干菌体50.1 g/L,重组人胰岛素样生长因子1含量达5.25 g/L.结论:实验成功建立了重组人胰岛素样生长因子1工程菌优化的高密度发酵工艺,为重组人胰岛素样生长因子1的卜游纯化和工业化生产奠定了基础.
关键词： 人胰岛素样生长因子1 工程菌 高密度发酵 -
猪源屎肠球菌WEI-9的高密度培养
目的 对分离自健康仔猪肠道的屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9的高密度发酵培养基进行响应面优化,为菌株WEI-9的工业化生产奠定基础.方法 首先采用单因素试验确定适高密度发酵培养基的碳源和氮源,随后采用Plackett-Burman设计筛选出影响菌株WEI-9发酵活菌数的显著因素,利用陡爬坡试验得出显著因素逼近大活菌数产量的响应区域,后应用Box-Behnken设计和响应面分析法确定显著影响因子的佳浓度.结果 优化后的适高密度发酵培养基成分和配比为:乳清粉21.34 g/L,蛋白胨21.94 g/L,NaAC·3H2O 5g/L,柠檬酸铵2g/L,K2HPO4·3H2O 2g/L,MgSO4·7H2O 0.2g/L,MnSO4·H2O 0.05 g/L,吐温-80 1 g/L,发酵液高活菌数达到1.6×109 CFU/mL,是相同条件下MRS培养基中活菌数的1.98倍.结论 本研究实现了猪源屎肠球菌(Enterococcusfaecium)WEI-9的高密度培养.
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嗜热链球菌高密度发酵过程的优化方案探讨
本研究介绍了嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)高密度发酵过程的优化方案.首先从培养基优化方案入手,讨论了单因素法与正交实验法在培养基优化过程中的利弊.第二,介绍了培养条件以及发酵过程的优化,包括pH、培养温度、搅拌转速、接种量和培养时间.第三,介绍了菌体的后处理过程,包括降温处理、超声解链、离心冻干.
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大肠杆菌中外源蛋白高效表达的影响因素及策略研究的新进展
大肠杆菌表达系统因为其遗传背景清楚,低成本,高生产率,特征明确,兼容多种抗体[1]使之成为目前常用的外源蛋白原核表达系统.近年来,重组大肠杆菌的高密度发酵是现代基因工程产品大规模生产的重要技术.采用高密度发酵技术,提高菌体的发酵技术,提高菌体的发酵密度,终提高产物的比生产率,不仅可以减少培养体积、优化下游分离提取,还可以缩短生产周期、降低生产成本,从而极大地提高在市场上的竞争力.然而在研究高效发酵过程中,人们往往会遇到表达效率难以得到大限度的提高与产率较低等问题.因此本文将就外源基因本身特性对于高效表达的影响,表达系统的特性对于高效表达的影响,外源基因与系统间的相互作用及其他因素等方面阐明外源基因高效表达的影响因素.终总结出一套高效表达的策略.
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A型产气荚膜梭菌α毒素疫苗抗原rCPA-HSP65的原核表达及其纯化
目的 原核表达A型产气荚膜梭菌α毒素疫苗抗原rCPA-HSP65,并进行纯化.方法 以CPA全基因为模板,PCR扩增rCPA基因,插入表达质粒pET-28a(+)-HSP65,构建重组表达质粒pET-28a-rCPA-HSP65,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物进行12％ SDS-PAGE分析;优化表达工艺进行高密度发酵,发酵产物经DEAE阴离子柱上复性后,再经金属螯合层析纯化.结果 重组表达质粒pET-28a-rCPA-HSP65经双酶切及测序鉴定证明构建正确,表达的重组蛋白相对分子质量约90 000,主要以可溶性形式为主,表达量占菌体总蛋白的30.17％.利用TB培养基,IPTG 34℃诱导5h的表达产物经纯化后,纯度约达95％,蛋白收率为4.5mg/g湿菌.结论 已成功表达并纯化了A型产气荚膜梭菌α毒素疫苗抗原rCPA-HSP65,为后期疫苗生物学活性的研究奠定了基础.
关键词： A型产气荚膜梭菌α毒素 rCPA-HSP65 原核细胞 基因表达 高密度发酵 蛋白纯化 -
密码替换后人促红素基因在大肠杆菌中的高效表达及工程菌的发酵
目的研究人工合成的hEPO基因在大肠杆菌中高效表达及工程菌高密度发酵条件.方法将hEPO基因中大部分大肠杆菌稀有密码子替换成使用频率较高的密码子,人工合成hEPO全基因,然后将其插入表达载体PBV220中,转化大肠杆菌DH5α,挑选构建正确的PBV220-hEPO/DH5α菌落,经升温诱导,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物;观察改变培养基、培养时间、pH及溶氧量等条件对表达产物的影响.结果经酶切分析,DNA测序鉴定,人工合成的hEPO基因已正确构建到表达载体中.通过高密度发酵培养,终菌体密度达A500=30(相当于菌体35g/L),hEPO表达量达30%左右.结论人工合成的hEPO基因在大肠杆菌中得到高效表达,并确定了该工程菌高密度发酵的适宜条件.
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天然N-末端人白细胞介素-29成熟肽在毕赤酵母中表达条件的优化
目的 优化天然N-末端人白细胞介素-29(Human interleukin-29,hIL-29)成熟肽在毕赤酵母中的表达条件,高效表达天然N-末端hIL-29成熟肽.方法 采用单因素试验和L9(34)正交试验,分析摇瓶发酵条件下甲醇添加量、起始pH值、诱导时间及诱导温度对毕赤酵母工程菌GS115/hIL-29发酵液A450值的影响；用5L发酵罐初步探索工程菌株的高密度发酵策略.结果 影响重组毕赤酵母摇瓶发酵液A450值的因素重要性依次为:诱导温度＞起始pH值＞甲醇添加量＞诱导时间,佳发酵条件为:起始pH值7.5、甲醇添加量1.5％、26℃诱导60 h,在此条件下,发酵液的A450值达1.72;高密度发酵策略为:pH7.5,甲醇与溶氧反相偶联,26℃诱导12h,在此条件下,目的蛋白的表达量明显高于摇瓶水平；高密度发酵12、24 h表达的蛋白与羊抗人IL-29多抗的反应强度明显高于摇瓶发酵表达的蛋白.结论 优化了工程菌株GS115/hIL-29摇瓶发酵和发酵罐高密度发酵条件,实现了重组天然N-末端hIL-29成熟肽在毕赤酵母GS115中的高效表达,为其进一步的中试放大工艺奠定了基础.
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重组类人胶原蛋白的分离纯化
目的建立重组类人胶原蛋白分离及纯化工艺.方法将工程菌株E.coli BL21 3.1在L1523型12.8L自控发酵罐中培养14h,发酵菌体经超声破碎、硫酸铵沉淀后,依次经DEAE-52和Sephadex G-100柱层析分离纯化.结果发酵菌体干重达到71g/L,表达量为菌体蛋白量的29.4%,终产物纯度达98%,回收率为80.5%,纯化倍数为3.4.结论纯化的类人胶原蛋白达电泳纯,相对分子质量为90 000,N端序列为NH2-H-D-P-V-V-Q-R-R-D-W-E-N-P-G,均与其因序列设计一致.
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高效表达干扰素α1b(IFN-α1b)工程菌的高密度发酵及干扰素纯化
目的在构建高效表达IFN-α1b重组大肠杆菌工程菌的基础上,建立适合该工程菌的发酵和纯化工艺.方法采用高密度培养方法(HCDC)和柱层析纯化技术.结果发酵密度A600可达70,表达量为菌体总蛋白的30%左右.经破菌、离心、离子交换和分子筛凝胶过滤得到IFN-α1b纯品,FPLC测定纯度为100%,活性为4.99×107U/ml,比活为2.5×107U/mg,均符合2000版<中国生物制品规程>要求.结论已建立了适用于规模化生产的发酵纯化工艺.
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酵母工程菌细胞高密度发酵的研究进展
构建重组酵母工程菌表达抗原或细胞因子等,是研发新生物制品的趋势之一,实现酵母工程菌的高密度发酵是维持制品生产规模和降低成本的重要技术途径.本文就影响酵母工程菌高密度发酵的因素,包括菌株的生物学特性和发酵_[艺特点、培养基种类及配方、发酵罐结构及性能、发酵过程各项重要工艺参数或变量的控制等及在生物制品和生物制药行业中酵母工程菌细胞高密度发酵的进展作一综述.
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汉逊酵母高密度发酵表达乙型肝炎表面抗原的甲醇流加控制策略
目的 考察不同甲醇流加策略对汉逊酵母(Hansenula polymorpha)高密度发酵表达重组乙型肝炎表面抗原的影响.方法 在细胞生长阶段采用DO/pH在线测量的控制方法,使酵母细胞密度达到一个较高水平,诱导期比较DO-Stat/pH-Stat法和离线检测甲醇两种控制流加甲醇的方法,同时也比较用甘油和甲醇双碳源间断流加法与单纯流加甲醇法对目的 蛋白表达的影响.结果 诱导期用DO-Stat和pH-Stat法不能有效地提高乙肝表面抗原表达量,而离线检测甲醇的控制方法,在诱导阶段可将甲醇浓度控制在0～5 g/L的范围,乙肝表面抗原表达量比DO-Stat/pH-Stat法提高了20%.甲醇氧化酶(MOX)酶活性的变化与乙肝表面抗原表达量变化存在对应关系,交替加入甘油和甲醇双碳源刺激,可以使乙肝表面抗原表达量达到395 mg/L.结论 已筛选出优化工艺配置,并建立了切实可行的规模化生产工艺.
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重组人骨形态发生蛋白-7工程菌的高密度发酵
目的 建立重组入骨形态发生蛋白-7(dIBMP.7)工程菌的高密度发酵工艺.方法 采用摇瓶及发酵罐培养T程菌B121/pBV221-rhBMP-17,观察不同培养基、乙酸浓度、pH值、诱导时间等对工程菌菌体生长及目的蛋白表达的影响.在优化的发酵条件下培养工程菌,当菌体A鲫值达100时,42~C升温诱导,并对表达产物进行纯化.结果 发酵培养基与LB培养基培养的_T程菌目的蛋白的表达量无明显差异;乙酸可明显抑制菌体生长及目的蛋白表达;适于菌体生长和目的蛋白表达的pH值分别为6.8和7.6;佳诱导时同为3 h.以优化的发酵条件培养的工程菌诱导3 h后,目的蛋白的表达量可达菌体总蛋白的34.9%,终菌体A600值可达139.5;经纯化的目的蛋白纯度可达95%以上.结论 已初步建立了rhBMP-7工程菌的高密度发酵工艺.
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溶氧浓度对rhG-CSF工程菌高密度发酵的影响
目的 确定rhG-CSF工程菌高密度发酵的佳溶氧浓度.方法 通过通入纯氧,高密度发酵的溶氧值可以精确控制.考察不同溶氧浓度对工程菌的生长、质粒丢失率、乙酸积累情况以及rhG-CSF表达的影响,来确定溶氧的佳控制范围.结果 工程菌生长阶段溶氧控制在25%,诱导后控制在35%,有利于菌体生长和外源蛋白表达,终菌体密度为(79.6±2.1)g/L,表达量为(40.2±1.2)%.结论 溶氧对工程菌rhG-CSF高密度发酵有显著影响.
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硫酸铵与pH对酵母高密度发酵生产谷胱甘肽的影响
控制15L发酵罐中还原糖、氨基氮和pH,考察不同发酵模式对Candida utilis SIPI-60336生物合成谷胱甘肽(GSH)的影响.在高密度发酵模式中细胞产量和GSH产量同时达到人值.确定发酵工艺为:在流加葡萄糖的基础上流加硫酸铵并控制pH,通过高密度发酵提高细胞浓度来提高GSH产量.佳发酵条件为:还原糖浓度为10g/L,氨基氮浓度为60mg/100ml,pH 4.5.发酵48h后GSH产量和细胞干重均大幅提高,分别为830rng/L和41.5g/L.
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甲醇流加策略对重组毕赤酵母表达人肝再生增强因子的影响
考察了5L发酵罐中三种甲醇流加策略(恒溶氧、恒比生长速率和恒甲醇浓度)对重组毕赤酵母表达人肝再生增强因子(hALR)的影响.控制恒定甲醇浓度为10g/L诱导时,甲醇比消耗速率和hALR表达速率显著高于其它两种流加策略,终hALR表达水平为360mg/L.
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重组类人胶原蛋白Ⅱ的表达与纯化
研究了类人胶原蛋白Ⅱ在基因工程菌E. coli BL21 3.7中的表达与纯化.经高密度发酵及代谢调控,重组菌在12.8L发酵罐中的终菌体密度约为150.菌体经高压匀浆破碎、沉淀、超滤、阳离子交换色谱纯化后,表达产物纯度达96.4%,总回收率71.6%.
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以乳糖为诱导剂的高密度发酵
以重组刺桐胰蛋白酶抑制剂(rETIa)为目的产物,用摇瓶比较了以异丙基-β-D-半乳糖苷和乳糖诱导表达的差异,并在15L发酵罐中,以乳糖为诱导剂进行高密度发酵,摸索了诱导后碳、氮补加工艺对产物表达的影响,成功地使菌体密度达到61(A600),表达量达到菌体总蛋白的33%,为乳糖替代IPTG在工业生产中应用提供了借鉴.
关键词： 乳糖诱导 高密度发酵 重组刺桐胰蛋白酶抑制剂
