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羟基多氯联苯对大鼠磺基转移酶1A1和2A3抑制作用的差异
目的 多氯联苯(polychlorinated biphenyls,PC Bs)是一类具有重要毒理学作用的持久性有机污染物,经肝脏代谢可形成羟基多氯联苯(hydroxylated polychlorinated biphenyls,OH-PCBs);本研究旨在探讨OH-PCBs对大鼠磺基转移酶(SULT)1A1和SULT2A3活性的影响.方法 大鼠SULT1A1和SULT2A3分别从重组表达的大肠杆菌制备,以亲和层析法纯化;在SULT1 A1和SULT2A3催化其底物2-萘酚和脱氢表雄酮形成硫酸基结合物(以3',5'-二磷酸腺苷的形成测定酶活性)的基础上,观察7个OH-PCBs对上述反应的影响.结果 受试物均能明显抑制大鼠SULT1A1活性,尤以3,5-二氯-4-羟基结构的OH-PCBs作用(以半数抑制浓度衡量)作用强度为高.相反,各受试OH-PCBs对大鼠SULT2A3缺乏强烈作用,仅3个化合物在溶解度范围达到对其完全抑制.结论 OH-PCBs可能选择性抑制大鼠SULT中的SULT1A1亚型,而3,5-二氯-4-羟基结构与特别强的抑制作用有关.本研究结果提示在PCBs染毒大鼠的试验中SULT1A1的作用可能受到抑制.
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大肠杆菌中外源蛋白高效表达的影响因素及策略研究的新进展
大肠杆菌表达系统因为其遗传背景清楚,低成本,高生产率,特征明确,兼容多种抗体[1]使之成为目前常用的外源蛋白原核表达系统.近年来,重组大肠杆菌的高密度发酵是现代基因工程产品大规模生产的重要技术.采用高密度发酵技术,提高菌体的发酵技术,提高菌体的发酵密度,终提高产物的比生产率,不仅可以减少培养体积、优化下游分离提取,还可以缩短生产周期、降低生产成本,从而极大地提高在市场上的竞争力.然而在研究高效发酵过程中,人们往往会遇到表达效率难以得到大限度的提高与产率较低等问题.因此本文将就外源基因本身特性对于高效表达的影响,表达系统的特性对于高效表达的影响,外源基因与系统间的相互作用及其他因素等方面阐明外源基因高效表达的影响因素.终总结出一套高效表达的策略.
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高效表达干扰素α1b(IFN-α1b)工程菌的高密度发酵及干扰素纯化
目的在构建高效表达IFN-α1b重组大肠杆菌工程菌的基础上,建立适合该工程菌的发酵和纯化工艺.方法采用高密度培养方法(HCDC)和柱层析纯化技术.结果发酵密度A600可达70,表达量为菌体总蛋白的30%左右.经破菌、离心、离子交换和分子筛凝胶过滤得到IFN-α1b纯品,FPLC测定纯度为100%,活性为4.99×107U/ml,比活为2.5×107U/mg,均符合2000版<中国生物制品规程>要求.结论已建立了适用于规模化生产的发酵纯化工艺.
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Mg2+和氨基酸对重组大肠杆菌BL21(DE3)生长及羧肽酶原B表达的影响
目的研究Mg2+和氨基酸对重组菌株生长及表达pCPB的影响.方法通过摇瓶和发酵罐培养,观察不同Mg2+浓度和氨基酸对重组菌的生长和羧肽酶原B表达的影响.结果添加1 g/L Mg2+能提高质粒的稳定性;添加氨基酸能使羧肽酶原B表达量由18.7 g/L提高到24 g/L.结论添加适量的Mg2+和氨基酸能促进重组菌的生长和提高目的蛋白的表达量.
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恶性疟原虫FCCl/HN株环子蛋白基因在BCG中的表达
卡介苗(BCG)由于其广泛应用的安全性和免疫佐剂作用,因而近年来以BCG为载体的重组疫苗研究日益受到重视[1].环子孢子蛋白(circurmporozoim protein,CSP)分子量为40～60kDa.是一种覆盖于子孢子表面的蛋白,是目前已鉴定的子孢子特异性抗原分子,也是疟疾疫苗候选抗原之一[2].本研究将克隆有CSP基因的重组大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG/CSP通过电穿孔转化法导人BCG,观察其在BCG中的表达情况.
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重组大肠杆菌产右旋糖酐蔗糖酶的培养基优化
研究了培养基中葡萄糖、酵母浸膏、Ca2+浓度及无机离子类型等对重组大肠杆菌产右旋糖酐蔗糖酶的酶活力影响.在优化的培养基条件下,右旋溏酐蔗糖酶酶活力达26.6u/ml.使用该重组酶催化制备右旋糖酐,在8h内底物转化率达82%,右旋糖酐分子量高于355k.
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人血管生长素重组大肠杆菌发酵条件优化
考察了Mg2+、Ca2+、NH+4、PO3-4等无机离子、初始pH、装液量以及诱导前添加葡萄糖对重组大肠杆菌表达rhANG和菌体生长的影响.经过优化,rhANG表达量提高约39%,菌体干重达1.59 g/L,为工程菌发酵的扩试提供了参考.
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乳糖诱导重组人SOD基因在大肠杆菌中的表达
利用乳糖代替IPTG诱导rhCu/Zn-SOD在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中的表达,并将菌体生长情况及产物表达规律与IPTG诱导进行比较.对诱导所需的乳糖浓度、金属离子浓度等因素进行了研究,并分析了低温下诱导对重组蛋白表达的影响.终在摇瓶发酵条件的基础上,实现了乳糖诱导重组菌的5L全自动发酵罐培养,rhCu/Zn-SOD酶活性达到1810 U/ml(发酵液).结果表明,乳糖可以诱导rhCu/Zn-SOD在Escherichia coli中的表达,并且酶活性达到IPTG诱导时的89%.
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重组人肿瘤坏死因子-α(rhTNFα)工程菌高密度发酵研究
报道了rhTNFα重组菌发酵条件及高密度、高表达发酵的研究。首先研究了营养成份对其生长和表达的影响，确定了半合成发酵培养基；筛选出了rhTNFα生长和表达的适宿主菌E.coli YK537;研究了影响高表达的几个关键因素，建立了该类型重组菌的诱导表达条件。结果表明限制发酵过程中乙酸积累、控制在指数生长期进行诱导、持续诱导时间不超过5 h是实现高密度、高表达发酵的关键条件。采用半经验补料流加公式，在NBS BioFlo 3000型5L发酵罐中利用恒溶氧-补料培养批技术，限制甘油浓度在5 g/L，可使E.coli YK537/pSB-TR终菌体密度和rhTNFα的产量分别达到A600126和8.4 g/L。
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利用重组大肠杆菌合成莽草酸的研究进展
莽草酸是芳香族氨基酸合成途径中的一种重要中间代谢产物.近年来,莽草酸作为临床上对抗禽流感的惟一有效药物达菲的合成前体而备受关注.通过改造大肠杆菌代谢通路使之能大量积累莽草酸是研究的热点之一.文章综述了莽草酸在重组大肠杆菌中生物合成的途径,并分析了莽草酸合成过程中的关键基因的改造及其对莽草酸积累的影响,后还讨论了减少莽草酸产生菌培养过程中副产物产成的若干措施.
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重组大肠杆菌高密度培养的进展
重组大肠杆菌高密度培养是增加重组蛋白产率的有效方法.选择佳的表达系统以及培养基和培养方式是获得高密度和高表达的重组大肠杆菌的有效途径.在培养过程中,通过控制副产物、pH、温度和诱导时机以及补料方式等参数则能有效地限定比生长速率,从而有利于获得高的密度和好的表达.文章从这几方面对近期的研究成果和未来的发展趋势进行了综述.
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重组人胸腺肽α1工程菌的高密度发酵
为实现重组人胸腺肽α1工程菌E.coli Top10/pThio His-Tα的高密度高表达发酵,首先进行了培养条件的摸索,确定了该工程菌的佳培养条件、诱导剂IPTG的浓度、诱导起始和结束时间,然后用5L自控发酵罐进行分批补料培养,发酵中采用分阶段限制性流加氮、碳源,保持溶解氧在35%左右,结果经3mmol/L IPTG诱导5h,3批重复发酵,终菌体密度均达到60 A600以上(相当于干菌25.6g/L),保持并超过了该重组蛋白在试管和摇瓶中的表达量,融合蛋白Thio His-Tα的表达占菌体总蛋白的42.4%左右,含量达到5.7g/L,相当于胸腺肽α1 2.4g/L,为胸腺肽α1的下游纯化和工业化生产奠定了基础.
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重组人Cu·Zn-SOD工程菌发酵工艺的研究
人Cu.Zn-SOD是一种重要的氧自由基清除剂,传统工艺是从动物血中提取得到,受原料来源的限制.从人胎肝中提取了hCu.Zn-SODcDNA构建了基因工程菌,同时对其表达产物的条件进行研究,着重探索了接种量、接种时机、pH、溶氧等因素,并优化了发酵条件.通过在5L全自动发酵罐上研究重组菌BL21的培养条件,确定了适条件为:接种量2%,溶氧水平≥40%,初始pH6.5,培养过程中用3mol/LHCl调节pH在7.5.在此条件下,发酵高水平达到酶活950U/ml,比活1400U/mg.
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重组大肠杆菌的发酵与外源基因的表达
本文就影响重组大肠杆菌的发酵的主要因素进行阐述.主要因素包括:菌株的选择、培养基的组成,培养方式、培养条件(温度、溶氧、pH等)、代谢副产物(乙酸)的控制及诱导方式和诱导时机等.
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重组人胰岛素样生长因子-1大肠杆菌高密度发酵研究
目的 建立重组人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)在大肠杆菌高密度发酵中表达的工艺.方法 以工程菌DH5α/pET32a(IGF-1)为对象,通过分批发酵培养优化溶解氧浓度、pH及温度等发酵条件,在此基础上以甘油为限制性基质进行分批补料发酵,考察不同补料方式对发酵的影响.结果 适合重组hIGF-1在工程菌高密度发酵中表达的条件:在菌株活化与初始培养后,诱导时控制发酵系统溶解氧浓度为20%,温度为30 ℃,pH为7.2并以恒定pH反馈补料,发酵12 h菌体密度OD600达44.53,得菌体干质量17.49 g/L,平均生产强度为1.458 g·L-1·h-1,其中重组hIGF-1的相对表达量为32.5%.结论 研究为工业化生产hIGF-1奠定了基础.
关键词： 高密度发酵 重组大肠杆菌 人胰岛素样生长因子-1 -
海栖热袍菌磷酸戊糖变位酶基因克隆表达及发酵条件优化
目的 从嗜热微生物海栖热袍菌中克隆磷酸戊糖变位酶基因,实现其在大肠杆菌中的表达.方法 以海栖热袍菌基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增获得编码磷酸戊糖变位酶蛋白基因(ppm),连接到具有T7强启动子的pET-32a质粒中,构建重组工程菌E.coli BL 21(DE3){pET-32a-Tmppm}.通过Plackett-Burman设计、陡爬坡试验和Box-Behnken试验方法优化工程菌发酵条件,构建回归方程.结果 双酶切鉴定、测序分析和十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)证实海栖热袍菌磷酸戊糖变位酶基因可在工程菌中表达.佳发酵条件为诱导种龄0.6,诱导温度22.5℃,诱导时间13 h,异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度0.45 mmol/L,培养基初始pH 7.6,接种量2.25％.结论 发酵条件优化后磷酸戊糖变位酶表达量大幅提高.实验结果为该酶的性质研究和应用提供了支撑.
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反相高效液相色谱法测定重组大肠杆菌发酵液中降血压肽的含量
目的 建立反相高效液相色谱(RP-HPLC)测定重组大肠杆菌发酵液中降血压肽的方法,为其深入研究提供方法学基础.方法 采用Aydac C18反相柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),Aydac保护柱,柱温30℃,以乙腈:水(22:78),0.05%TFA为流动相,流速1.0 ml/min,检测波长215 nm,参考波长350 nm,进样量20 μl.结果 该方法使降血压肽与其它相似产物得到较好分离,在5～250 μg/ml内线性关系良好,r=0.999 8,低检测限达8 ng,低、中、高浓度下的加样回收率、日内、日间精密度均符合方法学要求.结论 该方法稳定、灵敏度高、操作简便、适用于重组降血压肽的含量测定.
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羟基多氯联苯与人和大鼠羟基固醇类硫酸基转移酶的相互作用
目的:多氯联苯(Polychlorinated biphenyls,PCBs)是一类持久性环境污染物,对人类健康有潜在危害.羟基多氯联苯(Hydroxylated PCBs,OH-PCBs)是PCBs在体内的生物活性形式；已有报道OH-PCBs是多种亚型的酚类硫酸基转移酶(Sulfotransferases,SULTs)抑制剂和底物,本研究拟观察OH-PCBs与人和大鼠羟基固醇类SULT有无相互作用.方法:采用重组表达人羟基固醇类SULT (SULT2A1)和其大鼠同源酶SULT2A3的大肠杆菌菌株,分离纯化所表达的酶蛋白；分析3种OH-PCBs的酶促硫酸基结合或抑制生理性底物结合反应的活性；以辅酶转化产物3’,5’-二磷酸腺苷(Adenosine 3’,5’-diphosphate,PAP)形成反映酶促硫酸基结合的水平.结果:4-OH PCB 34和4’-OH PCB 68一定浓度(1～200 μmol/L)对人SULT2A1具有底物活性；二者都存在底物抑制(在50μmol/L以上抑制明显).4’-OH PCB 9对此酶不具底物活性,但对去氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone,DHEA)和1-甲醇基芘的酶促硫酸基结合有抑制作用,且呈竞争性抑制.不同的是3种OH-PCBs对大鼠SULT2A3都不具底物活性,且对该酶作用下以DHEA为底物的反应仅微弱抑制.结论:人和大鼠两个种属的羟基固醇类SULT对OH-PCBs的底物特异性及亲和力存在显著差异,OH-PCBs与人SULT2A 1具有比与大鼠SULT2A3活跃的相互作用.
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重组E.coli. LLO/OVA明显增强小鼠CD11c细胞活性及抗肿瘤免疫
目的 探讨重组E.coli. LLO/OVA 诱导C57BL/6小鼠机体免疫的途径,观察其免疫后小鼠机体抑制B16-OVA黑色素瘤的效果.方法 磁珠分离E.coli. LLO/OVA及E.coli. OVA免疫后小鼠脾脏CD11c、CD4+和CD8+T细胞并检测CD11c细胞诱导同源CD4+和CD8+T增殖水平和细胞因子分泌程度;流式细胞检测小鼠脾脏内肿瘤抗原OVA257-264 SIINFEKL特异的细胞毒T细胞含量.比较两种E.coli. 免疫后,恶性黑色素瘤B16-OVA在小鼠肺内形成瘤结节的数量.结果 与E.coli. OVA相比, E.coli. LLO/OVA免疫后小鼠脾脏CD11c细胞诱导同源CD4+ T细胞增殖作用增强、IL-2分泌增高;同时诱导CD8+ T细胞增殖和IFN-γ分泌的作用也明显增强;OVA257-264 SIINFEKL特异的CD8+T细胞含量也明显增高;小鼠肺内形成B16-OVA瘤结节平均数明显减少. 结论 E.coli. LLO/OVA有效地诱导小鼠CD11c细胞活化,增强其对CD4+T细胞增殖和IL-2分泌以及对CD8+T细胞增殖、IFN-γ分泌的作用,诱导了更多的OVA特异的CD8+T细胞,使机体产生了更强的抗肿瘤免疫.
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重组疫苗E.coli LLO/OVA促进小鼠树突状细胞NOD1受体活化并表达IFN-γ
目的 探讨重组疫苗E.coli LLO/OVA诱导树突状细胞的细胞内受体NOD(nucleotide-binding oligomerization domain)活化及表达IFN-γ的作用.方法 采用基因芯片杂交分析经E.coli LLO/OVA刺激后小鼠骨髓树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells,BMDC)Card4/NOD1及其下游NF-κB信号通路相关分子mRNA的表达,RT-PCR检测BMDC的NOD1、NOD2和IFN-γ mRNA表达,ELISA测定BMDC培养上清液内IFN-γ含量.结果 经E.coli LLO/OVA刺激后4 h至8 h,BMDC出现Card4/NOD1基因表达上调,其下游信号途径相关分子基因Rip2、Ikkα、Ikkβ、Nfκb1、Nfκb2和IFN-γ均出现表达上调.RT-PCR结果显示该疫苗刺激后BMDC的NOD1与IFN-γ基因表达时段一致.经E.coli LLO/OVA刺激后24 h,BMDC培养上清液内IFN-γ含量明显高于E.coli OVA刺激后的BMDC.结论 重组疫苗E.coli LLO/OVA诱导小鼠骨髓树突状细胞NOD1受体信号途径活化并促进了IFN-γ表达.
