海南省消除疟疾前期间日疟原虫环子孢子蛋白多态性研究及其分子进化关系分析

目的 分析海南省消除疟疾前期间日疟原虫环子孢子蛋白(CSP)基因型.方法 采用PCR扩增特异性目的片段,基因测序,序列比对及进化树构建等方法.结果 19份本地感染间日疟样本中18份为VK210,1份为VK247,VK210为优势亚型.与参考株相比,VK210又分为7个亚型,VK247仅有1个亚型.VK210各亚型中GDRAD(A)GQPA重复序列均存在不同数量的D或A点突变,属于高度突变区域；其余重复序列(GNGAGGQAA和GGNA)大多数仅发生基因数量的增减变化.海南省疟疾控制阶段和消除阶段间日疟VK210和VK247基因型构成比的差异无统计学意义(P＞0.05),进化树分析显示两基因型分别属于不同的进化簇.结论 海南省消除疟疾前期仍存在两种基因型间日疟.与控制阶段相比,种型间构成比差异不显著,间日疟虫株消失结果相一致.

恶性疟原虫FCC-1/HN株环子孢子蛋白基因分枝杆菌——大肠杆菌穿梭表达重组质粒的构建及序列测定

本文对恶性疟原虫环子孢子蛋白(circumsporozoite protein,CSP)基因片段进行克隆和序列测定。根据恶性疟原虫837株基因编码序列设计合成一对引物，采用PCR技术从恶性疟原虫FCC-1/HN株基因组DNA中特异扩增CSP基因片段的Ⅰ区、中央重复区、重复区后可变区和Ⅱ区；经纯化的扩增产物用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切后，定向克隆入大肠杆菌——分枝杆菌穿梭表达质粒，转化感受态大肠杆菌DH5α，重组克隆经抗性筛选和快速凝胶电泳鉴定，再经PCR和酶切鉴定，并对重组子进行序列测定。结果表明从恶性疟原虫FCC-1／HN株基因组DNA中可特异扩增出约1 171bp的基因片段，阳性重组质粒经双酶切和PCR鉴定与预期的结果一致，序列测定表明所克隆的基因和编码环子孢子抗原的基因片段相符。

恶性疟原虫环子孢子蛋白单链抗体与按蚊cecropin A融合基因的构建、原核表达及生物学活性的初步分析

根据按蚊偏嗜性密码子对鼠源性恶性疟原虫环子孢子蛋白单链抗体2a10基因进行改造,并融合按蚊抗菌肽cecropin A编码基因.将获得的cecrop-m2a10融合基因克隆人原核表达载体pET32a(+)中,对表达产物进行SDS-PAGE、western-blot分析并利用琼脂糖扩散法检测其抗菌活性.结果对鼠源性环子孢子蛋白单链抗体2a10中6种氨基酸的170个核苷酸进行了改造,融合cecropin A编码基因,成功构建了cecrop-m2a10融合基因.靶基因在大肠杆菌中以融合蛋白和包涵体的形式高效表达,包涵体经尿素溶解变性及透析复性后表达蛋白的纯度达75%并具备抗大肠杆菌DH5a的活性.本实验为进一步研究cecrop-m2a10在转基因蚊中的多重抗病原效应提供了基础.

间日疟原虫MSP-1 和 CSP 基因遗传多样性的分析

目的比较间日疟原虫两种主要分子标志(MSP-1 和 CSP)的遗传多样性. 方法分别用MSP-1和CSP基因分型方法鉴定间日疟原虫现场分离株,并进行基因多态性比较和分析. 结果共检测32份海南省现场确诊的间日疟病人血样,MSP-1等位基因型混合感染率为18.75%,平均克隆数1.16;CSP基因型混合感染率为35.29%,平均克隆数为1.47.如果同时考虑两种基因型,混合感染率则为50.00%.空间对应分析发现,热带族与Sal-1型关系密切,PvⅡ型与重组Ⅲ型分布靠近,其他基因型则较分散. 结论同时用MSP-1和CSP两种分子标志检测间日疟原虫,其基因型混合感染率高于用单一标志检测,两种标志检测结果存在一定对应关系.

辽宁省间日疟原虫环子孢子蛋白基因型分析

目的 探讨辽宁省间日疟原虫环子孢子蛋白(CSP)的基因型与地理分布.方法 采集镜检确诊的间日疟患者血样15份,Chelex-100离子交换法提取DNA,进行单管一套式PCR扩增,根据琼脂糖凝胶电泳结果判定环子孢子蛋白(CSP)基因型别.结果 12份本地感染间日疟血液标本中6份鉴定为PV-Ⅰ型温带族虫株)(占50.00％),6份鉴定为PV-Ⅰ型温带族和PV-Ⅱ型混合虫株(占50.00％)；3例输入性间日疟病例中PV-Ⅰ型热带族和温带族各1例,PV-Ⅰ型温带族和PV-Ⅱ型虫株混合感染1例.结论 目前辽宁省间日疟原虫存在2种CSP基因型,即PV-Ⅰ型温带族虫株和温带族、PV-Ⅱ型混合感染虫株,无热带族虫株.

广西间日疟原虫环子孢子蛋白基因型的初步研究

目的了解广西间日疟原虫种群的基因型组成及其地理分布. 方法用滤纸法采集经镜检确诊的间日疟原虫阳性病人血样31份, Chelex-100离子交换法用于提取滤纸血样中的DNA,改进的套式-等位特异-PCR和琼脂糖凝胶电泳用于鉴别性片段的扩增、分析和鉴定. 结果在19份广西当地间日疟病例血样中17份鉴定为温带族虫株(89.5%),2份为热带族虫株(10.5%);12份输入病例血样中,温带族8份(66.7%),热带型3份(25.0%),PV-2型1份(8.3%). 结论目前广西当地流行的间日疟以温带族虫株为主,少数热带族病例出现在环江和防城县;但输入间日疟病例中热带族虫株感染占较大比例.

恶性疟原虫海南株CSP3′末端基因的克隆及序列分析

目的构建恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)CSP3′末端基因的原核表达载体,并对CSP3′末端基因进行序列测定.方法根据恶性疟原虫CSP编码的基因序列设计引物,采用PCR技术扩增出CSP3′末端基因,将其克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌JM109;阳性重组质粒经PCR、酶切鉴定,用双脱氧链末端终止法进行序列测定. 结果从恶性疟原虫基因组中扩增出CSP3′末端基因,其片段大小为225 bp,构建的阳性重组质粒pGEX-4T-1/CSP3′末端经PCR和酶切鉴定与预期结果一致,测序结果进一步确认了插入片段的正确性. 结论成功地构建了CSP3′末端的原核重组质粒,为进一步研究其功能奠定了基础.

间日疟原虫环子孢子蛋白(PvCSP)基因多态性研究进展

环子孢子蛋白是存在于疟原虫属的一种特殊分子,整个蛋白包括三个区域,中央重复区及保守I区、保守Ⅱ区,不同地理株疟原虫的中央重复区重复单位的数目和长度均不同.本文简要综述了该蛋白的分子结构及国内外学者对其基因多态性的研究进展.

恶性疟原虫环子孢子蛋白肝细胞靶向肽段CSR2 a-EGFP 的原核表达、纯化及鉴定

目的：从恶性疟原虫FCC1／HN株环子孢子蛋白（circumsporozoite protein，CSP）的全长编码基因中扩增4个CSP基因编码片段，克隆至原核表达载体pET28 a／EGFP 中进行表达纯化，观察环子孢子蛋白肽段与EGFP融合蛋白对肝细胞的靶向结合能力，探讨其作为原发性肝癌基因治疗的靶向分子载体的可行性。方法根据恶性疟原虫FCC1／HN株环子孢子蛋白的编码序列设计4对引物，利用聚合酶链反应（ PCR ）扩增出4段CSP 的编码基因，将其克隆到原核表达载体pET28 a／EGFP中，与EGFP融合表达，在大肠杆菌BL21中用IPTG诱导表达，表达产物用Ni2＋螯合柱亲和纯化，采用SDS-PAGE对纯化的融合蛋白检测；并观察重组环子孢子蛋白对不同组织细胞的结合能力。结果从恶性疟原虫FCC1／HN株CSP基因中成功扩增到4段分别为300、90、120、80 bp的基因片段，且在原核表达载体pET28 a／EGFP中经诱导表达出相对分子质量约39×103、31×103、33×103和30×103大小的融合蛋白： CSR1a-EGFP、CSR1b-EGFP、CSR2a-EGFP及CSR2b-EGFP；通过Ni2＋亲和柱纯化获得重组CSP融合蛋白，能被疟原虫阳性血清特异识别，且CSR2 a-EGFP能够与肝癌和正常肝细胞特异性地结合，与其他组织来源的细胞则未见反应。结论重组环子孢子蛋白CSR2a-EGFP能够与肝组织特异性地结合，作为原发性肝癌基因治疗的靶向分子具有一定的潜在应用价值。

BCG/恶性疟MSP-2、CSP多价疫苗免疫小鼠应答类型研究

目的探讨恶性疟原虫FCC-1/HN株裂殖子表面蛋白-2 (MSP-2)和环子孢子蛋白(CSP)与BCG多价疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答的特性及抗感染的保护性免疫机制. 方法将重组pBCG/MSP-2和pBCG/CSP多价疫苗经皮下注射BALB/c小鼠,小鼠经多价疫苗免疫8周后,用流式细胞仪分析脾脏T淋巴细胞的分化,并体外培养脾脏细胞,用夹心ELISA法测定IFN-γ和IL-2的产生;用血清学方法测定免疫鼠IgG抗体的动态变化,在体外测定抗体介导的抑制实验. 结果与对照组相比,疫苗组CD4+和CD8+ T淋巴细胞有显著性的增高,体外培养的脾脏细胞IFN-γ有高浓度的分泌.同时,免疫鼠血清对疟原虫抗原都表现了较高水平的IgG类抗体反应,抗体对原虫的增殖产生明显抑制. 结论恶性疟原虫FCC-1/HN pBCG/MSP-2和pBCG/CSP多价疫苗诱导了以TH1为主的免疫应答类型.

恶性疟原虫FCC1/HN株环子孢子蛋白的原核表达、纯化及其对肝细胞靶向作用的观察

目的 从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组中扩增得到环子孢子蛋白(circumsporozoite protein,CSP)的全长编码基因,克隆至原核表达载体pET-32c中进行表达纯化,观察重组环子孢子蛋白对肝细胞的结合能力,探讨其作为原发性肝癌基因治疗的靶向分子的可行性.方法 根据恶性疟原虫3D7株环子孢子蛋白的编码序列设计一对引物,利用聚合酶链反应(PCR)技术从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组中扩增出CSP的全长编码基因,将其克隆到载体pGEM-T中,通过基因测序加以证实;进一步亚克隆至原核表达载体pET-32c中,在大肠杆菌BL21中用IPTG诱导表达,表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化,采用免疫印迹技术(WB)对纯化的融合蛋白进行免疫反应性检测;采用免疫组化(IHC)技术观察重组环子孢子蛋白对不同组织细胞的结合能力.结果 从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组中成功扩增到1263 bp的全长CSP基因,该基因在原核系统中经诱导表达出一相对分子质量(Mr)约62×103大小的融合蛋白,表达产物以包涵体的形式存在;通过Ni2+亲和柱纯化获得重组CSP融合蛋白;WB表明,重组CSP融合蛋白能被疟原虫阳性血清特异性识别;免疫组化结果显示重组CSP融合蛋白能够与肝癌和正常肝细胞特异性地结合,与其他组织来源的细胞则未见反应.结论 CSP是疟原虫子孢子表面主要的蛋白,重组环子孢子蛋白作为原发性肝癌基因治疗的靶向分子具有一定的潜在应用价值.

恶性疟原虫环子孢子蛋白四肽重复序列单克隆抗体的制备

目的 制备针对恶性疟原虫环子孢子蛋白(circumsporozoite protein,CSP)NANP四肽重复序列[Asn-Ala-Asn-Pro(NANP) repeated motif]的单克隆抗体.方法 采用马来酰亚胺修饰的BSA与(NANP)5C偶联法及ADH-EDC介导的BSA与(NANP)5偶联法,将合成的NANP多肽与载体蛋白偶联,免疫BALB/c小鼠后,采用免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0杂交的细胞融合技术,获得分泌抗(NANP)5多肽单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株,间接ELISA法检测效价.通过免疫F1小鼠诱生腹水,采用50％硫酸铵沉淀法盐析纯化后,进行单克隆抗体亚类和特异性鉴定.结果 采用2种方法制备了BSA-(NANP)5偶联蛋白,以该蛋白为抗原,获得10株抗(NANP)5多肽阳性杂交瘤细胞株,效价在1:80000～1:640000之间,均为IgGl亚类,轻链类型为κ,可被(NANP)5及CSP抗原特异性识别.结论 成功制备了抗(NANP)5多肽的单克隆抗体,该抗体可在恶性疟疾疫苗的研发中发挥重要作用.

四膜虫细胞表达恶性疟原虫环子孢子蛋白并定位于细胞表面

057动合子破坏和卵囊发育受阻是白端按蚊抵抗环子孢子蛋白VK247表型间日疟原虫的原因

约氏疟原虫环子孢子蛋白对TNF-α刺激人肝癌细胞株核转录因子活化的抑制作用

目的 观察约氏疟原虫环子孢子蛋白(CSP)对肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激人肝癌细胞株HepG2核转录因子-κB(NF-κB)活化的影响.方法 以约氏疟原虫BY265株子孢子总RNA为模板,用RT-PCR扩增CSP基因的编码区序列并克隆至pFLAG-CMV8载体,构建重组质粒pFLAG-CMVS-CSP.以兔抗CSP多克隆抗体间接免疫荧光法观察DFLAG-CMVS-CSP能否在HepG2细胞中正确表达,及其在细胞中的分布.实验分为3组,A组(阴性对照组)为转染质粒pFLAG-CMV8的HepG2细胞,B组以100ng/ml TNF-α刺激转染质粒pFLAG-CMV8的HepG2细胞,C组以100ng/ml TNF-α刺激转染质粒pELAG-CMV8-CSP的HepG2细胞.采用双荧光素酶试验和凝胶迁移试验(EMSA)检测NF-κB的核转位及其活化,观察pFLAG-CMV8-CSP对于TNF-α刺激HepG2细胞活化NF-κB是否具有抑制作用.结果质粒pFLAG-CMVS-CSP主要在HepG2细胞胞浆中表达.检测HepG2细胞浆中NF-κB活性,C组萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性比值为0.228±0.029,明显低于B组(0.571±0.030)和A组(0.438±0.085)(P<0.05).EMSA结果显示,C组的条带明显弱于B组.结论 位于细胞浆中的疟原虫CSP蛋白通过抑制NF-κB核转位,从而抑制TNF-α刺激HepG2细胞活化NF-κB.

我国南方五省间日疟原虫环子孢子蛋白基因型与疟疾防治效果关系的探讨

目的探讨我国南方间日疟原虫环子孢子蛋白(CSP)基因型种群结构、疟区分类及其防治意义.方法应用单管-套式/多重PCR对采白海南、云南、广西、广东、贵州等5省(自治区)共346份间日疟原虫阳性患者滤纸血样作环子孢子蛋白(CSP)基因型鉴定,结合5省(自治区)疟疾历史资料和近年流行状况进行分析.结果广东、广两和贵州等3省(自治区)疟原虫PV-1型温带族虫株均占90%以上,热带族仅有个别发现,未见PV-2型;云南省疟原虫PV-1温带族占714%、热带族占28.6%,PV-2型仅个别发现;而海南省PV-1型温带族、热带族和Pv-2型等3大基因型类群分别约占1/3.结论广东、广西和贵州等3省(自治区)间日疟原虫PV-1型温带族占绝对优势,疟疾控制效果好,而海南、云南两省间日疟原虫基因型类群较复杂,疟疾控制难度大,说明间日疟原虫种群基因型结构复杂性和多重感染程度是影响当地间日疟流行势态及其防治效果的重要因素,是防治与监测中重要的流行病学指征之一.

ELISA检测云南按蚊环子孢子蛋白的评价

目的采用酶联免疫吸附测定(ELISA)技术检测疟疾媒介按蚊环子孢子蛋白(CSP),评价ELISA用于云南疟疾媒介按蚊传疟效能调查的可行性.方法现场捕获疟疾媒介按蚊经产蚊,每只蚊镜检3叶唾腺子孢子感染率,ELISA检测另3叶唾腺CSP;用含间日疟原虫配子体的患者血人工喂饲微小按蚊,11d后同法镜检唾腺子孢子感染率及ELISA检测唾腺CSP.在种植场捕获8种按蚊(微小按蚊、中华按蚊、多斑按蚊、迷糊按蚊、可赫按蚊、带足按蚊、菲律宾按蚊和须喙按蚊)各龄成蚊,ELISA检测唾腺CSP.结果①现场捕获经产蚊1 010只,镜检唾腺子孢子阳性7只,阳性率为0.69%;ELISA检测唾腺CSP阳性8只,阳性率为0.79%;其中6只蚊两项检测均为阳性,阳性率为0.59%.两法比较,差异无显著性意义(P＞0.05).②人工感染36只微小按蚊,镜检唾腺子孢子阳性27只,阳性率为75.0%;ELISA检测唾腺CSP阳性29只,阳性率为80.6%;其中有26只蚊两项检测(Pv210 CSP)均阳性,阳性率为72.2%.两法比较,差异无显著性意义(P＞0.05).③种植场捕获8种按蚊各龄成蚊4 675只,ELISA检测唾腺CSP阳性11只,阳性率为0.24%;其中Pv210阳性9只,Pf2A10阳性2只;微小按蚊、中华按蚊和多斑按蚊ELISA检测阳性率分别为0.20%、0.24%、0.39%.结论 ELISA是检测按蚊传疟效能的有用方法.

抗环子孢子蛋白保守Ⅱ+区单克隆抗体的制备及鉴定

目的获得针对恶性疟原虫环子孢子蛋白(CSP)保守Ⅱ+区(Region Ⅱ+)的单克隆抗体.方法采用恶性疟原虫保守Ⅱ+区十二肽(EWSPCSVTCGNG)免疫BALB/c小鼠,经融合,ELISA 3次筛选,获得3株分泌针对保守Ⅱ+区单克隆抗体的杂交瘤细胞株.结果ELISA检测结果显示单抗能与重组表达的恶性疟原虫CSP片段及天然CSP特异性反应.间接荧光抗体检测显示,单抗不仅能识别恶性疟原虫子孢子,也能识别约氏疟原虫子孢子.结论成功地获得了针对恶性疟原虫CSP保守Ⅱ+区的单克隆抗体.

恶性疟原虫TRAP/CSP融合抗原的构建及表达

目的构建恶性疟原虫红前期融合蛋白4(PfCP-4).方法通过甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸(GPG)接点将恶性疟原虫3D7株血凝素相关匿名蛋白(TRAP)膜外区序列(氨基酸26～330)和环子孢子蛋白(CSP)19个4肽重复区及其羧基末端序列(氨基酸199～383)连接,采用不对称PCR法人工合成1 577 bp PfCP-4基因.将PfCP-4基因克隆在pQE表达质粒上,转化大肠杆菌SG13009后进行诱导表达,用抗CSP的免疫血清进行免疫印迹检测.结果免疫印迹检测显示在57kDa处出现特异的表达条带,其大小与推算的PfCP-4分子量一致,表明PfCP-4合成基因能在大肠杆菌中表达分子量为57kDa的PfCP4重组蛋白.结论成功构建了PfCP-4.

我国间日疟原虫基因型种群结构及其地理分布

目的用分子技术调查中国间日疟原虫种群结构与地理分布. 方法用滤纸血滴法采集我国10个省(自治区)间日疟现症病人血样,用套式-、半套式-等位特异PCR基因分型法鉴定其型、族归属及其CSP基因型,并作流行病学统计分析.结果在384个间日疟原虫分离株中,检出温带族258株,分为14个不同的(等位变异)基因型,遍布全国各省,其中主带≤731 bp的基因型仅见于南方5省;热带族79株,分为5个不同基因型,分布于北纬25°以南的5个省(自治区);PV-2型16株,包括2个基因型;另33个分离株为不同型(族)或不同基因型虫株的重复(混合)感染.结论目前我国北纬25°以北各省是单一温带族间日疟原虫分布区,北纬25°以南地区是温带族与热带族间日疟原虫重叠分布区,其中海南和云南两省局部地区同时尚存在PV-2型;温带族内存在地理分布明显不同的2个基因类群.