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抗虫蛋白Cry1Ie在大肠杆菌中的表达、纯化及等同性
目的本研究建立了高效表达抗虫蛋白Cry1Ie的大肠杆菌表达系统,并把此系统表达的Cry1Ie蛋白与转基因玉米表达的Cry1Ie蛋白进行等同性研究,目前国内外对新的抗虫蛋白Cry1Ie的安全性评价资料几乎没有,这为深入研究Cry1Ie蛋白的的安全性评价打下了良好的基础,同时也为探索转基因食品引入外源蛋白的安全性评价体系提供基础性资料和技术平台.
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人乳头瘤病毒16型病毒样颗粒的制备及其免疫原性研究
利用PCR技术从HPV16阳性阴道分泌物标本中获得HPV16 L1基因片段,并将其插入表达载体pTO-T7中,构建重组表达质粒pTO-T7-HPV16-L1;以该重组质粒转化大肠杆菌ER2566并表达HPV16 L1蛋白;所表达的HPV16 L1蛋白经过硫酸铵沉淀、离子交换层析和疏水相互作用层析等纯化步骤后,HPV16 L1纯度达到98%以上,并可在体外装配为直径50nm的病毒样颗粒;动物免疫原性研究结果显示,该病毒样颗粒可诱导高滴度的针对HPV16的中和抗体.上述研究结果表明通过大肠杆菌表达系统制备的HPV16病毒样颗粒具有纯度高,与天然病毒颗粒形态高度相似的特点,并具有高度免疫原性,可以应用于HPV16病毒样颗粒的结构功能研究及HPV16疫苗研发等领域.
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大肠杆菌胞内的共表达策略
大肠杆菌表达系统因其具有系统工具成熟、表达水平高、易于操作和成本低廉等优点而成为表达外源蛋白常用的表达系统之一.但该系统在表达外源蛋白,尤其是真核蛋白时也存在不少缺陷,其中主要的是由于大肠杆菌胞内缺乏帮助蛋白正确折叠的机制,所以相当一部分在大肠杆菌中表达的外源蛋白都聚集成沉淀,即以包涵体的形式存在,从而丧失了生物活性.
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空肠弯曲菌蛋白糖基化系统及利用该系统在大肠杆菌中表达糖蛋白的研究进展
蛋白质糖基化是蛋白质翻译后的一种重要加工过程,其种类主要有N-糖基化和O-糖基化.N-糖基化是指寡糖链连接在蛋白的天冬酰胺β-酰胺氮上,O-糖基化是指寡糖链连接在蛋白的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸的羟基的氧原子上.自从1976年在古细菌中发现S-层糖蛋白以来,已经在古细菌和细菌中发现70多种糖基化蛋白[1-2],并且大部分属于O-糖蛋白,是细菌鞭毛或纤毛的组成成分[3].人体内超过一半的蛋白质是糖基化蛋白质[4],糖基化蛋白质的糖链在机体的正常生理活动中具有重要功能和作用[5].蛋白质药物的糖基化可以增强蛋白质药物的生物活性、延长其半衰期、增加其溶解性、改善其免疫原性等,目前70%的治疗性蛋白质药物均是糖蛋白[6-7 ].生产糖蛋白的首选宿主是中国仓鼠卵巢细胞,生产效率低,成本高,部分蛋白糖链具有免疫原性;另外,毕赤酵母表达系统和昆虫细胞也可以用来生产糖蛋白,但这两种表达系统生产的糖蛋白的糖链为高甘露糖型或含有杂糖,具有较强的免疫原性.大肠杆菌表达系统是应用广泛的经典表达系统,该系统缺乏真核细胞所特有的蛋白质翻译后的糖基化修饰过程,一直以来该系统只能表达非糖基化蛋白质.然而,近10年来发现空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)中存在糖蛋白,把空肠弯曲菌中存在的蛋白糖基化相关基因转化到大肠杆菌中则能够在大肠杆菌中表达带有糖链的目的蛋白.本文对空肠弯曲菌中存在的糖基化系统和利用该系统在大肠杆菌中表达带有糖链的目的蛋白的研究进展进行综述.
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人乳头状瘤病毒6型类病毒颗粒的制备及其中和抗体的检测
目的 利用大肠杆菌表达系统制备人乳头状瘤病毒6型(human papillomavirus type 6,HPV-6)类病毒颗粒(virus-like particles,VLP)并研究其免疫原性.方法 在大肠杆菌ER2566中表达HPV-6 L1蛋白,并以硫酸铵沉淀、离子交换色谱、疏水相互作用色谱等手段对其进行纯化.纯化后的HPV-6 L1经体外组装形成VLP后以动态光散射,透射电镜对其形态进行检测,并以假病毒中和实验评价HPV-6 L1 VLP在实验动物体内所诱导的抗HPV-6/11中和抗体水平.结果 HPV-6 L1蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达,经过纯化后的HPV-6 L1蛋白可以在体外组装为半径25 nm左右的VLP.该VLP可以在山羊及兔体内诱导高滴度的HPV-6/11中和抗体.结论 大肠杆菌表达系统可以简便高效制备具有免疫原性的HPV-6 VLP,可以用于HPV-6疫苗的研究.
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大肠杆菌表达系统在红霉素基因工程中应用的研究进展
大肠杆菌表达系统在红霉素基因工程中的应用面临着许多难题:聚酮合成酶中ACP的后修饰、6-dEB生物合成前体供应、大环内酯糖基化修饰等.通过向大肠杆菌中转入枯草杆菌磷酸泛酰巯基转移酶基因sfp,使大肠杆菌中合成的ACP得以后修饰;6-dEB生物合成前体丙酰CoA和丙二酰CoA可通过Pfeifer途径和Dayem途径提供;目前,在大肠杆菌体内已可以合成6-dEB.利用大肠杆菌系统合成新的大环内酯化合物、对大环内酯糖基化修饰和提高大肠杆菌系统合成大环内酯类抗生素产量将是今后研究的重点.
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人β-NGF在大肠杆菌中的表达、纯化及活性测定
目的 利用大肠杆菌表达系统表达经密码子突变的重组人神经生长因子(rhβ-NGF),并对表达产物进行分离纯化和生物学活性鉴定.方法 利用化学合成法合成经密码子突变后的人神经生长因子β亚基成熟肽段基因及前导肽基因;构建原核表达载体pET28a(+)+[rhβ-NGF],转化大肠杆菌株BL21(λDE3),获得基因工程菌;利用IPTG诱导rhβ-NGF在基因工程菌中表达并收集菌体;分离纯化包涵体蛋白,经体外复性及肠激酶切割去除前导肽后进一步通过镍柱亲和色谱获得rhβ-NGF;通过PC12细胞存活法检测rhβ-NGF的活性.结果 构建的基因工程菌能大量表达包涵体蛋白,体外稀释复性后获得的重组蛋白经SDS-PAGE电泳检测其纯度大于95％,Western blot检测其为目标蛋白;重组蛋白经肠激酶切割及进一步分离纯化后得到的目的蛋白经SDS-PAGE电泳检测为单一条带,纯度大于99％;经Western blot鉴定其为rhβ-NGF;生物学活性检测结果显示其比活性约为500000 u·mg-1.结论 通过优化设计密码子,建立重组人神经生长因子大肠杆菌表达系统,并实现其在大肠杆菌中的高水平表达.
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大肠杆菌中外源蛋白高效表达的影响因素及策略研究的新进展
大肠杆菌表达系统因为其遗传背景清楚,低成本,高生产率,特征明确,兼容多种抗体[1]使之成为目前常用的外源蛋白原核表达系统.近年来,重组大肠杆菌的高密度发酵是现代基因工程产品大规模生产的重要技术.采用高密度发酵技术,提高菌体的发酵技术,提高菌体的发酵密度,终提高产物的比生产率,不仅可以减少培养体积、优化下游分离提取,还可以缩短生产周期、降低生产成本,从而极大地提高在市场上的竞争力.然而在研究高效发酵过程中,人们往往会遇到表达效率难以得到大限度的提高与产率较低等问题.因此本文将就外源基因本身特性对于高效表达的影响,表达系统的特性对于高效表达的影响,外源基因与系统间的相互作用及其他因素等方面阐明外源基因高效表达的影响因素.终总结出一套高效表达的策略.
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原核表达系统制备HPV58L1VLP可诱发高滴度且持久的中和抗体
目的:采用大肠杆菌表达系统制备人乳头瘤病毒58型(human papillomavirus type 58,HPV58)病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)疫苗.方法:合成法获得HPV58 L1大肠杆菌密码子优化基因,构建HPV58 L1重组原核表达质粒mpET22b/HPV58 L1,检测其在BL21(DE3)中表达水平,饱和硫酸铵沉淀加阳离子交换层析法纯化蛋白后进行动态光散射(dynamic light scatter,DLS)分析.小鼠免疫后,检测免疫血清针对HPV58假病毒的中和抗体水平.结果:HPV58 L1蛋白在BL21(DE3)细胞中大部分以可溶形式表达,纯化获得的HPV58 L1蛋白可组装成水动力学直径约为74 nm的VLP.0.5 μg的HPV58 L1 VLP可诱发小鼠产生高滴度的HPV58特异性中和抗体,可维持至少20周.结论:原核表达系统制备的HPV58 L1 VLP可诱发高滴度且持久的中和抗体,可用于成本低的HPV58疫苗的研究.
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大肠杆菌表达系统的研究进展
近年来利用基因调控、融合表达、共表达以及代谢工程、定向进化等策略对大肠杆菌系统的载体和宿主进行了合理的改进,使目的基因的表达水平以及产物蛋白的活性大大提高,尤其是对长期以来有关真核基因在原核细胞中表达所存在的糖基化、二硫键形成等翻译后加工问题的研究取得了突破,使得大肠杆菌表达系统在研究和生产中的应用范围得到进一步拓宽.文章从表达载体和宿主细胞两个方面对大肠杆菌表达系统的研究进展进行了综述.
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具有自激活切割活性肠激酶轻链基因设计、表达及活性研究
目的 获得Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列+牛EKL的cDNA序列,实现EKL基因在大肠杆菌中的融合表达和自切割.方法 用Trizol法从牛十二指肠组织中提取总RNA.利用RT-PCR技术扩增其cDNA片段,将此片段克隆于表达载体pGEX-2T,并在其前引入肠激酶(EK)识别序列.结果 所表达蛋白经SDS-PAGE分析.相对分子质量约为61 000,经GST-Sepharose亲和色谱柱纯化后得到单一蛋白,SDS-PAGE显示单一条带,用微量EK引发自切割,切断GST标签蛋白和Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列,采用对氨基苯甲脒-Sepharose亲和色谱获得了轻链EK的单体.结论 成功地克隆、表达了牛EK轻链基因,采用自激活、切割获得了EK单体,每1 L培养基获得EK 5 mg,为进一步进行重组牛EK活性的研究及应用奠定了基础.
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表达纯化糖原合成酶激酶3β的两种方法比较
目的 建立一套高纯度、高活性表达糖原合成酶激酶3β的技术.方法 分别采用大肠杆菌和杆状病毒昆虫细胞蛋白表达系统表达糖原合成酶激酶3β,通过His和GST标签两步纯化目的 蛋白,SDS-PAGE观察目的 蛋白的纯度,激酶反应观察目的 蛋白的活性.结果 大肠杆菌表达纯化的糖原合成酶激酶3β占纯化后总蛋白的壁为54%,昆虫细胞表达纯化的糖原合成酶激酶3p占纯化后总蛋白的量为96%;昆虫细胞来源的目的 蛋白比大肠杆菌来源的目的 蛋白活性高-倍左右.结论 相比大肠杆菌表达的糖原合成酶激酶3β,昆虫细胞表达的目的 蛋白具有更高的纯度和活性.
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人工合成人表皮生长因子在大肠杆菌中的表达
目的:在大肠杆菌中高效表达人表皮生长因子(hEGF), 并探索提高外源基因在pE T-3c:BL(DE3)表达系统的表达水平的途径.方法:根据大肠杆菌对密码的偏爱性, 合成编码53个氨基酸的hEGF基因,分别以非融合蛋白和融合蛋白两种方式表达.计算机分析两者mRNA的翻译起始区(translation initiation region,TIR)的结构.结果 :融合蛋白表达产量为27%,非融合蛋白的表达用SDS-PAGE检测不到,两者均具有促细胞增殖的活性. 融合蛋白mRNA的TIR的ΔG值较非融合蛋白的高.结论:在pET-3c:BL21(D E3)大肠杆菌表达系统中,以融合蛋白方式表达人表皮生长因子,表达效率高且不影响其活性.此外,mRNA 的TIR的结构可能是影响外源基因在本研究的表达系统的表达效率的一个重要因素.
