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人β-NGF在大肠杆菌中的表达、纯化及活性测定
目的 利用大肠杆菌表达系统表达经密码子突变的重组人神经生长因子(rhβ-NGF),并对表达产物进行分离纯化和生物学活性鉴定.方法 利用化学合成法合成经密码子突变后的人神经生长因子β亚基成熟肽段基因及前导肽基因;构建原核表达载体pET28a(+)+[rhβ-NGF],转化大肠杆菌株BL21(λDE3),获得基因工程菌;利用IPTG诱导rhβ-NGF在基因工程菌中表达并收集菌体;分离纯化包涵体蛋白,经体外复性及肠激酶切割去除前导肽后进一步通过镍柱亲和色谱获得rhβ-NGF;通过PC12细胞存活法检测rhβ-NGF的活性.结果 构建的基因工程菌能大量表达包涵体蛋白,体外稀释复性后获得的重组蛋白经SDS-PAGE电泳检测其纯度大于95％,Western blot检测其为目标蛋白;重组蛋白经肠激酶切割及进一步分离纯化后得到的目的蛋白经SDS-PAGE电泳检测为单一条带,纯度大于99％;经Western blot鉴定其为rhβ-NGF;生物学活性检测结果显示其比活性约为500000 u·mg-1.结论 通过优化设计密码子,建立重组人神经生长因子大肠杆菌表达系统,并实现其在大肠杆菌中的高水平表达.
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血管性血友病因子前导肽的作用及临床价值
血管性血友病因子（von Willebrand factor, VWF）是血浆中参与止血和凝血过程的重要蛋白分子。在初期止血中， VWF一头连接在受损的内皮细胞表面，一头锚定血小板表面的糖蛋白Ⅰb，介导血小板在血管损伤部位发生黏附反应。在二期止血中，VWF作为凝血因子Ⅷ（FⅧ）的载体，保护血液循环中的FⅧ不被降解，从而延长了FⅧ的半衰期。VWF的前导肽（VWF propeptide, VWFpp）在细胞合成、分泌等过程中发挥重要作用，VWFpp突变可导致血管性血友病。近年来研究表明，VWFpp在VWD和其他疾病的诊断中也具有重要价值。
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有关前导肽影响目标蛋白表达及活性的研究与展望
选择目前已报道的5种含有前导肽的目标蛋白（枯草杆菌蛋白酶、α-水解蛋白酶、米根霉脂肪酶、华根霉脂肪酶、米黑霉脂肪酶），对其表达情况与活性测定的结果进行对比，结果表明前导肽的存在对目标蛋白的正确表达具有重要意义。通过分析前导肽的变化对成熟蛋白活性的影响，提出前导肽进化对目标蛋白进化具有重要意义。
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核糖体停靠与抗生素耐药
蛋白质在核糖体的合成受多个分子层面的精细调控,包括核糖体停靠(ribosome stalling,亦称为核糖体延宕)机制,即核糖体可与tRNA及氨基酸、肽或其它化合物如抗生素持久结合形成复合物,使核糖体停靠在正在转录的前导肽mRNA的开放阅读框内,并促使前导肽下游未翻译结构基因如耐药基因mRNA的表达.核糖体停靠需要前导肽参与,可分为非抗生素依赖和抗生素依赖两种类型,后者诱导多种作用于核糖体靶位抗生素(如大环内酯类、氯霉素类及四环素类等)的耐药性形成.对大环内酯类介导的核糖体停靠已有深入了解,这些研究有助于了解抗生素耐药机制及进化,并从干扰蛋白质表达的角度探索控制耐药性和研发新型抗菌化合物.本文也讨论了影响蛋白质表达的核糖体拯救(ribosme rescue)和核糖开关(riboswitch)机制.
关键词： 抗生素耐药 核糖体停靠(核糖体延宕) 核糖体拯救 核糖开关 前导肽
