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凝血纤溶系统相关因子与多囊卵巢综合征妇女先兆流产预后的关系
目的 探讨凝血纤溶系统相关因子与多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)妇女先兆流产后出现的不同妊娠结局的关系以及与胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)、血脂、体重指数(BMI)的相关性. 方法 收集PCOS正常早孕妇女30例,PCOS先兆流产经治疗后继续妊娠28例,保胎失败(难免流产)32例.检测凝血因子Ⅷ(FⅧ)活性、凝血因子X(FX)活性、纤溶酶原活化剂抑制物(PAI-1)和组织型纤溶酶原活化剂(t-PA)水平,以及IR、血脂与BMI. 结果 与正常早孕组相比,继续妊娠组FⅧ活性、FX活性升高,差异有统计学意义(P＜0.05)；难免流产组中FⅧ活性、FX活性、PAI-1和t-PA水平升高,差异有统计学意义(P＜0.05).与继续妊娠组相比,PAI-1水平升高,差异有统计学意义(P＜0.05).多元线性回归分析结果显示,难免流产组中PAI-1水平与胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、低密度脂蛋白(LDL)、BMI呈正相关.回归方程的决定系数R2 =0.79. 结论 难免流产组中,PAI-1水平有明显的升高.PCOS妊娠患者可以通过PAI-1水平,以及HOMA-IR、BMI、血脂测定来预测先兆流产的预后.
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注射用重组人凝血因子Ⅷ大鼠单次与反复给药毒性研究
目的 进行注射用重组人凝血因子Ⅷ的大鼠药物安全性评价,为临床安全用药提供参考信息.方法 急性毒性试验对SD大鼠采用大给药剂量法(66 460 IU/kg·bw),观察给药后大鼠出现的毒性反应.反复给药毒性试验设50、250和1 250 IU/kg·bw 3个给药组(分别相当于临床剂量的1、5和25倍)及溶剂对照组,连续给药30 d,停药后恢复期观察4周.结果 急性毒性试验,动物临床观察结果、体重、大体解剖结果,给药组与对照组相比未见任何显著性差异.30 d连续给药试验中,出现与凝血因子Ⅷ抑制物相关的临床症状,如APTT延长、出血和A/G降低等,未发现与给药明确相关的毒性病理改变,未见明显与给药相关的延迟或蓄积毒性.结论 SD大鼠单次静脉注射注射用重组人凝血因子Ⅷ的大耐受剂量大于66 460 IU/kg·bw;30 d重复给药未见明显毒性反应剂量(NOAEL)为1 250 IU/kg·bw.本试验结果为该品的临床应用提供了参考数据.
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肝脏疾病应用D-二聚体、抗凝血酶Ⅲ、凝血因子Ⅷ、凝血因子Ⅸ检测对诊断患者病情的意义
目的:探讨肝脏疾病应用D-二聚体、抗凝血酶Ⅲ、凝血因子Ⅷ、凝血因子Ⅸ检测对患者病情诊断的意义.方法:收治肝脏疾病患者60例,选择健康体检者20例,分为肝硬化组、肝炎组、肝癌组、健康人群组,分别检测血浆D-二聚体、抗凝血酶Ⅲ、凝血因子Ⅷ、凝血因子Ⅸ.结果:与健康人群组相比,肝癌与肝硬化组的D-二聚体含量上升明显,3组肝脏疾病患者的凝血因子Ⅷ显著升高;肝癌组的凝血因子Ⅸ较健康人群组显著升高;肝炎组和肝硬化组的抗凝血酶Ⅲ较健康人群组活性显著降低.结论:对肝脏疾病行病情诊断时,应加强检测血浆中D-二聚体、抗凝血酶Ⅲ、凝血因子Ⅷ、凝血因子Ⅸ,以提高病情诊断准确性.
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静脉采血对凝血四项结果的影响
血液标本凝固与抗凝剂有关:①抗凝剂加入试管中过少;②从正在输液的静脉导管中抽血造成抗凝剂浓度降低;③误用同种但不同浓度的抗凝剂,如血沉枸橼酸钠抗凝浓度3.8%,凝血四项枸橼酸钠抗凝浓度3.2%;④注入血液标本量过多;⑤枸橼酸钠是钙离子的快速螯合剂,能有效阻止凝血因子V和凝血因子Ⅷ降解,并能稀释血液,所以应严格按1:9比例抗凝.
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人凝血因子Ⅷ的小鼠急性毒性实验研究
为探究人凝血因子Ⅷ对机体的毒性效应,于2013年6～7月采用完全随机法对小鼠分组,通过剂量摸索性实验、预实验和大耐受剂量实验对人凝血因子Ⅷ在小鼠体内的急性毒性进行了初步研究.结果表明,人凝血因子Ⅷ大浓度64 IU/ml,大体积0.5 ml/20 g鼠次;尾静脉注射,每日2次(相隔6h),剂量为3 200 IU/kg,20只小鼠摄食、饮水、大小便及行为、活动、体重、死亡等指标均未发生异常病变;人凝血因子Ⅷ对小鼠的大耐受量推算为3 200 IU/kg,人凝血因子Ⅷ注射显示的临床剂量安全无毒.
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国内凝血因子Ⅷ短缺状况及应对策略研究
目的 解决国内凝血因子Ⅷ短缺的问题.方法 文献研究和案例研究相结合,运用比较的方法从其原料的角度分析了凝血因子Ⅷ短缺的问题并提出了应对策略.结果 国内凝血因子Ⅷ短缺的主要原因是血浆原料的短缺,而血浆原料的短缺是我国对单采血浆站点的整顿转制造成的.结论 解决国内凝血因子Ⅷ短缺的问题首先要保证原料血浆的供应,通过采取缩短采浆周期稳定供浆队伍等措施提高单采血浆量.
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冷沉淀制备技术在血液成分制备中的应用
目的:通过血液成分冷沉淀的制备研究,开发新的血液品种,确保临床用血的需要.方法:用新鲜冰冻血浆通过解冻、融化、分离、离心、冰冻等工序制备冷沉淀;随机抽取20份已制备好的冷沉淀采用血凝仪检测FⅧ和Fg的含量.结果:新鲜冰冻血浆通过解冻、融化、分离、离心、冰冻等工序制备的冷沉淀容量27±2ml,FⅧ141.32±35IU/袋,Fg210±20mg/袋.结论:我们制备的冷沉淀技术方法先进,产品符合国家<全血及成分血质量要求>为合格的血液品种,是临床治疗中常用血液成分,为临床治疗甲型血友病、血管性血友病,先天性或获得性纤维蛋白原缺乏症等患者的的治疗提供了保障,值得推广运用.
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结核继发获得性血友病甲1例
获得性血友病甲(acquired hemophilia,AH)是指由于体内产生抑制凝血因子Ⅷ(FⅧ)的特异性自身抗体而引起的出血性疾病[1],其临床表现与典型血友病相似.本病发病突然,出血症状严重,常危及生命.病死率高达22%～44%[2],死因主要是出血和感染.
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RNAi介导的Bip表达下调促进基于蛋白质剪接的双链共转基因细胞分泌FⅧ凝血活性
目的 探讨用RNA干扰技术下调内质网蛋白伴侣免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的表达,对基于蛋白质剪接的双链共转凝血因子VIII (FⅧ)基因HEK293细胞分泌剪接FⅧ蛋白的量和活性的影响.方法 以培养的HEK293细胞,用含蛋白内含子的B区缺失型FⅧ( BDD-FⅧ)的重链和轻链基因表达载体共转染经Bip-siRNA处理的细胞,免疫印迹法检测Bip的表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞生长,用酶联免疫吸附( ELISA)和发色分析法分析转基因细胞分泌的剪接BDD-FⅧ蛋白量和活性.结果 RNA干扰下调Bip表达作用明显,细胞生长不受影响；Bip下调的共转基因细胞分泌的剪接BDD-FⅧ和重链量分别为(142±33) μg/L和(197±43) μg/L,明显高于对照细胞[分别为(89±23)μg/L和(120±27) μg/L]；Bip下调的共转基因细胞分泌的FⅧ凝血活性为(1 050±160)IU/L,明显高于对照细胞[640±170(IU/L)].结论 Bip表达下调通过促进剪接BDD-FⅧ的分泌可有效提高基于蛋白质剪接的双载体转BDD-FⅧ基因功效,为进一步动物体内实验提供了依据.
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机采血小板悬液在保存过程中凝血因子Ⅷ、Ⅸ生物活性的变化
为了研究机采血小板悬液22℃振荡保存不同时间的凝血因子Ⅷ、Ⅸ生物活性的变化,采用SYSMEXCA-1500型全自动血凝仪对用CS-3000plus血细胞分离机采集的18份血小板悬液于22℃振荡保存条件下,测定0、12、24、48、72、96、120小时7个时间段的FⅧ:C和FⅨ:C的活性.结果表明:机采血小板FⅧ:C在0时活性为(100.51±44.02)%,保存12-120小时,其活性衰减了10%-40%;FⅨ:C在0时活性为(120.93±20.50)%,保存24-120小时,其活性衰减了10%-35%.结论:机采血小板悬液于22℃振荡保存时凝血因子Ⅷ、Ⅸ仍保持有较高的生物学活性.
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精子载体介导的人凝血因子Ⅷ基因在转基因小鼠体内的表达
利用精子载体技术通过人工授精观察人凝血因子Ⅷ基因在转基因小鼠体内的表达.将含有人FⅧBD(B-domain deleted)cDNA的质粒pRC/RSV-hFⅧBD转染至小鼠精子,通过人工授精使母鼠受孕.新生小鼠出生后第4周,应用PCR筛查hFⅧBD cDNA阳性转基因幼鼠,取转有人FⅧBD cDNA幼鼠的血液检测血浆中的人FⅧ抗原和抗体,分别用Northern印迹和Western印迹检测脾、肝、肺和肾组织中人FⅧBD cDNA的转录和表达.结果发现,人工授精后20只受体母鼠7只受孕,共产下11只仔鼠,存活9只.PCR筛检出3只转有人FⅧBD cDNA的阳性鼠.3只阳性鼠血浆中的人FⅧ抗原量分别为8.65 ng/ml,7.84 ng/ml和8.44 ng/ml,人FⅧ的抗体均为阴性.Northern印迹和Western印迹检测显示3只F1代阳性幼鼠的脾、肝、肺和肾组织中均有人FⅧBD cDNA的转录和表达.结论提示,利用精子载体法可以制备转有人凝血因子Ⅷ基因的转基因小鼠,并表达人FⅧ蛋白,这为用精子载体技术生产转基因动物并将之作为生物反应器生产人凝血因子Ⅷ提供了实验依据.
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人凝血因子ⅧcDNA在小鼠体内的转染与表达
本研究观察逆转录病毒载体和聚酰胺-胺型(PAMAM)树枝状聚合物介导的人凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因在小鼠体内的转染和表达,并与体外转染方法作比较.应用含B区缺失(760aa-1639aa)人FⅧcDNA(FⅧBD cDNA)的以逆转录病毒为框架的重组表达质粒载体pLNC-FⅧBD包装成为逆转录病毒LNC-FⅧBD,ex vivo转染小鼠骨髓基质细胞,同时将pLNC-FⅧBD与PAMAM树枝状聚合物按照1:15混合以形成复合体PAMAM-pLNC-FⅧBD进行小鼠in vivo转染.分别于注射后第24,48小时,第1,2,3,4周取血,分离血浆,采用一期法测定人FⅧ活性(FⅧ c),ELISA法测定人FⅧ抗原(FⅧAg),并采用Bethesdainhibitor assay测定人FⅧ抗体;同时取脏器肝、脾、肺、肾提取RNA,进行RT-PCR,观察各组织的转录,并用苏木素-伊红染色法观察各组织的形态学改变.结果表明,逆转录病毒转染人FⅧ基因的骨髓基质细胞输入体内后,可以在体内继续表达人FⅧ,并且能有效地分泌至血液中.宿主小鼠体内可检测到的人FⅧ表达持续3周以上,注射后第24小时表达高水平,人FⅧAg平均为8.6 ng/ml,此后人FⅧ抗体逐渐生成,人FⅧAg水平渐低,于注射后第4周不再能测出人FⅧAg.注射复合体PAMAM-pLNC-F ⅧBD在体内转染后,获得了短暂的人FⅧ生理水平的表达,在注射后第48小时表达水平高,人FⅧc和FⅧAg 的平均水平分别为0.62U/ml和115.5 ng/ml;注射后第3周平均水平降至0.042U/ml.RT-PCR结果表明,各脏器表达人FⅧ的水平不一,脾脏和肺脏表达水平高,且时间长,注射后各个时间点的小鼠血浆均未见人FⅧ抗体产生.组织病理学检查未发现小鼠各器官组织有病理改变.结论:经逆转录病毒介导的人FⅧ经ex vivo转染于BALB小鼠体内,其表达人FⅧ水平较低且该小鼠免疫原性增强,容易产生抗体;C57BL/6J小鼠在注射复合体PAMAM-pLNC-hFⅧBD(即体内转染)后可获得短暂的人FⅧ生理水平的表达,在注射后第48小时表达水平高,至少可持续表达2周以上.
关键词： 逆转录病毒 聚酰胺-胺型树枝状聚合物 凝血因子Ⅷ 基因治疗 -
长距离PCR检测重型血友病A病人凝血因子Ⅷ基因倒位
为了筛查山东省重型血友病A(hemophilia A, HA)凝血因子Ⅷ基因倒位的患者并检出携带者,采用长距离DNA扩增(LD-PCR)方法,以0.6%琼脂糖凝胶电泳技术,检测临床上确诊的55例重型HA患者及其家系成员中是否存在凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因倒位.电泳出现11 kb带,示凝血因子Ⅷ基因倒位;12 kb带,示非倒位;这两条带同时出现者为凝血因子Ⅷ基因倒位携带者.结果表明:55例无亲缘关系的重型HA患者中,发现22例患者(或家系成员)有凝血因子Ⅷ基因倒位,占重型HA患者的40%;15个家系中查出基因倒位携带者5名.结论:运用LD-PCR技术可以准确、简便、快速地检测重型血友病A患者是否存在凝血因子Ⅷ基因倒位.
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Lman1基因复合杂合突变导致的凝血因子Ⅴ、Ⅷ联合缺乏症
凝血因子Ⅴ和Ⅷ(FV、FⅧ)联合缺乏症(F5F8D)是一种罕见的常染色体隐性遗传性出血性疾病.近年的研究发现,该病病因在于基因lman1或mcfd2的突变.本研究的目的是对1名F5F8D先证者及其家系成员的lman1、mcfd2基因进行扩增、测序,以查找潜在的致病突变.采集了先证者及其父母的外周血样本,进行了凝血功能相关检查,包括活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(JTT)、血浆纤维蛋白原(Fg)、FⅤ促凝活性(FⅤ:C)、FⅧ促凝活性(FⅧ:C),并提取基因组DNA,通过PCR法对先证者lman1基因的13个外显子及侧翼序列、mcfd2基因的4个外显子及侧翼序列进行特异性扩增,产物经纯化后直接测序,以检测致病突变.根据先证者突变所在位点,选择性扩增其父、母的相应片段,纯化、测序,以便进行家系分析.结果表明:先证者APTT 82.2秒、PT19.6秒、TT 18.6秒,Fg2.9 g/l,FⅤ:C 7.1%,FⅧ:C 18.7%.先证者及其母亲lman1基因第8外显子区出现杂合性单碱基插入c.912_913insA,导致蛋白序列改变p.Glu305fsX20;先证者及其父亲lman1基因11外显子区出现杂合性无义突变c.1366C＞T,导致p.Arg456X.结论:先证者lman1基因的复合杂合突变c.912_913insA、c.1366C＞T是导致其发病的原因;前者继承自其母,后者继承自其父.这种复合杂合突变的组合方式尚未见有报道.
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我国血液制品中人细小病毒B19污染情况及基因型的初步研究
目的 分析我国血液制品凝血因子Ⅷ及原料血浆中人B19病毒污染情况及B19病毒的基因型.方法 以B19病毒VP1/VP2区引物采用套式PCR法分别检测16批凝血因子Ⅷ成品及10批混合原料血浆中B19病毒的污染情况,并对阳性样品中B19病毒DNA的NS1-VP1u区进行测序和基因型分析.结果 16批凝血因子Ⅷ中B19病毒DNA阳性率为75%(12/16),10批混合原料血浆中B19病毒DNA阳性率为100%(10/10).序列测定结果表明,所有B19阳性样品中的病毒序列高度保守,同源性为98.3%-100%,且均为基因型I型.结论 我国凝血因子Ⅷ及原料血浆中B19病毒Ⅰ型污染率高,病毒核苷酸具有较高的保守性.
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尿毒症合并血友病A行腹膜透析治疗1例
血友病为一组X-性联隐性遗传的出血疾病，其临床上分为血友病A和血友病B2型，分别由凝血因子Ⅷ和凝血因子Ⅸ基因突变所致。血友病A较血友病B更为常见，占总数的80%～85%。根据患者出血的严重程度及其血浆凝血因子Ⅷ(FⅧ)活性，国内将血友病A分为4型：重型(＜1%)，中型(1%～5%)，轻型(5%～25%)，亚临床型(25%～45%)。随着凝血因子替代治疗的普及，血友病存活率明显升高，同时也面临着增龄相关的健康问题。近年来陆续有关于血友病合并终末期肾脏病的报道，关于替代治疗方式的选择仍存在争议。现将深圳市第二人民医院1例尿毒症合并血友病A行腹膜透析治疗的病例报告如下。
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一例老年获得性凝血因子Ⅷ减少症的护理
获得性凝血因子Ⅷ减少症是一种少见的凝血障碍性疾病.为药物、感染或自身免疫性疾病致体内产生Ⅷ因子抗体,从而引起体内Ⅷ因子缺乏并出血.1998年9月我科治疗1例高龄老年获得性凝血因子Ⅷ减少症并出血病人,收到较好止血效果.现将临床观察及护理体会报告如下.
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云南省三民族人FⅧ基因XbaⅠ限制性片段长度多态性研究
血友病甲是由于凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因缺陷所致的X染色体连锁隐性遗传性疾病[1],FⅧ基因定位于X染色体长臂末端2区8带(Xq28)全长约186 kb,包括26个外显子和25个内含子.目前多利用DNA限制性内切酶片段长度多态性(RFLPs)[2]和可变数目串联重复顺序(VNTR)[3,4]作为遗传标志进行有缺陷基因的连锁分析和产前诊断.但多态性位点在不同人种、不同民族、不同地区人群中出现的频率各异,为获得不同民族FⅧ基因的遗传多态性及其信息量,我们应用聚合酶链反应(PCR)技术特异性扩增了云南省傣、彝、汉族人群FⅧ基因22内含子XbaⅠ限制性内切酶片段长度多态性位点的DNA序列,以确定该位点在上述三个民族中的诊断价值.
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改良PCR技术检测凝血因子Ⅷ基因内含子22倒位
血友病A( hemophilia A,HA)是常见的X染色体连锁隐性出血性疾病,活产男婴中发病率为1/5000[1].主要因凝血因子Ⅷ(FⅧ)的遗传性缺陷或缺乏所致,患者常自发性或外伤后出血不止,严重可危及生命,目前对该病尚无有效根治措施.HA分为轻、中、重3种类型,相应的凝血因子活性水平分别为＜1％、1％ ～5％和5％ ～ 30％.
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人抗鼠抗体效应对临床免疫学检测的影响
人抗动物抗体产生的原因为医源性与非医源性因素.医源性因素包括动物源性蛋白、胸腺肽、靶抗体造影剂、靶抗体药物、被动免疫动物血制品(如破伤风针、胰岛素、凝血因子Ⅷ)等;非医源性因素包括母婴传递、偶然或职业性原因与动物蛋白接触史(如兽医、牧区、食品加工人员、宠物饲养)、选择性IgA缺乏症患者食人牛奶及动物蛋白食品等.
