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人凝血因子ⅧcDNA在小鼠体内的转染与表达
本研究观察逆转录病毒载体和聚酰胺-胺型(PAMAM)树枝状聚合物介导的人凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因在小鼠体内的转染和表达,并与体外转染方法作比较.应用含B区缺失(760aa-1639aa)人FⅧcDNA(FⅧBD cDNA)的以逆转录病毒为框架的重组表达质粒载体pLNC-FⅧBD包装成为逆转录病毒LNC-FⅧBD,ex vivo转染小鼠骨髓基质细胞,同时将pLNC-FⅧBD与PAMAM树枝状聚合物按照1:15混合以形成复合体PAMAM-pLNC-FⅧBD进行小鼠in vivo转染.分别于注射后第24,48小时,第1,2,3,4周取血,分离血浆,采用一期法测定人FⅧ活性(FⅧ c),ELISA法测定人FⅧ抗原(FⅧAg),并采用Bethesdainhibitor assay测定人FⅧ抗体;同时取脏器肝、脾、肺、肾提取RNA,进行RT-PCR,观察各组织的转录,并用苏木素-伊红染色法观察各组织的形态学改变.结果表明,逆转录病毒转染人FⅧ基因的骨髓基质细胞输入体内后,可以在体内继续表达人FⅧ,并且能有效地分泌至血液中.宿主小鼠体内可检测到的人FⅧ表达持续3周以上,注射后第24小时表达高水平,人FⅧAg平均为8.6 ng/ml,此后人FⅧ抗体逐渐生成,人FⅧAg水平渐低,于注射后第4周不再能测出人FⅧAg.注射复合体PAMAM-pLNC-F ⅧBD在体内转染后,获得了短暂的人FⅧ生理水平的表达,在注射后第48小时表达水平高,人FⅧc和FⅧAg 的平均水平分别为0.62U/ml和115.5 ng/ml;注射后第3周平均水平降至0.042U/ml.RT-PCR结果表明,各脏器表达人FⅧ的水平不一,脾脏和肺脏表达水平高,且时间长,注射后各个时间点的小鼠血浆均未见人FⅧ抗体产生.组织病理学检查未发现小鼠各器官组织有病理改变.结论:经逆转录病毒介导的人FⅧ经ex vivo转染于BALB小鼠体内,其表达人FⅧ水平较低且该小鼠免疫原性增强,容易产生抗体;C57BL/6J小鼠在注射复合体PAMAM-pLNC-hFⅧBD(即体内转染)后可获得短暂的人FⅧ生理水平的表达,在注射后第48小时表达水平高,至少可持续表达2周以上.
关键词： 逆转录病毒 聚酰胺-胺型树枝状聚合物 凝血因子Ⅷ 基因治疗 -
聚酰胺-胺型树枝状聚合物介导人凝血因子Ⅷ的体外高效稳定表达
目的应用纳米材料聚酰胺-胺型(PAMAM)树枝状聚合物/逆病毒基础的质粒载体复合体,在表达水平、持续时间和细胞毒性三方面进行血友病A基因治疗的体外研究.方法 PAMAM树枝状聚合物与含B区缺失(760 aa～1 639 aa)人FⅧ cDNA(FⅧBD cDNA)的以逆病毒为框架的重组表达质粒载体pLNC-FⅧBD形成复合体后,转染NIH3T3细胞系,于转染后第2,5,10,15,30 d留取细胞培养上清,分别采用一期法和ELISA法检测其中人FⅧ的凝血活性(FⅧ∶C)和抗原含量(FⅧ∶Ag),并应用RT-PCR方法检测细胞中FⅧBD cDNA的转录,以细胞生长抑制率来表示PAMAM的细胞毒性.结果 PAMAM载体介导的人FⅧ的体外表达可持续30 d,24 h内每ml细胞上清中106细胞表达FⅧ∶C平均为0.929 U,FⅧ∶Ag平均为0.188 μg,期间FⅧ表达未见降低;PAMAM的细胞生长抑制率为5.32%.结论 PAMAM能够有效介导逆病毒基础的质粒载体pLNC-FⅧBD转染靶细胞,并维持高效稳定表达,且PAMAM的细胞毒性较低.
关键词： 纳米材料 聚酰胺-胺型树枝状聚合物 血液凝固因子Ⅷ 基因表达 -
聚酰胺-胺型树枝状聚合物介导的基因治疗
聚酰胺-胺型(polyamidoamine, PAMAM)树枝状聚合物是一种新兴起的非病毒类纳米材料载体,可有效地转染外源基因进入细胞.本文对其结构特征及转染机理作一综述.
关键词： 聚酰胺-胺型树枝状聚合物 载体 基因治疗
