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聚酰胺-胺型树枝状聚合物介导人凝血因子Ⅷ的体外高效稳定表达
目的应用纳米材料聚酰胺-胺型(PAMAM)树枝状聚合物/逆病毒基础的质粒载体复合体,在表达水平、持续时间和细胞毒性三方面进行血友病A基因治疗的体外研究.方法 PAMAM树枝状聚合物与含B区缺失(760 aa～1 639 aa)人FⅧ cDNA(FⅧBD cDNA)的以逆病毒为框架的重组表达质粒载体pLNC-FⅧBD形成复合体后,转染NIH3T3细胞系,于转染后第2,5,10,15,30 d留取细胞培养上清,分别采用一期法和ELISA法检测其中人FⅧ的凝血活性(FⅧ∶C)和抗原含量(FⅧ∶Ag),并应用RT-PCR方法检测细胞中FⅧBD cDNA的转录,以细胞生长抑制率来表示PAMAM的细胞毒性.结果 PAMAM载体介导的人FⅧ的体外表达可持续30 d,24 h内每ml细胞上清中106细胞表达FⅧ∶C平均为0.929 U,FⅧ∶Ag平均为0.188 μg,期间FⅧ表达未见降低;PAMAM的细胞生长抑制率为5.32%.结论 PAMAM能够有效介导逆病毒基础的质粒载体pLNC-FⅧBD转染靶细胞,并维持高效稳定表达,且PAMAM的细胞毒性较低.
关键词： 纳米材料 聚酰胺-胺型树枝状聚合物 血液凝固因子Ⅷ 基因表达 -
丁酸钠诱导人凝血因子Ⅷ的体外表达
目的观察丁酸钠对人凝血因子Ⅷ(hFⅧ)表达的作用,并初步探讨其机制.方法采用B区缺失(760～1 639氨基酸)的hFⅧ cDNA(BDD-hFⅧ cDNA)的重组质粒载体pRC/RSV-BDD-hFⅧ转化体外培养的小鼠NIH/3T3细胞,经丁酸钠作用后,分别采用一期法和ELISA法检测细胞培养上清中hFⅧ的活性(hFⅧ∶C)和抗原含量(hFⅧ∶Ag),并运用体外细胞核连缀反应技术(Run-on assay)观察丁酸钠对编码BDD-hFⅧ全长、重链和轻链的cDNA转录的影响.结果经丁酸钠诱导后,hFⅧ∶C和hFⅧ∶Ag较对照组提高了约70%.Run-on assay显示丁酸钠通过增强BDD-hFⅧ重链基因的转录进而增强BDD-hFⅧcDNA全长的转录,因而提高hFⅧ cDNA的表达水平.结论丁酸钠通过增强编码hFⅧ重链cDNA的转录进而提高hFⅧ的表达水平,因而是一个很有前途的诱导hFⅧ表达的化学物.
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逆转录病毒载体介导人凝血因子Ⅷ在肝细胞中的表达
目的 建立逆转录病毒载体介导的人凝血因子Ⅷ(FⅧ)鼠肝细胞BRL-3A.方法 将一B区缺失(760～1 639 aa)的人FⅧ cDNA(FⅧBD cDNA)克隆至逆转录病毒载体pLNCX2,构建重组表达载体pLNCX2-FⅧBD.感染BRL-3A细胞,分别采用一期法、ELISA法检测细胞培养上清中人FⅧ的凝血活性(FⅧ:C)和抗原含量(FⅧ:Ag).结果 pLNCX2-FⅧBD在鼠肝细胞BRL-3A细胞中获得良好表达,在24 h内每毫升中106细胞表达FⅧ:C为1.12 U,FⅧ:Ag为350 ng.结论 逆转录病毒载体能够介导人FⅧ在肝细胞中的表达,为血友病A的基因治疗奠定了基础.
