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肝脏疾病应用D-二聚体、抗凝血酶Ⅲ、凝血因子Ⅷ、凝血因子Ⅸ检测对诊断患者病情的意义
目的:探讨肝脏疾病应用D-二聚体、抗凝血酶Ⅲ、凝血因子Ⅷ、凝血因子Ⅸ检测对患者病情诊断的意义.方法:收治肝脏疾病患者60例,选择健康体检者20例,分为肝硬化组、肝炎组、肝癌组、健康人群组,分别检测血浆D-二聚体、抗凝血酶Ⅲ、凝血因子Ⅷ、凝血因子Ⅸ.结果:与健康人群组相比,肝癌与肝硬化组的D-二聚体含量上升明显,3组肝脏疾病患者的凝血因子Ⅷ显著升高;肝癌组的凝血因子Ⅸ较健康人群组显著升高;肝炎组和肝硬化组的抗凝血酶Ⅲ较健康人群组活性显著降低.结论:对肝脏疾病行病情诊断时,应加强检测血浆中D-二聚体、抗凝血酶Ⅲ、凝血因子Ⅷ、凝血因子Ⅸ,以提高病情诊断准确性.
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机采血小板悬液在保存过程中凝血因子Ⅷ、Ⅸ生物活性的变化
为了研究机采血小板悬液22℃振荡保存不同时间的凝血因子Ⅷ、Ⅸ生物活性的变化,采用SYSMEXCA-1500型全自动血凝仪对用CS-3000plus血细胞分离机采集的18份血小板悬液于22℃振荡保存条件下,测定0、12、24、48、72、96、120小时7个时间段的FⅧ:C和FⅨ:C的活性.结果表明:机采血小板FⅧ:C在0时活性为(100.51±44.02)%,保存12-120小时,其活性衰减了10%-40%;FⅨ:C在0时活性为(120.93±20.50)%,保存24-120小时,其活性衰减了10%-35%.结论:机采血小板悬液于22℃振荡保存时凝血因子Ⅷ、Ⅸ仍保持有较高的生物学活性.
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凝血因子Ⅸ无义突变真核表达载体的构建及其在COS-7细胞的表达
本研究以含有fⅨcDNA的pcDNA3.1质粒为模板构建4种包含不同类型无义突变的fⅨ真核表达载体并进行鉴定,实现其在COS-7细胞中的表达.采用以PCR为基础的定点突变法体外构建fⅨ基因无义突变体,并通过DNA序列分析进一步鉴定证实;应用脂质体转化技术将野生型、突变型fⅨ表达载体分别瞬时转染COS-7细胞,采用实时定量PCR鉴定fⅨmRNA在各组的相对表达水平.结果表明,4个突变型质粒除相应位点的无义突变外,未见其它突变,提示无义突变载体构建成功.实时定量PCR鉴定表明,各突变组真核表达载体已成功转染COS-7细胞株并能转录为mRNA.结论:采用以PCR为基础的定点突变法可在体外构建fⅨ真核表达载体,并可在COS-7细胞中表达,其转录过程中不引发mRNA降解,这为进一步研究无义突变引起FⅨ功能丧失及表达量降低的机制和治疗研究提供了物质基础.
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人源载体pHrnF9介导的凝血因子Ⅸ基因在肠上皮sw480细胞中的表达
本研究探索肠上皮细胞和人源载体pHrnFIX用于血友病B基因治疗的可能性.用合人凝血因子IX(human coagulation factor Ⅸ,hFⅨ)基因的人源载体质粒pHrnF9转染肠上皮细胞sw480,用RT-PCR检测mRNA的转录,荧光显微镜观察转染效率,ELISA和一期法检测蛋白表达及凝血活性.结果表明:转染后的细胞中有hFⅨ mRNA的转录;荧光显微镜观察到48小时转染效率高;ELISA法测得转染后24小时细胞上清中的hFⅨ蛋白量为(11.34±0.23)ng/(106 cells·24 h),第48小时hFⅨ蛋白量高,迭(29.34±1.00)ng/(106 cells·24 h),转染后72小时降为(12.45±0.15)ng)/(106 cells·24 h).一期法结果显示转染pHrnF9的sw480细胞分泌的FⅨ有凝血活性,48小时达峰值(6.07±0.17)%/106 cells,第72小时降至(1.81±0.06)%/106 cells.结论:肠上皮细胞sw480转染pHrnF9质粒后可表达有凝血活性的hFⅨ,肠上皮细胞有望成为血友病B基因治疗的靶细胞.
关键词： 肠上皮细胞sw480 人源载体pHrnF9 凝血因子Ⅸ 基因治疗 -
应用DNA测序技术检测血友病B患者FⅨ基因突变
为了研究3名中国汉族非亲缘系血友病B患者凝血因子Ⅸ(FⅨ)基因突变的类型,常规检测患者血浆APTT及FⅨ:C,进行表型诊断;抽提患者外周血白细胞基因组DNA,应用PCR技术分8段扩增FⅨ基因外显子序列,用双脱氧终止法检测核酸序列.结果表明:与正常对照者相比,HB患者APTT测定值明显升高,FⅨ:C测定值明显降低,PT测定值正常.测序结果显示3例HB患者均有相应的基因序列改变,患者1有外显子6 G22119A点突变,患者2有外显子1 G7932C点突变,患者3有外显子T32685C点突变.结论:3例HB患者均检测到相应的基因序列改变,这为HB患者基因缺陷的分子机制提供了证据.
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尿毒症合并血友病A行腹膜透析治疗1例
血友病为一组X-性联隐性遗传的出血疾病，其临床上分为血友病A和血友病B2型，分别由凝血因子Ⅷ和凝血因子Ⅸ基因突变所致。血友病A较血友病B更为常见，占总数的80%～85%。根据患者出血的严重程度及其血浆凝血因子Ⅷ(FⅧ)活性，国内将血友病A分为4型：重型(＜1%)，中型(1%～5%)，轻型(5%～25%)，亚临床型(25%～45%)。随着凝血因子替代治疗的普及，血友病存活率明显升高，同时也面临着增龄相关的健康问题。近年来陆续有关于血友病合并终末期肾脏病的报道，关于替代治疗方式的选择仍存在争议。现将深圳市第二人民医院1例尿毒症合并血友病A行腹膜透析治疗的病例报告如下。
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系统性红斑狼疮致凝血因子Ⅺ活性减低一例
患者女,34岁.因反复皮下淤斑、面部红斑5年,淤斑加重1周于2010年7月14日入我院风湿科.患者5年前无明显诱因出现面部红斑、皮下淤斑(以四肢皮肤为多)、光过敏、脱发及双膝关节疼痛,当时在我院查抗核抗体(ANA)(+),抗双链DNA抗体(+),狼疮敏感的部分凝血酶时间(PTT-LA) 95.1 s(参考值34.4 ～40.4 s),血小板30×109/L,APTT＞ 70 s,凝血因子Ⅷ(FⅧ)47.4％(参考值75％ ～ 130％),凝血因子Ⅸ(FⅨ)42.2％(参考值70％～130％),余正常.
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无直接接触史鼠药中毒继发性维生素k依赖因子缺乏1例报告
1临床资料：患儿女，4岁，因“发现全身瘀斑5天”入院入院时查体：查体：T37℃，P140次/min，R30次/min，Wt13Kg，一般情况欠佳，发育、营养尚可，神志清楚，精神欠佳，面色、口唇无发绀，全身皮肤可见散在瘀斑分布，硬币大小，部分高出皮面，压之不褪色，浅表淋巴结未触及，口腔黏膜无充血，舌尖可见出血点分布，咽无充血，咽后壁未见滤泡增生，双侧扁桃体无肿大，双肺呼吸音粗，未闻及干湿性罗音。心率140次/min，节律整齐，各瓣膜听诊区未闻及杂音，腹部查体及神经系统查体未见异常。患儿无血友病及其它出血性疾病家族史。无明显毒物接触史。入院院后实验室资料：血常规提示：WBC8.26X109/L,N%52.4%,L%40.3%, RBC4.33X1012/L, HGB113g/l，PLT327X109/L。凝血4项回报示：PT120秒， APTT178.4秒，TT正常，纤维蛋白原4.07g/l。肝肾功能、血糖、血脂、电解质等正常，肝炎病毒学全套阴性。入院诊断：皮肤出血原因待查？入院后予“酚磺乙胺、维生素K1”止血、“维生素C”降低毛细血管通透性等对症支持治疗，并予输滤白普通冰冻血浆200ml补充凝血因子等治疗，住院5天，患儿病情好转，无新发出血而出院。1周后患儿因“鼻出血5小时”再次入院。出血量不多，约5ml左右。复查血常规：WBC5.26×109/L, N%62.4%,L%30.3%, RBC4.35×1012/L,HGB110g/l，PLT250×109/L。凝血因子活性测定回报：凝血因子Ⅶ活性测定2%，凝血因子Ⅹ活性测定15%，凝血因子Ⅴ活性测定39%，凝血因子Ⅸ活性测定13%，均明显低于参考值范围，凝血因子Ⅷ活性测定90%（正常）。复查凝血4项回报APTT150秒、PT160.5秒。明显超过测定值范围，肝肾功能、血脂等检查正常范围。继续给维生素k1、血浆等输注后出血症状好转,鼻出血停止。经请北京市儿童医院血液科吴润晖教授远程会诊考虑继发性维生素k依赖因子缺乏（鼠药中毒可能）。本地区无鼠药中毒的鉴定技术，家长无条件到北京行毒物鉴定。现定期给患儿应用维生素K1治疗，避免相关毒物接触，现随诊3个月，患儿现无明显出血症状。家长及患儿反复回忆患儿并无明显进食鼠药污染的食物史，但有常食街边地摊烧烤的习惯，也有类似症状的病人出现，故考虑致患儿出血的原因应为不洁饮食习惯所致。目前患儿病情稳定，检测APTT/PT仍不正常，还在定期维生素k治疗及随访中。
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胎儿期凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ的生成趋势
目的 分析人类胎儿期三种凝血因子的生成趋势及正常范围,以探讨凝血因子活性测定对血友病胎儿的产前诊断价值.方法 检测327例18周以上胎儿脐带血中凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ(FⅧ、FⅨ及FⅪ)的活性,分析胎儿期三种凝血因子的增长趋势及正常范围.统计学方法采用SPSS10.0软件探索性分析、相关分析及t检验.结果 ①妊娠中晚期胎儿FⅧ的活性已超过30%,95%置信区间为47.57%～50.55%;FⅨ的活性在20%以下,95%置信区间为10.37%～11.60%;FⅪ的活性在40%以下,95%置信区间为22.86%～25.35%.②FⅧ、FⅨ、FⅪ活性与胎龄均呈正相关关系.③胎儿FⅧ、FⅨ的活性在34周后才出现明显增长;FⅪ的活性随胎龄的增加逐渐上升,但上升的幅度无统计学差异.结论 ①20周以上正常胎儿的FⅧ活性已达30%以上,FⅧ活性测定结合基因检测可能降低血友病甲胎儿产前诊断的误诊率和漏诊率.②胎儿期FⅨ、FⅪ的活性均较低下,尚不适合于作为血友病乙、血友病丙产前诊断的指标.③胎儿期凝血因子活性的增长趋势与胎龄成正比.
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99例血友病患儿临床资料分析与护理策略
血友病(hemophilia)是由血液中某些凝血因子(blood coagulation factors)缺乏而导致严重凝血功能障碍的出血性疾病,男性发病率高于女性.该病按照缺乏凝血因子种类,可分为血友病A(凝血因子Ⅷ缺乏)、血友病B(凝血因子Ⅸ缺乏)和其他血友病(凝血因子Ⅺ缺乏),前二者为性连锁隐性遗传性疾病,后者为常染色体不完全隐性遗传性疾病.血友病在先天性出血性疾病中为常见,主要临床表现为自发性或损伤性关节、组织出血及出血引起的畸形.本研究对四川省血友病中心登记的99例血友病患儿出血类型、出血部位及畸形严重程度进行分析,并进行护理治疗,旨在探讨该病护理策略.现将研究结果,报道如下.
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儿童血友病的治疗
血友病是一种由于FⅧ/FⅨ基因突变所引起的X-连锁隐性遗传性疾病,包括血友病A(由于凝血因子Ⅷ缺陷)和血友病B(由于凝血因子Ⅸ缺陷).根据血浆内凝血因子Ⅷ/Ⅸ浓度,血友病被分为重型(FⅧ/Ⅸ浓度<2%)、中型(FⅧ/Ⅸ浓度2%～5%)、轻型(FⅧ/Ⅸ浓度>5%～40%).
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遗传性凝血因子缺陷症和抗凝血因子缺陷症研究
遗传性凝血因子缺陷症,包括低(无)纤维蛋白原血症、凝血酶原、凝血因子Ⅴ、凝血因子Ⅶ、凝血因子Ⅷ(血友病A)、凝血因子Ⅸ(血友病B)、血管性血友病(vWD)、凝血因子Ⅹ、凝血因子Ⅺ、凝血因子ⅩⅢ等缺陷症,它们引起遗传性出血病;遗传性抗凝血因子缺陷症,主要包括抗凝血酶(AT)、蛋白C(PC)和蛋白S(PS)等缺陷症,它们引起遗传性血栓病.罹患这些疾病的患者,不仅自幼发病、持续终生,而且还遗传给后代.研究这些疾病,是为了减少病人的痛苦、致残和死亡,减轻家庭、社会和国家的负担;阻止疾病的遗传和有病胎儿的出生,优生优育和提高民族健康水平;为从根本上解决遗传病的基因治疗奠定理论和实践基础.
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凝血因子Ⅷ和Ⅸ活性检测参考物质的互通性研究
目的 评价凝血因子Ⅷ(FⅧ)和Ⅸ(FⅨ)活性国内常用检测系统的结果可比性以及参考物质的互通性.方法 参照美国临床实验室标准化协会(CLSI) EP-30文件和行业标准WS/T 356-2011的互通性评价方法进行实验.将不同浓度水平且覆盖临床检测范围的FⅧ和FⅨ活性检测样本,5个批号自制参考物质(F20140601 ～ F20140605)和英国国家生物制品检定所(NIBSC)标准品(SSCLOT4)分别用Stago STA-R Evolution、IL ACL TOP700和Sysmex CA7000全自动凝血分析仪及配套试剂进行FⅧ和FⅨ活性检测.3个检测系统依次进行2个系统间的结果比较.分别对2个系统临床样本的检测结果进行线性回归并计算偏差,以相关系数和偏差超出可接受范围的样本比例评价检测结果的可比性.剔除偏差超出可接受范围的结果后,再次进行线性回归并计算临床样本检测结果对应Y预测值双侧95％预测区间,绘制互通性评价图对自制参考物质和NIBSC标准品的互通性进行评价.结果 临床样本FⅧ和FⅨ浓度的分布范围为0.5％～ 218.0％和1.6％～156.5％,能够覆盖临床常见浓度水平和满足参考物质互通性评价的要求.不同系统FⅧ和FⅨ检测结果的R2为0.89 ～0.94和0.81～0.93,偏差超出可接受范围的比例均＜10％,可认为3个系统FⅧ和FⅨ活性检测结果的可比性可被接受.根据可比性偏差可接受范围,删除偏差超出可接受范围的临床样本检测结果后,FⅧ活性检测分别有42份、41份和45份临床样本的结果用于自制参考物质和NIBSC凝血标准品的互通性分析,FⅨ活性检测分别有44份、42份和41份临床样本的结果用于互通性分析.5个批号10支自制参考物质和NIBSC凝血标准品的检测结果均落在95％预测区间内,表明其在3个检测系统间均具有互通性.结论 对于FⅧ活性检测,不同检测系统间的结果可比性较好,FⅨ活性检测系统间的可比性尚可接受.自制参考物质和NIBSC标准品用于不同检测系统具有互通性.
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体外表达探讨凝血因子Ⅸ Arg327Ile新突变导致血友病B的分子发病机制
目的 探讨凝血因子Ⅸ(FⅨ)Arg327Ile(R327I)突变导致血友病B的分子发病机制.方法 在野生型FⅨ表达质粒FⅨWTpcDNA3.1(-)的基础上,定点突变法构建FⅨ R327I、R327Ala(A)、R327Lys(K)和R327Asn(N)突变的表达质粒,重叠PCR构建FⅨ324～329(β折叠结构域)换成FⅦ298～303同源结构突变表达质粒[FⅨβFⅦ pcDNA3.1(-)].将野生型及各种突变体表达质粒分别瞬时转染胚肾293T细胞,一期法检测培养上清液中FⅨ活性(FⅨ∶C)及ELISA法检测细胞培养上清和细胞裂解液中FⅨ抗原(FⅨ∶Ag),Western blot法检测突变蛋白的相对分子质量及表达水平.荧光蛋白表达载体瞬时转染法检测活细胞中突变蛋白合成与分泌.结果 体外瞬时转染FⅨR327I突变基因的细胞FⅨ∶C为正常野生型的4.49%,细胞上清液和细胞裂解液FⅨ∶Ag水平分别为野生型的31.02%和129.29%,为交叉反应减低型(CRMR).活细胞免疫荧光观察发现FⅨR327I突变蛋白在细胞内含量较野生型显著增高,并且在细胞溶酶体内的含量较野生型也显著增多.FⅨR327A、R327K、R327N及FⅨβFⅦ突变基因转染的细胞FⅨ∶C水平较野生型减低,其中以FⅨβFⅦ突变降低为明显;转染的细胞培养上清FⅨ∶Ag水平除R327K突变型较野生型增加,其余突变型均比野生型有不同程度的降低.Western blot法检测显示各种突变蛋白的相对分子质量与野生型相同而表达水平降低.结论 FⅨR327I突变基因可影响蛋白质合成和分泌,R327位点与FⅨ功能特异有关,其所在的β折叠结构域在FⅨ特异性功能中发挥重要作用.
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74例血友病B患者FⅨ基因突变研究
目的研究导致中国人血友病B的凝血因子Ⅸ(FⅨ)基因突变类型的分布,并比较与美国白种人群有何异同.方法从患者外周血白细胞抽提基因组DNA,分9段扩增FⅨ基因外显子序列,用基因扩增转录测序技术直接测序法检出突变.结果 74例患者中有69例查到了FⅨ基因58种突变.分析比较这69例患者FⅨ基因突变类型的分布特征与美国白种人差异无显著性.中国不同地区之间差异也无显著性.结论中国人血友病B的FⅨ基因突变类型非常分散,呈高度异质性.与美国白种人之间相比差异无显著性.
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三个血友病B家系的基因诊断
目的 探讨中国汉族3个无关血友病B家系先证者凝血因子Ⅸ(FⅨ)基因突变及分子发病机制,对家系女性成员进行携带者诊断.方法 家系先证者及成员采静脉血,先证者表型诊断确诊后,检测先证者及其家系成员6个STR位点的基因多态性,进行家系遗传连锁分析,应用PCR法对先证者及可疑携带者FⅨ8个外显子及其侧翼序列进行扩增,用末端标记双脱氧法检测核酸序列.结果 家系1先证者FⅨ基因外显子6发现G22119A突变,家系2先证者FⅨ基因外显子2发现G7392C突变,家系3先证者FⅨ基因外显子8发现T32685C突变.结论 血友病B先证者FⅨ基因缺陷是其发病的分子机制.
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应用两种方法对血友病B家系进行产前基因诊断
血友病B(hemophilia B)是因凝血因子Ⅸ(FⅨ)基因缺陷引起的X-连锁隐性遗传出血性疾病,在男性中的发病率约为1/30 000,散发率可达患者总数的30%～50%~[1].由于目前还不能根治,对于携带者和高危胎儿进行基冈诊断非常必要.连锁分析和DNA序列分析是单基因遗传病有效的基因诊断方法.
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基因治疗血友病B的研究进展
血友病B为凝血因子Ⅸ(FⅨ)基因缺陷导致缺乏凝血因子的X连锁的出血性疾病.目前治疗血友病以补充FⅨ为主.随着科学技术的发展,利用病毒载体携带正常的FⅨ基因以及适合的启动子和增强子元件到FⅨ基因缺陷的患者细胞内,使修饰后的细胞能够长期表达有生物功能的FⅨ,从而维持患者循环血液中一定的凝血因子水平,终达到治疗血友病B的目的,这就是目前有希望治疗血友病B的基因治疗法.
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凝血因子Ⅸ基因敲除对小鼠骨髓间充质干细胞生物学特性无直接影响
背景:凝血因子Ⅸ基因敲除有可能通过影响造血系统的稳定性从而影响骨髓造血微环境中骨髓间充质干细胞的生物学特性.目的:鉴定凝血因子Ⅸ基因敲除C57BL/6J-F9 tm1.Dws小鼠骨髓间充质干细胞的生物学特征.方法:采用改进的全骨髓贴壁细胞分离法分离培养凝血因子Ⅸ基因敲除C57BL/6J-F9 tm1.Dws小鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞术鉴定其表面标记的表达,以特殊诱导培养基诱导骨髓间充质干细胞干向成骨细胞,脂肪细胞,软骨细胞方向分化.结果与结论:分离的骨髓间充质干细胞形态均一为梭形,增殖能力和自我更新能力强.流式细胞术检测细胞表面标识CD44、CD56、CD73、CD90、CD105、CD106、CD166及CD271表达呈阳性,CD34、CD11b表达呈阴性.分离的骨髓间充质干细胞具有向成骨细胞,脂肪细胞,软骨细胞方向分化的能力.说明凝血因子Ⅸ基因敲除C57BL/6J-F9 tm1.Dws小鼠的骨髓间充质干细胞仍具备良好的干细胞的生物学特性,初步确定,凝血因子Ⅸ基因敲除对骨髓间充质干细胞的生物学特性并无直接影响.
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1例血友病合并跟腱挛缩患者的围手术期护理
血友病是一种X染色体连锁的隐性遗传性凝血功能障碍的出血性疾病,以外伤手术后出血时间较长及自发性出血为表现,常见关节血肿及肌肉血肿,可分为血友病甲型(凝血因子Ⅷ缺乏)及血友病乙型(凝血因子Ⅸ缺乏).我院2011年6月收治1例因腓肠肌区反复血肿而造成跟腱挛缩的男患者,在替代疗法的支持下行手术治疗,由于患者伴随血友病,给护理工作提出了更高的要求及难度,但经过精心及科学的护理,患者伤口愈合良好,未发生并发症,满意出院,现报道如下.
