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血管内皮生长因子基因转移对6-羟多巴胺诱导的多巴胺能细胞损伤的保护作用
目的 探讨血管内皮生长因子(VEGF)基因转移对6-羟多巴胺(6-OHDA)诱导的多巴胺能细胞损伤的保护作用. 方法用腺病毒载体携带VEGF165基因(Ad-VEGF165)感染PC12细胞,并设腺病毒携带的β-半乳糖苷酶基因(Ad-LacZ)感染组和磷酸盐缓冲液(PBS)处理组作对照,基因转移成功后,用6-OHDA处理细胞,另设正常对照(不加6-OHDA).四甲基偶氮唑盐法(MTT)测定细胞活性,免疫荧光细胞化学法检测细胞酪氨酸羟化酶(TH)表达,高效液相色谱检测细胞分泌功能. 结果 Ad-VEGF165感染组细胞吸光度A570(0.31±0.07),高于Ad-LacZ感染组(0.15±0.07)和PBS处理组(0.13±0.05),但低于正常对照组(0.55±0.10),分别与各组比较,差异均有统计学意义(均为P＜0.01);免疫荧光染色显示Ad-VEGF组细胞胞浆平均荧光强度(86.75±21.62)高于Ad-LacZ组(51.53±17.49)及PBS组(54.19±15.82),但低于正常对照组(110.39±24.21),分别与各组比较,差异均有统计学意义(均为(P＜0.05);Ad-VEGF感染组细胞培养液中多巴胺和去甲肾上腺素含量也高于Ad-LacZ感染组和PBS处理组. 结论腺病毒介导的VEGF基因转移对6-OHDA诱导的多巴胺能细胞损伤具有保护作用.
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基因治疗血友病B的研究进展
血友病B为凝血因子Ⅸ(FⅨ)基因缺陷导致缺乏凝血因子的X连锁的出血性疾病.目前治疗血友病以补充FⅨ为主.随着科学技术的发展,利用病毒载体携带正常的FⅨ基因以及适合的启动子和增强子元件到FⅨ基因缺陷的患者细胞内,使修饰后的细胞能够长期表达有生物功能的FⅨ,从而维持患者循环血液中一定的凝血因子水平,终达到治疗血友病B的目的,这就是目前有希望治疗血友病B的基因治疗法.
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角膜病基因治疗的研究进展
自1990年美国一名腺苷脱氨酶缺乏症患者接受基因治疗并获得成功后,基因治疗在各个领域的研究已取得很大的进展.随着人们在分子水平上对角膜疾病发病机制的认识不断提高,而传统的局部或全身治疗法往往对一些严重影响视功能的角膜病缺乏特异性和有效性.因此,人们开始探索将新兴发展的基因治疗法用于角膜病的治疗.
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“高科技”根治肝病可信吗？
半年前谢先生的女儿被查出感染乙肝病毒，后来他跟妻子辗转奔跑了许多地方为女儿看病求医。有一天，谢先生看到报纸上一则肝病广告介绍说××医院新研究出基因治疗法，说一个月就能治愈，三个疗程治不好就免费，“大小三阳迅速转阴”、“肝病可彻底根治”等字眼充斥全文。
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Neuroglobin基因体内转染对水杨酸钠给药后小鼠下丘核神经元听反应的影响
实验以48只成年健康昆明小鼠为实验对象,研究GeneJamer转染试剂介导的neuroglobin(NGB)基因体内转染对水杨酸钠给药后小鼠下丘核区听反应的影响.实验分4组,每组12只.A1组:对照组1(阴性对照,将GeneJamer转染试剂6μl和pEGFP-C1 2μg混合后注入下丘核脑区);A2组:对照组2[阳性对照,将GeneJamer转染试剂(6μl))和pEGFP-NGB(质粒载体pEGFP-C1与NGB基因全编码序列构建的重组子2 μg)混合后注入下丘核脑区];B组:水杨酸钠给药组(450mg/kg·d-1)+pEGFP-C1;C组:水杨酸钠(450 mg/kg·d-1)+pEGFP-NGB组.以直接注射法将GeneJamer转染试剂和重组质粒pEGFP-NGB混合后注入小鼠下丘核区.采用RT-PCR和Western blot技术检测小鼠下丘核区NGB mRNA和蛋白的表达;采用细胞外记录技术,研究小鼠下丘核区神经元在水杨酸钠给药后转染重组质粒pEGFP-NGB对强度-发放率函数(刺激声强与实验鼠下丘核区神经元在接受声刺激所产生的电发放的关系曲线)、强度-潜伏期函数(刺激声强与实验鼠下丘核区神经元在接受声刺激至产生电发放潜伏期之间的关系曲线)和频率调谐曲线(实验鼠下丘核区神经元在各个频率纯音刺激下起反应的阈值绘制的曲线)的影响.实验观察到:(1)经GeneJamer转染试剂介导NGB基因可有效地转染小鼠下丘核区脑组织并得到表达.(2)水杨酸钠给药后神经元的强度-发放率函数曲线升高.对照组A1、A2各项指标进行比较均无统计学意义.对照组A1、A2和水杨酸钠+pEGFP-NGB组神经元的强度-发放率函数以非单调型(随刺激强度增加时,发放率表现为先降后升呈"V"形或"U"形)为主,分别占74.6%、72.2%和59.3%,水杨酸钠给药组以不规则型强度-发放率函数为主,占47%,与对照组A1、A2和水杨酸钠+pEGFP-NGB组比较,有显著性差异(P＜0.01、P＜0.01、P＜0.05).(3)水杨酸钠给药后神经元的强度-潜伏期函数曲线降低.对照组A1、A2各项指标进行比较均无统计学意义.水杨酸钠给药组以非单调型强度-潜伏期率函数为主,与对照组A1、A2和水杨酸钠+pEGFP-NGB组比较,有显著性差异(P＜0.01、P＜0.05).(4)A1和A2对照组听反应神经元的调谐曲线,Q-10 dB值均大于5.00,其调谐曲线为狭窄型.记录水杨酸钠给药组72个听神经元的调谐曲线,有53个神经元的Q-10 dB值小于5.00,Q-10 dB值小为2.12,其调谐曲线为宽阔型;其余19个神经元的Q-10 dB值大于5.00,属于狭窄型调谐曲线.水杨酸钠+pEGFP-NGB组67个听神经元的调谐曲线,有12个神经元的Q-10 dB值小于5.00,Q-10 dB值小为2.87,其调谐曲线为宽阔型,其它的神经元的值大于5.00.它们的调谐曲线均属狭窄型.以上结果提示外源性NGB基因在水杨酸钠给药后小鼠下丘核区局部高表达,提示GeneJamer转染试剂介导NGB体内转基因治疗水杨酸钠引起的下丘核区的损伤的方法是可行的.实验小鼠转染NGB基因后可逆转因水杨酸钠给药引起的强度-发放率函数曲线升高以及强度-潜伏期函数曲线降低,并可逆转水杨酸钠引起的部分听神经元对声刺激强度的编码类型.
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重组腺相关病毒介导的人凝血因子IX基因在人/鼠结肠癌上皮细胞中的表达
目的:探讨重组腺相关病毒/人凝血因子Ix基因(rAAV-2/hFIX)在人/鼠结肠癌上皮细胞(SW480/C26细胞株)中的表达.方法:重组腺相关病毒/绿色荧光蛋白(rhhV-2/GFP)感染SW480/C26细胞,在荧光显微镜下观察GFP的表达,计算转染率.rAAV-2/hHX感染SW480/C26细胞,检测hFIX基因、FIXAg量及hFIX活性的表达.结果:SW480细胞株/C26细胞株GFP48hr阳性率分别为(57.0±8.5) %和(48.0土5.7)%;转导组14 d和21 d均可见外源hFIX的cDNA片断.SW480细胞转导了rAAV-2/hFIX后在第2天和第2l天ELISA法测hFIX抗原量分别为(98.0士4.3)和(30.9±6.5)ng·106cell-1·24h-1.未转导组为(2.7±0.1)ng·106cell-1·24h-1.C26细胞转导了rhAV-2/hFIX后在第2天测hFIX抗原量为(78土5.12)ng·106cell-1·24h-1.未转导组为(2.9士0.1)ng·108cell-1·24h-1.hFIX活性与hFIX抗原浓度明显相关.较对照组亦显著增高.结论:rAAV.2/GFP能有效地转导SW480/C26细胞.rhAV-2/hFIX能有效地转导SW480/C26细胞并表达具有凝血活性的功能蛋白hFIX.
关键词： 血友病B 基因治疗法 重组腺相关病毒 人凝血因子IX基因:结肠上皮细胞 -
复制缺陷型重组腺病毒介导mIFN-β基因治疗小鼠黑色素瘤的作用研究
目的观察体外转mIFN-β基因的B16细胞的体内致瘤性和瘤苗作用，及通过腺病毒载体介导的mIFN-β对体内局部肿瘤治疗和抗肿瘤转移的作用，并对其机制进行探讨。方法利用人类复制缺陷型重组腺病毒将目的基因mIFN-β经体外、体内两种途径导入小鼠黑色素瘤细胞（B16细胞）中。结果①携带目的基因的重组腺病毒感染B16细胞能获得较高的转移效率和目的基因的有效表达；②将mIFN-β基因导入B16细胞对B16细胞的体外增殖能力无明显影响，但能显著提高细胞表面MHC-Ⅰ类抗原的表达；③将转mIFN-β基因的B16细胞接种小鼠，其体内致瘤性明显降低，且对野生型B16细胞的致瘤性有抑制作用；④瘤体内注射和经尾静脉注射途径给予AdCMVmIFN-β，对局部肿瘤和转移瘤有治疗作用。该结果提示，利用腺病毒载体携带有效的目的基因来开发瘤苗和治疗肿瘤具有良好的临床应用前景。
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脐血采集和保存的实用问题
脐血含有大量的造血干细胞,在特定的条件下,经刺激诱导,可分化为特定的细胞.目前干细胞是基因治疗法理想的靶向细胞,一旦干细胞被导入异源基因,这种基因就会随着干细胞的自我复制和分化而终生表达.脐血干细胞移植可弥补骨髓及外周血造血干细胞移植的不足,脐血可替代骨髓及外周血进行干细胞移植.1988年,世界首例脐血干细胞移植在法国成功实施,开始了脐血干细胞移植临床应用的新纪元.
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ndrg2基因2种亚型重组腺病毒载体的构建
目的:构建表达N-myc下游调节基因2(ndrg2)2种亚型的重组腺病毒载体,为与ndrg2相关肿瘤的基因治疗奠定基础.方法:采用腺病毒表达系统ViraPowerTM Adenoviral Expression System构建腺病毒载体.首先将ndrg2 2种亚型(长短2种亚型分别命名为ndrg2L,ndrg2S)利用酶切、连接、转化、扩增后提取质粒等方法克隆人入门载体pENTR2B以获得入门克隆pENTR2B-NDRG2L和pENTR2B-NDRG2S,经双酶切及PCR鉴定正确后,用重组酶LR ClonaseTM Ⅱ Enzyme Mix进行入门克隆与表达载体pAd-CMV/V5-DEST间的重组反应,以获得表达克隆pAd-CMV/V5-DEST-NDRG2L和pAdCMV/V5-DEST-NDRG2S的质粒.表达克隆经PCR鉴定后用限制性内切酶Pac Ⅰ线性化后转染HEK293A包装细胞得到重组腺病毒(分别命名为Ad-NDRG2L和Ad-NDRG2S),经过反复的感染扩增后,用半数组织培养感染剂量法(TCID50)检测病毒滴度,用Western Blot法检测重组病毒载体是否能正确表达NDRG2蛋白.结果:证实入门克隆pENTR2B-NDRG2L/S和表达克隆pAd-CMV/V5-DEST-NDRG2L/S经酶切鉴定和PCR鉴定质粒构建正确,转染HEK293A细胞并反复扩增后获得的病毒滴度分别为:Ad-NDRG2L,4.0×1012空斑形成单位(PFU)/L;Ad-NDRG2S,6.3×1012 PFU/L.且这2个病毒能正确表达NDRG2蛋白.结论:成功构建了ndrg2基因长短2种亚型的重组腺病毒载体,并包装扩增病毒,可为肿瘤基因治疗的研究提供依据.
