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中国汉族人群凝血因子Ⅸ基因限制性片段长度多态性的研究
为探讨中国人群中凝血因子Ⅸ(FⅨ)基因Sal I,Nru Ⅰ和Mse Ⅰ酶切位点的限制性片段长度多态性(RFLP),采用聚合酶链反应(PCR)方法,以三代内相互间无亲缘关系的正常汉族人为研究对象,对其FⅨ基因内含子1第192位以及5'端-793位核苷酸A和G的频率和5'端-698位核苷酸T和C的频率进行了分析,其中对FⅨ-192共分析了214条X染色体,对FⅨ-793共分析了210条X染色体,对FⅨ-698共分析了206条X染色体.结果表明:FⅨ基因内含子1第192位A和G的频率分别为0.878和0.122,杂合体频率为0.213;-793位核苷酸A和G的频率分别为0.552和0.448,杂合体频率为0.494;FⅨ-698位核苷酸T和C的频率分别为0.311和0.689,杂合体频率为0.429.结论提示:FⅨ基因Sal I、Nru Ⅰ和MseⅠ酶切位点的RFLP有利于我国血友病B的携带者检测和产前诊断.
关键词： 凝血因子Ⅸ基因 血友病B 限制性片段长度多态性 聚合酶链反应 -
凝血因子Ⅸ无义突变真核表达载体的构建及其在COS-7细胞的表达
本研究以含有fⅨcDNA的pcDNA3.1质粒为模板构建4种包含不同类型无义突变的fⅨ真核表达载体并进行鉴定,实现其在COS-7细胞中的表达.采用以PCR为基础的定点突变法体外构建fⅨ基因无义突变体,并通过DNA序列分析进一步鉴定证实;应用脂质体转化技术将野生型、突变型fⅨ表达载体分别瞬时转染COS-7细胞,采用实时定量PCR鉴定fⅨmRNA在各组的相对表达水平.结果表明,4个突变型质粒除相应位点的无义突变外,未见其它突变,提示无义突变载体构建成功.实时定量PCR鉴定表明,各突变组真核表达载体已成功转染COS-7细胞株并能转录为mRNA.结论:采用以PCR为基础的定点突变法可在体外构建fⅨ真核表达载体,并可在COS-7细胞中表达,其转录过程中不引发mRNA降解,这为进一步研究无义突变引起FⅨ功能丧失及表达量降低的机制和治疗研究提供了物质基础.
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中国甘肃省血友病中心223例血友病患者临床分析
目的:了解中国甘肃省血友病患者的发病及诊疗现状.方法:回顾性分析我中心2010年1月至2015年5月223例血友病患者的临床资料.共收集到来自甘肃14个市及周边临近省份223例病例,其中血友病A(HA)203例,血友病B(HB) 20例;在223例中男性222例,女性1例,农村患者177例,占79.4％.结果:首次出血的中位年龄2岁,确诊的平均年龄5.6±6.5岁,HA和HB患者诊断延迟时间分别为2.50±4.91年和2.07±4.76年.在所有患者中合并关节出血168例(75.3％),关节畸形123例(55.2％);91.6％患者按需治疗,乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝病毒(HCV)的感染率分别为1.7％和6.2％.86.9％的患者首次就诊医院为3级以下医院,其中仅15.9％首诊医生考虑患者为血友病.结论:甘肃省血友病患者的确诊率较低,诊断延迟时间较长,合并关节出血多,累计关节畸形比例高,丙肝感染率高.
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逆转录病毒载体转染的人凝血因子Ⅸ基因在人脐带组织源间充质干细胞中的表达
为了研究逆转录病毒(pLEGFP-N1)转染的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)基因在人脐带间充质干细胞中的表达,应用DNA重组技术将hFⅨ cDNA构建入pLEGFP-N1载体,转导入包装细胞系Pheonix细胞,应用病毒上清感染人脐带组织源间充质干细胞(hUCT-MSCs),经G418筛选10天后获得全部的转染阳性细胞,从蛋白质水平和其功能活性上检测hFⅨ的表达.结果显示:配养上清液中可检测到hFⅨ的表达,每24小时分泌量达2.68±0.36μg/106细胞.Western blot检测表明,转导hFⅨ的hUCT-MSCs能分泌预期分子大小的hFⅨ入上清.功能性凝集测定实验表明了转导FⅨ的hUCT-MSCs 2天培养上清中hFⅨ的活性为100%-130%.结论:pLEGFP-N1-hFⅨ能有效地转导hUCT-MSCs,并在其子代细胞中表达具有凝血活性的hFⅨ,这为hUCT-MSCs成为血友病B基因治疗的细胞载体研究奠定了基础.
关键词： 逆转录病毒 人凝血因子Ⅸ 人脐带组织源间充质干细胞 基因治疗 血友病B -
重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体稳定细胞株的构建及意义
本研究构建重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体稳定细胞株并探讨其意义.将人凝血因子Ⅸ(F9)小基因克隆到哺乳动物表达载体pCMV-Tag3B上；利用PCR定点突变技术得到在小基因121位氨基酸位置含有一个提前终止密码子(premature termination codon,PTC)的无义突变体；将构建的F9小基因及其无义突变体分别转染人肝癌细胞HepG2,经G418抗性筛选,单克隆化扩大培养,得到稳定细胞株,分别命名为HepG2-WT和HepG2-N.结果显示:通过酶切鉴定、PCR鉴定及DNA测序分析证明,小基因及其无义突变体表达载体构建成功；通过RT-PCR及基因组PCR均扩增到了大小正确的目的基因片段,证明了含有重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体的稳定细胞株构建成功.结论:本研究成功构建了重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体稳定细胞株,该细胞株可用于无义突变导致血友病的治疗药物的筛选和PTC通读药物的筛选等.
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应用DNA测序技术检测血友病B患者FⅨ基因突变
为了研究3名中国汉族非亲缘系血友病B患者凝血因子Ⅸ(FⅨ)基因突变的类型,常规检测患者血浆APTT及FⅨ:C,进行表型诊断;抽提患者外周血白细胞基因组DNA,应用PCR技术分8段扩增FⅨ基因外显子序列,用双脱氧终止法检测核酸序列.结果表明:与正常对照者相比,HB患者APTT测定值明显升高,FⅨ:C测定值明显降低,PT测定值正常.测序结果显示3例HB患者均有相应的基因序列改变,患者1有外显子6 G22119A点突变,患者2有外显子1 G7932C点突变,患者3有外显子T32685C点突变.结论:3例HB患者均检测到相应的基因序列改变,这为HB患者基因缺陷的分子机制提供了证据.
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血友病性假肿瘤1例
患者男,5岁5个月,发现右前臂肿物1个月,起初拇指大小,后渐弥漫性增大,达15 cm×9 cm,无红肿、痛,皮温不高,质软.既往史:确诊血友病5年,无家族史.实验室检查:凝血因子Ⅸ为15%(参考值:＞45%),凝血因子Ⅷ为165%(参考值＞45%),纤维蛋白原9.86 g/L(参考值:2.00～4.00 g/L),活化部分凝血活酶时间52.5 s(参考值:26～38 s).
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高分辨率熔解曲线分析在血友病B F9基因突变检测中的应用
目的 利用高分辨率熔解曲线(HRM)技术建立简便有效的血友病B(HB)基因诊断的方法.方法 收集2005年1月至2010年6月就诊于上海瑞金医院的55例HB患者的外周血标本,抽提外周血基因组DNA.采用PCR扩增结合测序的方法对40例HB患者进行F9基因突变检测,利用其中21例带有F9基因1～7号外显子突变的HB患者标本建立相应的HRM突变筛查方法.采用F9基因1～7号外显子的PCR-HRM突变筛查方法及8号外显子的DNA直接测序方法,对15例未知F9基因突变的HB患者进行基因诊断.结果 通过PCR扩增结合测序,40例HB患者均检测到F9基因突变.21例带有F9基因1～7号外显子突变的HB患者标本中,19例(90％)患者的突变可通过PCR-HRM技术进行检测.通过F9基因1～7号外显子PCR-HRM突变筛查及8号外显子的DNA直接测序,15例未知F9基因突变的HB患者均检测到F9基因突变.55例HB患者中共检测到34种F9基因突变.结论 HB基因诊断的新方法,即PCR-HRM筛查F9基因1～7号外显子突变结合8号外显子的DNA测序法操作简便、结果可靠.
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F9基因多碱基缺失突变导致乙型血友病家系遗传学分析
目的 对1个F9基因多碱基缺失突变家系进行基因诊断及产前诊断.方法 遗传学分析.利用PCR-测序技术检测2013年4月到河南省人民医院咨询乙型血友病家系7例患者F9基因全外显子突变情况,根据患者F9基因突变情况对家系中非乙型血友病患者和100名健康人进行基因检测以排除多态性.根据上述乙型血友病基因检测结果来明确家系中F9基因致病性突变,并指导家系中女性携带者进行产前诊断,建议乙型血友病女性携带者孕中期抽取羊水进行胎儿基因检查,同时根据基因检测结果告知其所怀胎儿为非乙型血友病胎儿.结果 PCR-测序结果显示7例患者F9基因均存在c.185_188delGAGA[p.Glu62Asnfs?41]突变,使F9基因阅读框发生移码突变,在突变位点后第41位密码子存在TAA终止密码,导致F9基因翻译提前终止.家系中非乙型血友病男性和100名健康人此区域未见突变.该家系受检者中共检测出8名携带者女性,9名非携带者女性,对其中1名携带者女性进行产前诊断,羊水标本性别决定基因(SRY)阳性,F9基因c.185_188未见缺失突变.结论 明确了该家系的F9基因致病性突变,并指导了携带者女性进行产前诊断.
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中国汉族血友病B家系五种新的FⅨ基因突变的研究
目的探讨中国汉族无关血友病B家系先证者的凝血因子Ⅸ基因的突变和发病的分子机制.方法对19例中国汉族无关血友病B家系先证者,静脉采集各家系先证者外周血,表型诊断确诊后,用PCR对FⅨ 8个外显子及其侧翼序列进行扩增,用末端标记双脱氧法检测核酸序列.结果 19例血友病B家系先证者均检测到相应的基因序列的改变.结论 19例中国汉族无亲缘关系的血友病B家系先证者FIX基因在编码外显子的核苷酸部位均发现有基因突变,其中发现五种新的突变,即6444T→A(Cys23Stop);10497G→C(Cys82Ser);31101G→T(Arg327Ile);31102 InsertT;30984T→G(Ile288Ser)为国际上首次报道.
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凝血因子ⅨArg327Ile突变蛋白功能缺陷机制研究
目的 研究FⅨArg327Ile (R327I)及Arg327 Ala(R327A)突变蛋白功能,探讨R327I突变导致血友病B的分子发病机制.方法 采用潮霉素筛选稳定表达细胞株,ELISA法筛选高效表达FⅨ重组蛋白细胞株,采用快流速Q琼脂糖凝胶和离子交换两步法分离纯化重组蛋白.ELISA和SDS-PAGE电泳分别检测重组蛋白含量和纯度.FⅦa/TF/Ca2+和FⅪa/Ca2+活化野生型及R327I和R327A突变FⅨ蛋白,用WB法分别检测不同时间内活化生成的FⅨa.野生型及两种突变FⅨa在不同FⅧa浓度下活化激活FX,以此计算野生型及两种突变FⅨa与FⅧa的解离常数；在含或不含FⅧa的条件下,检测野生型及两种突变FⅨa对不同浓度FX的激活能力,以此计算其催化效率.结果 表达分离纯化野生型、R327I和R327A FⅨ重组蛋白总量分别为450、210和64 μg,SDS-PAGE电泳结果显示重组蛋白纯度符合要求.两种突变蛋白均能被FⅦa/TF/Ca2+和FⅪa/Ca2+正常激活.R327I与R327A两种FⅨa突变蛋白与FⅧa的结合力分别为野生型的1/4和1/5.在含FⅧa条件下,R327I和R327I突变FⅨa对FX催化效率分别为野生型的1/6和1/8.而不含FⅧa条件下,催化效率分别为野生型的1/3和1/7.4.结论 R327I和R327A两种突变FⅨa与FⅧa结合异常,R327位点参与FⅧa结合,同时也与底物活化相关.R327I突变与FⅧa结合力降低导致重型血友病B的发生.
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两个同源重组血友病家系的基因诊断
目的 探讨特殊血友病家系的基因诊断.方法 通过FⅧ基因内含子22倒位及内含子1倒位的直接检测与遗传连锁分析的间接诊断相结合对1个血友病A(HA)家系进行基因诊断;采用核酸直接测序法对FⅨ各外显子及其侧翼序列进行检测,并联合FⅨ基因相关的6个微卫星(STR)位点对1个血友病B(HB)家系进行基因诊断.结果 HA家系先证者为FⅧ内含子1倒位阳性,家系中要求做携带者诊断的女性成员为内含子1倒位携带者;而FⅧ基因内外8个多态性位点遗传连锁分析证实该女性成员发生同源染色体重组.HB家系先证者除7号外显子测序未成功外,其余部分均未找到突变,家系中要求做携带者与产前诊断的女性,其羊水细胞经直接核酸测序未找到突变,利用FⅨ相关的6个STR位点进行遗传连锁分析发现该女性有染色体同源重组现象存在,胎儿为正常男性.结论 在应用间接诊断方法进行HA和HB的携带者及产前基因诊断时,要考虑到染色体同源重组现象的发生可能导致误诊与漏诊的情况.在中国人群中应该开发更多的FⅧ和FⅨ分子中信息量大的多态性位点,以提高HA和HB的携带者及产前诊断的准确率.
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狼疮抗凝物伴凝血因子Ⅷ、Ⅸ和Ⅺ缺乏的检验诊断:附13例报告
目的 探讨狼疮抗凝物伴凝血因子(Ⅷ、Ⅸ和Ⅺ)缺乏的检验诊断方法.方法 检测13例狼疮抗凝物伴凝血因子(Ⅷ、、Ⅸ和Ⅺ)缺乏患者(包括长期服用氯丙嗪的精神分裂症5例、抗磷脂综合征2例、天疱疹1例、原因未明5例)、1O例血友病A患者和48名健康志愿者的凝血因子活性、凝血因子抗体、抗心磷脂抗体(ACA)、狼疮抗凝物(LA)以及凝血酶的生成.结果 13例狼疮抗凝物伴凝血因子(Ⅷ、Ⅸ和Ⅺ)缺乏患者的活化部分凝血活酶时间(APTT)延长,凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ活性(FⅧ∶C、FⅨ∶C、FⅪ∶C)降低,针对这些凝血因子的抗体及LA均为阳性,6例ACA为阳性.其中LA阳性、伴凝血因子(Ⅷ、Ⅸ和Ⅺ)缺乏组中,11例无出血患者的凝血酶生成试验(TGT)的延迟时间值为(5.60±1.18)min,高于正常对照组的(1.88±0.25)min,差异具有统计学意义(t=10.05,P＜0.01);达峰时间值为(8.11±1.91)min,高于正常对照组的(4.10±0.36)min,差异具有统计学意义(t=8.83,P＜0.01);凝血酶生成潜力(ETP)值为(1640.87±279.80)nmol·L-1·min-1,高于遗传性血友病A组的(734.59±118.30)nmol·L-1·min-1,差异具有统计学意义(t=9.77,P＜0.01);ETP比值为(86.00±14.66)%,高于遗传性血友病A组的(38.50±6.20)%,差异具有统计学意义(t=9.77,P＜0.01).遗传性血友病A组的达峰时问值为(8.01±1.81)min,高于正常对照组的(4.10±0.36)min,差异具有统计学意义(t=8.20,P＜0.01);而延迟时间值为(2.01±0.84)min,与正常对照组的(1.88±0.25)min比较,差异无统计学意义(t=1.26,P＞0.05).结论 狼疮抗凝物伴凝血因子(Ⅷ、Ⅸ和Ⅺ)缺乏和遗传性血友病是以APTT、PT、PLT和APTT纠正试验作为筛选试验;以LA、FⅧ∶C、FⅨ∶C、FⅪ∶C和它们的抗体检测作为确诊试验;检测LA和ACA可为寻找病因提供依据;ETP值和ETP比值是判断LA阳性伴凝血因子(Ⅷ、Ⅸ和Ⅺ)缺乏患者临床是否出血的较敏感指标.
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应用带锁髓内钉行胫距跟融合术治疗终末期血友病性踝关节炎的临床研究
背景:踝关节是血友病性关节炎的常见受累部位,此类患者往往较早出现终末期表现而接受手术治疗.目的:探讨应用带锁髓内钉行胫距跟融合术治疗终末期血友病性踝关节炎的围手术期处理方法、术式选择及疗效.方法:2012年1月至2015年12月,我院收治终末期血友病性踝关节炎患者10例(12足),均为男性;年龄21~48岁,平均32.7岁;其中甲型血友病7例,乙型血友病3例.术前根据美国矫形足踝协会(AOFAS)评分为29~53分,平均46.2分.入院后由血液科会诊通过凝血因子预实验确定围手术期替代方案,应用带锁髓内钉行胫距跟融合术(12足).结果:手术用时65~88 min,平均72 min;术中出血平均30 ml.所有患者均获得随访6~36个月,中位随访时间为24.3个月.所有患者末次随访时X线片检查示踝关节完全融合.末次随访时AOFAS评分为78~89分,平均83.5分.1例患者术后复查发现双侧假体周围骨折,术后半年随访骨折愈合良好,其余患者均未发生伤口愈合不良、内固定感染、神经损伤等并发症.结论:在制定良好的围手术期凝血因子替代方案后,应用带锁髓内钉行胫距跟融合术治疗终末期血友病性踝关节炎可以获得满意的临床效果.
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关节成形术治疗血友病性关节病
目的 评价关节置换术治疗血友病性关节病的临床效果,总结围手术期处理方法.方法 2002年5月至2007年3月共收治血友病性关节病患者20例.行人工全膝关节置换14例(20膝),人工全髋关节置换6例(8髋),踝关节融合2例.术前美国特种外科医院膝关节评分系统(HSS评分)平均46分(17～64分);髋关节Harris评分平均34分(13～61分);美国足部和踝部矫形协会对踝部和后足评分(AOFAS评分)平均35分(19～51分).结果 所有患者均获随访,随访时间平均27.3个月.全膝关节置换术后HSS评分平均83分;全髋关节置换术后Harris评分平均89分;踝关节融合术后AOFAS评分平均78分.并发症:1例迟发出血;1例下肢深静脉血栓形成;1例迟发感染伴假体松动.结论 人工关节置换、踝关节融合能够明显减轻疼痛,改善关节功能;恰当的围手术期处理是血友病性关节病手术成功的保障.
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妊娠合并血友病
血友病是一种凝血功能障碍的X染色体隐性遗传性疾病，主要由于凝血因子Ⅷ或Ⅸ缺乏所致。妊娠合并血友病患者在整个孕期和分娩过程中均面临着出血的风险。本文就妊娠合并血友病的产前诊断、孕期管理、分娩方式、治疗及新生儿处理等作一介绍。
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新生儿血友病七例临床分析并文献复习
目的 了解新生儿血友病的临床特点、治疗及预后. 方法 对郑州大学第一附属医院2012年7月至2016年3月收治的7例新生儿血友病病例资料进行回顾性分析. 结果 7例患儿均为男性,临床表现包括静脉穿刺点处血肿2例,头颅血肿5例,颅内出血2例,皮下出血3例,镜下血尿1例,肾上腺出血1例,1例无临床出血表现.实验室检查发现6例为凝血因子Ⅷ缺乏,1例为凝血因子Ⅸ缺乏;3例经基因检测证实诊断.7例患儿均给予血浆、冷沉淀、凝血因子Ⅷ等补充替代治疗.经治疗,6例好转出院,1例放弃治疗.随访至2016年4月,1例发生头颅血肿,1例发生膝关节血肿,3例发生皮下出血,3例无明显出血.3例间断补充凝血因子. 结论 对新生儿期有出血表现者,排除其他出血性疾病后应考虑血友病.行凝血因子活性水平检测可明确诊断.
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成年血友病患者生命质量与关节健康状况的相关性研究
目的 探讨成年血友病患者生命质量与关节健康状况的相关性.方法 选取49例成年血友病患者,分别采用成年血友病患者生命质量测评问卷(Hemo-QOL-A)和血友病关节健康评估量表(HJHS)评价生命质量和关节健康状况.结果 成年血友病患者Hemo-QOL-A评分(39.34 ± 18.97)分,HJHS评分(33.16 ± 13.17)分.Pearson相关性分析结果显示,Hemo-QOL-A评分与HJHS评分呈正相关(r=0.490,P<0.05),Hemo-QOL-A评分与HJHS评分的肌肉情况、关节活动度、关节摩擦音评分呈正相关(r=0.469、0.396、0.290,P<0.05),与HJHS评分的肿胀情况、肿胀持续时间、关节疼痛及总体步态无相关性(P>0.05).49例患者294个关节中,总关节异常率为82.7%(243/294),其中肘关节异常率为72.4%(71/98),膝关节异常率为90.8%(89/98),踝关节异常率为84.7%(83/98).结论 关节周围肌肉状况和关节活动度等关节健康状况不良导致血友病患者生命质量下降.
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血友病性假瘤的临床特点分析
目的 分析血友病性假瘤的临床表现和影像学特征,探讨血友病性假瘤临床特点.方法 分析1996年7月至2007年7月,北京协和医院骨科收治血友病性假瘤的临床资料.8例患者均为男性,年龄18～38岁,平均26.1岁.其中累及股骨4例,第五掌骨1例,位于股四头肌、髂腰肌、腓肠肌各1例.治疗方法包括假瘤切除、软组织松解、骨移植重建术等.结果 全部病例手术切除重建后均获得随访,随访时间平均38.6个月(7个月至11年);全部病例无假瘤局部复发;6例愈合良好;1例股骨短缩、跛行;1例凝血因子抑制剂形成,伴切口愈合不良待截肢.结论 病史及影像学检查是血友病性假瘤诊断的主要依据;掌握其临床特点是获取良好疗效的关键.
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重组AAV2/hFⅨ病毒制备及其基因治疗血友病B的实验研究
目的制备携带人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)基因的重组AAV2病毒(rAAV2/hFⅨ),并对用rAAV2/hFⅨ肌肉注射治疗血友病B模型小鼠的疗效进行评价.方法通过"一株载体细胞/一株辅助病毒"的双因素包装策略制备出rAAV2/hFⅨ,体外转导BHK-21、C2C12细胞后,检测细胞培养上清中hFⅨ的表达量;肌肉直接注射血友病B模型小鼠后,检测其血浆中hFⅨ的抗原水平和凝血活性等指标.结果转导24 h后在细胞上清中即可检测到hFⅨ,连续检测120 h都有表达,BHK-21、C2C1 2细胞24 h高表达量分别达到(51.0±6.5)ng/105细胞和(68.0±7.2)ng/105细胞.rAAV2/hFⅨ经肌肉直接注射后,高、中、低三个剂量组均能检测到小鼠体内高效表达hFⅨ,在给药后第3周达到高峰,小鼠血浆中hFⅨ的表达量与对照组比较差异有显著性(P＜0.01),之后缓慢下降,到第10周仍可检测到低水平hFⅨ表达;取第3周小鼠血浆样品检测凝血功能,高、中、低剂量组FⅨ活性均得到明显改善,小鼠的割尾实验出血时间明显缩短,5 min失血量也相应显著减少,其中高剂量组hFⅨ高表达量达到(387.0±12.5)ng/ml血浆,FⅨ活性达到正常水平的(30.0±5.5)%;给药后第10周,除在注射点外,其它主要脏器均未检测到AAV载体DNA.结论制备的rAAV2/hFⅨ病毒在体外培养细胞中能高水平表达hFⅨ,肌肉注射能有效治疗血友病B模型小鼠,为临床应用该基因治疗血友病B提供了科学依据.
