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高分辨率熔解曲线分析在血友病B F9基因突变检测中的应用
目的 利用高分辨率熔解曲线(HRM)技术建立简便有效的血友病B(HB)基因诊断的方法.方法 收集2005年1月至2010年6月就诊于上海瑞金医院的55例HB患者的外周血标本,抽提外周血基因组DNA.采用PCR扩增结合测序的方法对40例HB患者进行F9基因突变检测,利用其中21例带有F9基因1～7号外显子突变的HB患者标本建立相应的HRM突变筛查方法.采用F9基因1～7号外显子的PCR-HRM突变筛查方法及8号外显子的DNA直接测序方法,对15例未知F9基因突变的HB患者进行基因诊断.结果 通过PCR扩增结合测序,40例HB患者均检测到F9基因突变.21例带有F9基因1～7号外显子突变的HB患者标本中,19例(90％)患者的突变可通过PCR-HRM技术进行检测.通过F9基因1～7号外显子PCR-HRM突变筛查及8号外显子的DNA直接测序,15例未知F9基因突变的HB患者均检测到F9基因突变.55例HB患者中共检测到34种F9基因突变.结论 HB基因诊断的新方法,即PCR-HRM筛查F9基因1～7号外显子突变结合8号外显子的DNA测序法操作简便、结果可靠.
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凝血因子Ⅷ和Ⅸ实验室检测现状调查与分析
目的 了解国内实验室凝血因子Ⅷ、Ⅸ检测现状及存在的问题,为实施凝血因子Ⅷ、Ⅸ检测规范化及质量改进提供依据.方法 调查性研究.对76家实验室进行问卷调查研究,对54家实验室进行质控物活性检测调查研究.对调查问卷的回报信息进行统计分析,将质控物的检测结果按照检测试剂分为3组后进行分级评价.结果 72％(52/72)的实验室检测标本量少于30份/月.各实验室的定标频率不同,33％(24/72)的实验室未在每批样本检测前进行定标.39％(28/72)的实验室未开展室内质控,21％ (15/72)的实验室仅检测正常浓度水平质控物,个别实验室室内质控累积变异系数(CV)较大,超过30％.正常浓度水平质控物FⅧ、FⅨ检测结果的CV范围分别为11.3％ ～18.2％及11.3％ ～ 17.9％;异常浓度水平质控物FⅧ、FⅨ检测结果的CV范围分别为15.3％ ～20.3％及19.5％ ～21％.按照检测试剂分为3组,3组FⅧ检测结果不及格的实验室分别占18％、24％及22％;FⅨ检测结果不及格的实验室分别占20％、24％及28％.结论 国内凝血因子检测质量控制关键环节的要求有待明确和实施,部分实验室检测结果的重复性和可比性较差.拟通过制订凝血因子Ⅷ、Ⅸ检测规范化的技术要求,组织相关培训,建立全国室间质量评价计划等方式实施质量改进.
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凝血因子ⅨArg327Ile突变蛋白功能缺陷机制研究
目的 研究FⅨArg327Ile (R327I)及Arg327 Ala(R327A)突变蛋白功能,探讨R327I突变导致血友病B的分子发病机制.方法 采用潮霉素筛选稳定表达细胞株,ELISA法筛选高效表达FⅨ重组蛋白细胞株,采用快流速Q琼脂糖凝胶和离子交换两步法分离纯化重组蛋白.ELISA和SDS-PAGE电泳分别检测重组蛋白含量和纯度.FⅦa/TF/Ca2+和FⅪa/Ca2+活化野生型及R327I和R327A突变FⅨ蛋白,用WB法分别检测不同时间内活化生成的FⅨa.野生型及两种突变FⅨa在不同FⅧa浓度下活化激活FX,以此计算野生型及两种突变FⅨa与FⅧa的解离常数；在含或不含FⅧa的条件下,检测野生型及两种突变FⅨa对不同浓度FX的激活能力,以此计算其催化效率.结果 表达分离纯化野生型、R327I和R327A FⅨ重组蛋白总量分别为450、210和64 μg,SDS-PAGE电泳结果显示重组蛋白纯度符合要求.两种突变蛋白均能被FⅦa/TF/Ca2+和FⅪa/Ca2+正常激活.R327I与R327A两种FⅨa突变蛋白与FⅧa的结合力分别为野生型的1/4和1/5.在含FⅧa条件下,R327I和R327I突变FⅨa对FX催化效率分别为野生型的1/6和1/8.而不含FⅧa条件下,催化效率分别为野生型的1/3和1/7.4.结论 R327I和R327A两种突变FⅨa与FⅧa结合异常,R327位点参与FⅧa结合,同时也与底物活化相关.R327I突变与FⅧa结合力降低导致重型血友病B的发生.
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降钙素原联合凝血因子预测肝硬化并发自发性细菌性腹膜炎预后的研究
目的 探究降钙素原(PCT)联合凝血因子在评价肝硬化并发自发性细菌性腹膜炎(SBP)短期预后中的价值.方法 回顾性分析2014年6月至2017年10月金华市中心医院感染科128例肝硬化并发SBP住院患者临床资料.根据患者3个月生存情况,将其分为存活组(n=83)和死亡组(n=45),采用多因素Logistic回归分析影响肝硬化并发SBP的预后因素,计算回归系数作为权重,建立预测指数模型.计算受试者工作曲线下面积(AUC),评价PCT联合凝血因子预测肝硬化并发SBP预后的准确性.结果 单因素分析显示,基线PCT、总胆红素(TBil)、血肌酐(Scr)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶原活动度(PTA)及凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ水平是影响肝硬化并发SBP患者预后的相关因素(P<0.01).多因素Logistic回归分析显示,PCT、凝血因子Ⅴ和Ⅸ均能独立预测肝硬化并发SBP患者短期预后,其模型为Logit(P)=1.200+0.099×PCT-0.026×凝血因子Ⅴ-0.038×凝血因子Ⅸ,模型的敏感度为0.822,特异度为0.675,AUC为0.829.与经典MELD评分比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论 基于PCT与凝血因子Ⅴ、Ⅸ的预测指数模型能较好的预测肝硬化并发SBP患者的短期生存率,其总体预后的评估能力与MELD评分相仿,但模型简单,计算简便,临床较易掌握.
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妊娠合并血友病
血友病是一种凝血功能障碍的X染色体隐性遗传性疾病，主要由于凝血因子Ⅷ或Ⅸ缺乏所致。妊娠合并血友病患者在整个孕期和分娩过程中均面临着出血的风险。本文就妊娠合并血友病的产前诊断、孕期管理、分娩方式、治疗及新生儿处理等作一介绍。
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新生儿血友病七例临床分析并文献复习
目的 了解新生儿血友病的临床特点、治疗及预后. 方法 对郑州大学第一附属医院2012年7月至2016年3月收治的7例新生儿血友病病例资料进行回顾性分析. 结果 7例患儿均为男性,临床表现包括静脉穿刺点处血肿2例,头颅血肿5例,颅内出血2例,皮下出血3例,镜下血尿1例,肾上腺出血1例,1例无临床出血表现.实验室检查发现6例为凝血因子Ⅷ缺乏,1例为凝血因子Ⅸ缺乏;3例经基因检测证实诊断.7例患儿均给予血浆、冷沉淀、凝血因子Ⅷ等补充替代治疗.经治疗,6例好转出院,1例放弃治疗.随访至2016年4月,1例发生头颅血肿,1例发生膝关节血肿,3例发生皮下出血,3例无明显出血.3例间断补充凝血因子. 结论 对新生儿期有出血表现者,排除其他出血性疾病后应考虑血友病.行凝血因子活性水平检测可明确诊断.
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我国儿童血友病现状及诊断
1 现状血友病是一种缺乏因子Ⅷ或因子Ⅸ的性染色体连锁隐性遗传性出血性疾病,大规模的流行病学调查显示血友病的发病率为15～20/10万人口,无明显地区和种族差异.1986年至1989年全国24省、市,37个地区作血友病患病率的调查,调查人数16866 654人,总患病率2.73/10万(男性5.21/10万,女性0.06/10万),与欧美相比较低[1].
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Idelvion获FDA批准用于B型血友病
2016年3月FDA批准CSL Behring公司的Idelvion用于治疗儿童和成人B型血友病。Idelvion是第1个长效的通过DNA链接技术产生的凝血因子-白蛋白融合蛋白（rⅨ-FP），可以替代因子Ⅸ，并提高其半衰期，以阻止或控制出血。
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不稳定性心绞痛的抗凝治疗
1抗凝药物分类抗凝药物主要通过抑制凝血酶的生成和/或活性,减少凝血酶作用的底物(如纤维蛋白原)来达到抗血栓的目的,分类如下:①间接凝血酶抑制剂(抗凝血酶Ⅲ依赖性):肝素、低分子肝素、类肝素.②直接凝血酶抑制剂:重组水蛭素(hirudin)及其衍生物(hirulog、hirugen);合成的低分子凝血酶活性部位抑制物,如argatrobin、efegatran、inogratran、PPACK、thrombinaptamers、Dup714.③凝血酶生成抑制剂:因子Xa抑制剂,如antistin、壁虱抗凝肽、灭活的因子X、戊糖和DX-9065a;因子Ⅸa抑制剂,包括因子Ⅸa活性部位抑制剂和因子Ⅸa单克隆抗体;因子Ⅶa抑制剂,如因子Ⅶa抗体、线虫抗凝蛋白(NAPc2)和Peptidomimetics;组织因子途径抑制物等.④重组内源抗凝剂:活化的蛋白C、抗凝血酶Ⅲ、肝素辅因子Ⅱ、组织因子途径抑制物.⑤凝血酶受体拮抗剂:凝血酶受体拮抗肽.⑥维生素K依赖性抗凝剂:主要为香豆素类,如华法林,为口服制剂.⑦去纤维蛋白原制剂:去纤酶.
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凝血因子Ⅷ和Ⅸ活性检测标准物质的评价及定值
目的 对血浆凝血因子Ⅷ(FⅧ)和凝血因子Ⅸ(FⅨ)活性检测标准物质进行评价和定值.方法 按照《标准样品定值的一般原则和统计方法》、《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》和《一级标准物质技术规范》的要求,对3个批号(F0I ～ F03)不同浓度水平的FⅧ和FⅨ活性检测标准物质进行均匀性和稳定性评价,并以英国国家生物制品检定研究所凝血标准品为溯源标准,选择8家实验室采用一期法对标准物质联合定值.结果 FⅧ各批号标准物质均匀性的变异系数(CV)分别为3.9％、3.3％和3.4％,FⅨ各批号标准物质均匀性CV分别为3.7％,3.0％和1.8％,均匀性评价单因素方差分析结果均P＞0.05,表明标准物质均匀性良好;FⅧ和FⅨ活性瓶间均匀性不确定度(ubb)分别为0.5％～2.9％和0.1％ ～3.9％.将标准物质置于-80℃保存条件下,在评价期限内(9个月)FⅧ和FⅨ活性检测结果无趋势性变化,表明标准物质稳定性良好;其长期稳定性不确定度(ults)分别为0.5％ ～5.1％和1.3％～4.4％.定值过程不确定度(uchat)分别为0.9％～2.4％和1.1％ ～2.4％.合成并扩展不确定度后(扩展因子k=2),3个批号标准物质FⅧ活性定值结果分别为(85±13)％、(36.0±3.4)％和(20.5±2.3)％,FⅨ活性定值结果分别为(102±13)％、(47.8±6.9)％和(29.3±3.8)％.结论 FⅧ和FⅨ活性检测标准物质的均匀性、稳定性良好,定值结果准确可靠.
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抗磷脂抗体和狼疮性肾炎
1抗磷脂抗体及抗磷脂综合征1.1抗磷脂抗体(Antiphospholipidantibody,aPL)aPL是一族针对带负电荷磷脂或带负电荷磷脂与蛋白的复合物的异质性自身抗体的总称,是诊断抗磷脂综合征(Antiphospholipid Syndrome,APS)的条件之一.目前已知的aPL的靶抗原有三大类:①磷脂:心磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇;②磷脂-蛋白复合物:β2糖蛋白Ⅰ(β2-GP Ⅰ)、凝血酶原、纤溶酶、组织型纤溶酶原激活物、蛋白C、蛋白S、血栓调节素、膜联蛋白V、抗凝血酶原Ⅲ、PT复合物(Xa、V a、Ca、及磷脂)、Tenase复合体(因子Ⅸa、Ⅷa、Ca及磷脂)、高/低小分子激肽原等;③脂蛋白:氧化低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、载脂蛋白A-I.
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重组AAV2/hFⅨ病毒制备及其基因治疗血友病B的实验研究
目的制备携带人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)基因的重组AAV2病毒(rAAV2/hFⅨ),并对用rAAV2/hFⅨ肌肉注射治疗血友病B模型小鼠的疗效进行评价.方法通过"一株载体细胞/一株辅助病毒"的双因素包装策略制备出rAAV2/hFⅨ,体外转导BHK-21、C2C12细胞后,检测细胞培养上清中hFⅨ的表达量;肌肉直接注射血友病B模型小鼠后,检测其血浆中hFⅨ的抗原水平和凝血活性等指标.结果转导24 h后在细胞上清中即可检测到hFⅨ,连续检测120 h都有表达,BHK-21、C2C1 2细胞24 h高表达量分别达到(51.0±6.5)ng/105细胞和(68.0±7.2)ng/105细胞.rAAV2/hFⅨ经肌肉直接注射后,高、中、低三个剂量组均能检测到小鼠体内高效表达hFⅨ,在给药后第3周达到高峰,小鼠血浆中hFⅨ的表达量与对照组比较差异有显著性(P＜0.01),之后缓慢下降,到第10周仍可检测到低水平hFⅨ表达;取第3周小鼠血浆样品检测凝血功能,高、中、低剂量组FⅨ活性均得到明显改善,小鼠的割尾实验出血时间明显缩短,5 min失血量也相应显著减少,其中高剂量组hFⅨ高表达量达到(387.0±12.5)ng/ml血浆,FⅨ活性达到正常水平的(30.0±5.5)%;给药后第10周,除在注射点外,其它主要脏器均未检测到AAV载体DNA.结论制备的rAAV2/hFⅨ病毒在体外培养细胞中能高水平表达hFⅨ,肌肉注射能有效治疗血友病B模型小鼠,为临床应用该基因治疗血友病B提供了科学依据.
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microRNA125对无义突变的人凝血因子Ⅸ基因调控的分子机制
目的 构建人凝血因子Ⅸ小基因(Mini-hF9)及无义突变体,检测其mRNA表达水平,分析microRNA 125对无义突变的F9基因表达调控的分子机制.方法 利用PCR定点突变技术构建若干无义突变的人Mini-hF9并转染哺乳动物细胞HEK293T等,同时转染miR-125模拟物,通过实时荧光定量PCR(q-PCR)检测Mini-hF9基因mRNA表达水平.结果 成功构建了Mini-hF9并在细胞中正确剪接.成功构建了无义突变体M1 (nt 34 G＞T in Exon 7)、M2(nt 52 G＞T in Exon 7)和M3(nt 85 G＞T inExon 7).M1和M2突变体中Mini-hF9基因mRNA表达水平分别为野生型的14.1％ (t=15.464,P=0.004)和22.4％(t=15.755,P=0.004),通过放线菌酮处理实验证实这是由于无义介导的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)所致.分别转染miR-125a模拟物和miR-125b模拟物后,M1突变体中Mini-hF9基因mRNA水平分别升高到1.70倍(t=-4.883,P=0.039)和2.40倍(t=-17.537,P=0.003),M2突变体Mini-hF9mRNA水平分别升高到2.02倍(t=-19.264,P=0.003)和2.07倍(t=-9.158,P=0.012).结论 无义突变发生的位置是触发NMD途径的一个关键因素;microRNA 125能够通过抑制NMD途径提高无义突变的凝血因子Ⅸ的mRNA水平.
关键词： 因子Ⅸ 微RNAs 基因表达调控 无义介导的mRNA降解 Mini-hF9基因 -
含hFⅨ微小基因的杂合型逆转录病毒载体在小鼠成肌细胞中高效表达的研究
目的探讨不同载体结构在成肌细胞中表达hFⅨ蛋白的效果，优化载体结构，为血友病B基因治疗提供实验依据。方法制备带有两拷贝肌酸激酶增强子(Me2)和内含子m2的三种逆转录病毒载体pLMe2Ⅸm2SN(Me2正向插入3＇LTR的增强子区域)、pLMe2Ⅸm2SN(Me2反向插入)及pLⅨm2SN，筛选高效表达hFⅨ的PA317细胞克隆，稳定转染成肌细胞，分别对单克隆及混合克隆的上清和细胞进行ELISA、PCR等检测及鉴定，并与pLⅨSN载体相比较。结果不同逆转录病毒载体转染靶细胞后hFⅨ表达水平依次为LMe2Ⅸm2SN(正向)>LMe2Ⅸm2SN(反向)>LⅨm2SN>LⅨSN；增强子方向不同的两个载体表达水平差异有显著性，正向插入者蛋白表达量较反向插入者高；靶细胞中反向插入的Me2在5＇LTR中有不同程度的缺失，其方向未发生变化。结论选择组织特异性增强子及优化FⅨ微小基因结构是提高表达水平的有效手段，正向插入增强子的载体能稳定表达外源基因。
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凝血因子Ⅸ野生型pIRES2-ZsGreen1真核表达载体的构建及其在HEK-293细胞的表达
目的 以含有凝血因子Ⅸ(FⅨ)cDNA的pcDNA/FⅨ质粒为模板构建真核表达载体pIRES2-ZsGreen1/FⅨ并检测其在HEK-293细胞中的表达.方法 以pcDNA/FⅨ质粒为模板,扩增出目的基因FⅨ的开放阅读框(ORF)区,使用Infusion酶对线性pIRES2-ZsGreen1双酶切产物及FⅨORF扩增产物进行连接,连接产物进行转化后筛选阳性克隆,对阳性克隆进行DNA测序及凝胶电泳鉴定.野生型pIRES2-ZsGreen1/FⅨ转染HEK-293细胞后,分别采用实时定量PCR、细胞免疫荧光法、一期法检测野生型FⅨ基因mRNA表达水平、蛋白的表达量及细胞裂解液、细胞培养液的FⅨ活性.结果 成功构建pIRES2-ZsGreen1/FⅨ并转染HEK-293细胞,实时定量PCR证实HEK-293细胞表达FⅨmRNA,激光共聚焦显微镜下观察到FⅨ蛋白在细胞质中合成,野生型质粒pIRES2-ZsGreen1/FⅨ转染HEK-293细胞裂解液和细胞培养液的FⅨ活性分别为(92.03士0.29)％、(86.89±8.78)％,无转染的HEK-293细胞裂解液和培养液中FⅨ活性均为0.结论 成功构建FⅨ野生型pIRES2-ZsGreen1真核表达载体.
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国产血源性人凝血因子Ⅸ治疗血友病B的多中心Ⅲ期临床研究
目的 评价一种国产血源性人凝血因子Ⅸ(FⅨ)治疗血友病B的有效性和安全性.方法 采用多中心、开放、自身对照设计,用目标值法评价FⅨ的有效性.根据入组血友病B受试者的出血状况和FⅨ水平确定输注剂量,首次输注后30 min测定FⅨ回收率,(24±4)h观察出血症状和体征改善,记录不良事件,治疗后90 d检测病原微生物指标及FⅨ抗体.结果 36例血友病B患者纳入研究,中位年龄31岁,中位用药次数为4(1~17)次.受试者入组后36次首次出血中,止血效果优良、良好分别为27次(75.00%)、9次(25.00%).首次输注结束后30 min的FⅨ中位回收率为111.92% (65.55%~194.28)%.未发生研究药物相关不良事件.未发生病毒感染.所有受试者首次用药后90~104 d检测FⅨ抑制物均为阴性.结论 试验所用国产血源性FⅨ治疗血友病B具有良好的有效性及安全性.临床试验注册 国家食品药品监督管理总局2016L08027.
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腺相关病毒载体介导的人凝血因子Ⅸ基因在CD34+造血干/祖细胞中的表达
目的研究2型重组腺相关病毒(rAAV-2)介导的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)基因在脐血CD34+细胞及其子代细胞中的表达.方法采用rAAV-2/hFⅨ转导经预刺激的人脐血CD34+细胞,分别向粒单系、巨核系和红系分化培养21 d,从转录水平、蛋白质水平和其功能活性检测hFⅨ的表达,同时检测子代细胞的活力、增殖倍数、各系标志分化抗原的表达及集落产率来评估rAAV-2对其增殖分化能力的影响.结果经测序证实转导组子代细胞的RNA可扩增出hFⅨcDNA片段,上清液中可检测到hFⅨ抗原的表达,每24 h分泌量达14.10 ng/106细胞.转导组和未转导组细胞培养21 d后其活力、增殖倍数、标志性分化抗原的阳性率及集落产率差异均无统计学意义(P值均＞0.05).结论rAAV-2/hFⅨ能有效地转导人脐血CD34+细胞并在其子代细胞中表达具有凝血活性的hFⅨ,且对其体外培养21 d的细胞增殖分化能力无明显影响.
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多重PCR-SSCP快速检测因子Ⅸ基因突变
遗传性因子Ⅸ(FⅨ)缺乏症,又称血友病B是一种X连锁的隐性遗传病,发病率为1.0/10万～1.5/10万,大多数患者主要表现为出血倾向.其发病原因是因为FⅨ基因结构发生异常,从而导致FⅨ质或量发生改变.对血友病B进行基因诊断,不仅可以从分子水平上阐明其发病机制,而且有利于产前诊断,减少患儿的出血,提高人民的健康水平.FⅨ基因位于Xq 26.3～27.1,全长34 kb,由8个外显子,7个内含子以及侧翼序列组成.除了PolyA以外,已知的基因部位内都能检测到突变,且其突变具有多态性[1].我们应用多重PCR-SSCP技术对2例血友病B患者的FⅨ基因突变进行了快速检测,现报道如下.
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血友病的诊断及治疗进展
血友病是X染色体连锁的遗传性出血性疾病,包括血友病A(因子Ⅷ缺乏)和血友病B(因子Ⅸ缺乏).目前本病唯一有效的治疗措施是凝血因子替代治疗.反复替代治疗可能导致肝炎和HIV病毒感染以及获得性凝血因子抑制物等一系列问题,因此,基因治疗日益成为人们关注的热点,也成为可能完全治愈血友病的方法.
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1例系统性红斑狼疮并发急性上肢动脉栓塞病人的护理
系统性红斑狼疮(SLE)是一种自身免疫性疾病,可侵犯全身多个系统器官,反复发作,迁延不愈,病死率高.肾衰竭、感染、神经系统损伤是SLE死亡的主要原因[1].10%的SLE病人血中有抗凝物质,主要是抗凝血酶原转化酶复合物的IgG抗体,少数病人体内还可存在抗激活因子Ⅸ、Ⅺ或凝血酶等抗体,这些凝血物质可引起出血及血管血栓形成[1].我科于2007年2月为1例SLE并发急性上肢动脉栓塞的病人进行了肱动脉切开取栓术,术后经过精心治疗与护理,病人康复出院.现将有关护理报告如下.
