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脂肪酸对成肌细胞增殖和分化的影响
目的 研究不同种类的脂肪酸对成肌细胞增殖和分化的影响.方法 采用不同浓度(200、100、50、25和12.5μmol/L)的棕榈酸(PA)、油酸(OA)和亚麻酸(LA)处理C2C12、L6和3T3-L1细胞,分别于不同时间(2、4、6和8d)MTT法检测细胞增殖；为了考察脂肪酸对成肌细胞分化的影响,分别在C2C12和L6细胞诱导分化前2d,分化第0、2和4d采用25 μmoL/L的PA、OA或LA处理细胞,油红O染色观察细胞转分化,姬姆萨染色和肌酸激酶(CK)测定观察细胞分化.结果 3种脂肪酸对细胞增殖的抑制作用及其时间-效应和剂量-效应随脂肪酸种类和细胞株不同而具有明显的差异.PA和OA比LA具有更显著的细胞增殖抑制作用,且OA对3种细胞的抑制作用没有明显的剂量依赖关系,而LA在100 μmol/L以下时对C2C12和L6成肌细胞的增殖没有明显的时间-效应；与3T3-L1比较,C2C12和L6细胞增殖对脂肪酸的抑制作用更加敏感.在成肌细胞C2C12和L6诱导分化后用脂肪酸处理未观察到显著的作用,但在诱导分化前2d加入脂肪酸能显著影响成肌细胞的分化,LA处理使多核肌管数量和CK含量增加,促进向骨骼肌细胞的分化,而PA和OA处理使细胞内脂滴积累,多核肌管数量和CK含量下降,抑制向骨骼肌的分化而促进向脂肪细胞的转分化.结论 脂肪酸暴露影响体外培养的成肌细胞的增殖和分化,其作用与脂肪酸种类、细胞类型和暴露时期有关.
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微囊化转VEGF基因成肌细胞在全厚皮片移植中的动物实验研究
目的 观察应用微囊化转VEGF基因成肌细胞与生理盐水对照的条件下,对提高大鼠全厚皮片移植成活率的差异性.方法 ①将应用pcDNA6/HisA-VEGF 质粒转染的成肌细胞进行微囊化;②筛选2016年1月购自吉林大学实验动物中心健康Wistar大鼠50只,进行标记序号,随机化分成微囊化组(A组)和对照组(B组),每组25只,背部剃毛,标记范围约4.0 cm×4.0 cm的范围,按标记范围切取制备全厚皮片,在切取皮片后的创面上,微囊化组给予多点注射转VEGF基因成肌细胞混悬液,每点0.1 mL,间隔1.0 cm,对照组给予等量生理盐水注射,然后将全厚皮片原位回植,打包包扎,放回笼中单笼饲养;③14 d后进行观察并摄影;④应用Image pro 5.0软件分别进行测算成活面积百分比;⑤进行统计分析,以观察两组间差异性及微囊化组的治疗作用.结果 经统计分析,微囊化组的成活面积与对照组相比较,微囊化组成活面积(14.1±0.61)cm2,对照组成活面积(13.5± 0.55)cm2,微囊化组成活面积百分比(88.0±3.6)%,对照组成活面积百分比(84.5±3.5)%.两组间差异有统计学意义(P<0.01),微囊化组全厚皮片移植的成活面积明显高于对照组(P<0.05).结论 微囊化转VEGF基因成肌细胞在全厚皮片移植受区创面多点注射,能显著提高全厚皮片移植的成活率.
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益气生骨注射液促进体外成肌细胞增殖作用的研究
目的:研究益气生骨注射液对体外培养的成肌细胞的增殖作用.方法:将成肌细胞进行体外培养,实验组加入不同浓度的益气生骨注射液,对照组分别加入不同浓度的黄芪注射液和复方当归注射液,空白组不加任何药物.筛选出各药物对细胞增殖的适生长浓度,并观察其对细胞的增殖作用.结果:益气生骨注射液对成肌细胞的增殖作用强,与空白组比较,差异有统计学意义(P<0.05),与对照组比较,差异无统计学意义.结论:益气生骨注射液有促进成肌细胞增殖的作用.
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siRNA阻断鼠成肌细胞myostatin表达对细胞增殖及分化能力的影响
目的 研究myostatin表达被阻断后鼠成肌细胞的增殖及分化能力.方法 构建可阻断myostatin表达的siRNA表达载体,并转染鼠成肌细胞,用实时荧光定量RT-PCR和Western印迹鉴定myostatin表达.培养myostatin表达被阻断的成肌细胞,计数不同时间的细胞数和测定细胞表达的肌酸激酶.使用诱导分化培养液培养myostatin表达被阻断的成肌细胞,观察其分化成肌管的能力.结果 siRNA表达载体对成肌细胞myostatin表达的干扰率为81.6%,其干扰效果也被Western印迹所证实.Myostatin表达被阻断的成肌细胞数目增加(P<0.05),细胞内肌酸激酶活力升高(P<0.05).正常成肌细胞培养7 d可分化成肌管,myostatin表达被阻断后需10 d才分化成肌管.结论 siRNA表达载体阻断成肌细胞的myestatin表达后细胞的增殖能力增强,分化被延迟,或许可成为治疗肌肉萎缩的一种新途径.
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体外诱导成人成肌细胞转化为神经前体细胞
目的探讨成人成肌细胞在体外能否转化为神经前体细胞.方法从成人正常颞肌分离单细胞,体外培养及克隆纯化,培养至第三代时加入含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和白血病抑制因子的无血清培养液诱导分化,观察诱导后细胞的形态变化,并进行免疫细胞化学鉴定和RT-PCR分析.结果成肌细胞经诱导后聚集成球,悬浮生长.免疫细胞化学染色见细胞球表达巢蛋白,5-溴脱氧尿嘧啶核苷掺入试验阳性;细胞分化后表达神经丝蛋白68,胶质纤维酸性蛋白和半乳糖脑苷脂.RT-PCR分析结果与免疫细胞化学染色结果一致.结论成人成肌细胞在体外一定条件下诱导能够转化为神经前体细胞.
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巨噬细胞条件培养液对原代培养小鼠成肌细胞生长的影响
目的 观察小鼠巨噬细胞条件培养液对小鼠成肌细胞生长的影响.方法 小鼠腹腔内连续3d注射肌匀浆和淀粉混合物,然后分离小鼠腹腔巨噬细胞,在无血清培养液中培养48h后收集上清.取生后5d小鼠的成肌细胞,在含10%血清的DMEM/F12培养液中培养36～48h后,将血清浓度降低至0.5%.将巨噬细胞培养上清加入低浓度血清培养的成肌细胞中,作用72h后收集细胞,通过Wright染色、LDH细胞化学和免疫细胞化学方法观察成肌细胞的生长情况.结果 巨噬细胞条件培养液能够在低浓度血清的条件下维持成肌细胞的正常形态和活性,并促进成肌细胞增殖.实验组LDH阳性细胞与对照组相比,其平均吸光度与积分吸光度均存在极显著性差异(分别为P＜0.001和P＜0.000 1).免疫细胞化学显示,实验组desmin阳性细胞数明显多于对照组.结论 巨噬细胞条件培养液中含有促进小鼠成肌细胞生长的因子.
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HIF-1通路在低氧对成肌细胞增殖分化影响中的作用
氧是在环境中存在的并在发育过程中起作用的信号分子,调控着细胞的能量代谢、生长和分化.骨骼肌中存在着具有自我更新和分化为肌纤维能力的成肌细胞,出生后成肌细胞在骨骼肌的损伤修复和维持中起重要作用.尽管氧在几乎所有高级生命活动中具有重要作用,但有关氧水平对成肌细胞增殖和分化的影响的研究甚少.体内生理性和病理性微环境的氧浓度是处于低水平的,本文就低氧对成肌细胞增殖和分化的影响,以及HIF-1信号通路在其中的作用进行了综述.
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EAG1钾通道在结直肠癌组织中的表达
EAG1(Kv10.1,ether a go-go)为延迟整流电压门控钾通道,在人脑中大量表达,成肌细胞(即将融合前)和胎盘中有少量表达,但在其他外周组织未发现表达[1].研究表明EAG1有致癌性,可作为潜在的肿瘤诊治工具[2].我们试验旨在研究结直肠癌EAG1钾通道的表达情况及其与临床病理特点的关系.
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软骨源性形态发生蛋白2基因转染自体成肌细胞表达软骨细胞表型的实验研究
目的 研究软骨形态发生蛋白-2(CDMP -2)对小鼠成肌细胞向软骨分化的作用.方法 体外培养小鼠成肌细胞,贴壁细胞传代,取第3代细胞,对照组(A组)以无血清L-DMEM培养液培养,实验组(B、C、D组)以无血清L-DMEM培养液培养,分别加入透明质酸钠、CDMP - 2(100ng/mL)和CDMP -2基因转染的小鼠成肌细胞,14d后终止培养,倒置相差显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色糖胺聚糖(GAG),行Ⅱ型胶原免疫组织化学染色、灰度值分析和Western blot检测.结果 培养14d后转染组和诱导组可见成肌细胞形态由梭形向软骨细胞的多边形转变.甲苯胺蓝染色示糖胺聚糖( GAGs)均匀分布于基质中,免疫组织化学染色和Western blot示实验组Ⅱ型胶原表达阳性,且CDMP -2基因转染组细胞表达Ⅱ型胶原水平高于单独给予CDMP-2,且具有统计学意义；对照组和透明质酸钠组未见阳性表达.结论 CDMP-2基因转染的小鼠成肌细胞能够更好的表达软骨特异性Ⅱ型胶原.
关键词： 软骨源性形态发生蛋白-2 成肌细胞 软骨分化 -
转染CDMP-2基因的成肌细胞与PLGA材料的相容性
目的 探讨转染软骨源性形态发生蛋白2基因的成肌细胞与PLGA(聚乳酸/乙醇酸共聚物)材料的相容性.方法 将转染CDMP-2基因的成肌细胞接种于PLGA支架,以成肌细胞与PLGA支架培养组为对照.采用MTT法检测成肌细胞在支架上的生长情况,并绘制生长曲线.结果与结论 各组吸光度值差异无显著性意义(P＞0.05).转染CDMP-2基因的成肌细胞可以在PLGA材料上良好的生长,为后续研究成肌细胞修复软骨损伤打下了良好的基础.
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Beagle犬上皮细胞原代培养鉴定及脂肪干细胞诱导成肌的实验研究
目的 探讨犬脂肪十细胞(ADSCs)诱导成肌细胞及犬表皮细胞的原代培养方法 的可行性.方法 取雄性Beagle犬腹股沟处皮下脂肪组织和犬口腔黏膜上皮组织,使用酶消化法行ADSCs和表皮细胞原代培养,并对所培养的细胞表面标志进行相关鉴定;取第1代培养至对数生长期细胞分为实验组A和对照组B两组,诱导剂为10 μmol/L的5-氮杂胞苷(5-aza),每日倒置显微镜下观察细胞形态变化,并在诱导的第7、14、21、28天行细胞免疫荧光和流式细胞仪检测其成肌细胞特异性抗原desmin和myosin的表达情况.结果 成功从犬腹股沟部皮下脂肪组织和犬口腔黏膜上皮组织中分离、培养出ADSCs和表皮细胞.上皮细胞生长较缓慢,原代需培养20 d方能达到100 mm培养皿的80%左右,传代后生长速度明显加快,一般10 d就能达到100 mm培养皿的80%;细胞鉴定采用国际上上皮类组织比较常用的AE1/AE3来鉴定,荧光及流式结果 让人满意.在倒置显微镜下观察细胞形态变化显示:诱导组细胞诱导3周呈现成肌细胞特有的漩涡样生长形态,在诱导的第4周单个细胞表现出多核化;免疫荧光和流式细胞仪检测显示:desmin和myosin的表达率在诱导28 d时达高,分别为59.4%和56.1%,而诱导前和对照组细胞均呈阴性表达.结论 总之,由于经济及技术方面存在诸多问题,以至于国内使用犬作为实验动物的很少,且从犬取材获取相应细胞的实验国内少见.本实验通过诱导培养获得成肌细胞,通过原代培养获得上皮细胞,可用做组织工程化尿道修复的种子细胞.
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慢病毒载体表达人B型利钠肽的方法学探索
目的探索构建能表达人B型利钠肽(hBNP)的pLenti6/V5-D-TOPO-hBNP载体的方法,以实现人B型利钠肽基因在骨骼肌成肌细胞中长久、稳定的表达.方法将目的基因人B型利钠肽(hBNP)亚克隆到真核细胞表达载体pLenti6/V5-D-TOPO载体上,构建重组质粒pLenti6/V5-D-TOPO-hBNP.将pLenti6/V5-D-TOPO-hBNP及阳性对照质粒pLenti6/V5-D-TOPO-GFP分别用lipo-fectamin 2000介导转染293FT细胞,获得病毒颗粒;用病毒颗粒转染体外培养的SD乳鼠骨骼肌成肌细胞.荧光显微镜下计数确定阳性对照质粒的瞬时转染数,从而估计该基因的瞬时转染效率.加入筛选试剂以获得稳定表达异源B型利钠肽(BNP)的成肌细胞.收集瞬时转染及筛选后的细胞培养基,用酶连结免疫吸附分析(ELISA)检测试剂盒检测人B型利钠肽(hBNP)的表达水平.结果聚合酶链式反应法及DNA测序显示人B型利钠肽基因成功地插入到pLenti6/V5-D-TOPO载体中;阳性对照质粒转染细胞12 h后,在荧光显微镜下观察,其转染效率达60%以上.检测收集的上清,结果与阴性对照有显著差别(P＜0.01),观察至第4周,人B型利钠肽(hBNP)仍持续稳定表达.结论本实验成功构建了能在真核细胞内表达人B型钠尿肽的重组质粒pLenti6/V5-D-TOPO-hBNP,并且取得了较高的转染效率,因此慢病毒载体介导的基因治疗在心血管疾病中有乐观的应用前景.
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成肌细胞表达异源心钠素基因的研究
目的研究成肌细胞表达异源心钠素(atrial natriuretic factor,ANF)基因的可行性,为其在心血管疾病中的应用提供依据.方法以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增人的心钠素基因,将其与质粒pcDNA3.0连接,构建质粒pcDNA3.0/ANF.将pcDNA3.0/ANF及对照pcDNA3.0分别转染体外培养的大鼠骨骼肌成肌细胞,筛选以获得稳定表达异源心钠素基因的细胞.收集筛选后的细胞培养基以放射免疫分析法检测心钠素的表达水平,第14d以定量PCR的方法检测成肌细胞内心钠素mRNA的水平.结果pcDNA3.0/ANF组重组心钠素的表达水平为174.19+52.43pg/ml,成肌细胞内mRNA含量(灰度值)为254.62+10.86,与对照组比较均有显著性差异,P＜0.01.结论成肌细胞可以表达异源心钠素基因,这一方法有可能应用于心血管疾病的基因治疗.
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细胞移植治疗心肌梗塞的研究进展
成熟个体的心肌细胞不可再生,一旦受损只能由疤痕组织代替.心肌梗塞后残留心肌数量大量减少及继发心室重构是冠心病患者终末期心力衰竭的主要原因.成肌细胞、心肌细胞、直至平滑肌细胞被陆续移植入心脏,发现其均可存活并有助于提高心功能.但目前用细胞移植来提高有效心肌细胞数量的方法尚处于实验室研究阶段.
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成肌细胞自体移植及其功能的实验研究
目的:观察成肌细胞自体移植后在宿主体内生长、增殖情况及对实验动物心功能的影响.方法:将30只SD大鼠随机分为移植组(n＝20)及对照组(n＝10),另选6只进行皮下自体移植,液氮冷冻大鼠左心室游离壁 ,建立心肌梗死模型.将体外培养的成年大鼠成肌细胞自体移植到相应大鼠的皮下及心肌疤痕中,观察细胞的生长、增殖情况,结合心脏重量指数及血流动力学等参数评价细胞移植后对心功能的影响.结果:6只进行皮下自体移植的大鼠中,有2只在移植部位形成排列紊乱的肌纤维结构.20只行成肌细胞心肌内自体移植的大鼠中,有6只myogenin染色阳性,证明成肌细胞可在宿主皮下及心肌疤痕中存活.与移植失败者及对照组相比,移植成功者左心室重量、左心室重量/体重、心脏重量/体重及左心室舒张末期压力均降低,有统计学差异(P＜0.05～0.01).压力变化率大值(dp/dtmax)升高,有统计学差异(P＜0.05).结论:成肌细胞自体移植后可在宿主体内生长、增殖,并可在一定程度上改善心肌梗死后大鼠的心功能.
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地黄低聚糖对骨骼肌成肌细胞瞬时外向钾电流的影响
目的 从细胞瞬时外向钾电流(Ito)角度,探讨地黄低聚糖(RGOs)对骨骼肌成肌细胞(SMs)电生理特性的影响.方法 分离成年大鼠心肌细胞和SMs,运用膜片钳技术研究心肌细胞和SMs以及0.625g·L-1RGOs干预后,SMs与心肌细胞Ito的差异.结果 两种细胞Ito均从-40mV时开始激活,RGOs对大鼠SMs Ito有增加作用,从-30mV到30mV,经过0.625g·L-1RGOs预处理的SMs组Ito密度[(7.3±0.7)to(65.3±2.3)pA/pF(n=5)]显著高于心肌组[(0.9±0.1)to(28.8±0.9)pA/pF(n=5)3和SMs组[(4.5±0.5)to(23.7±2.0)pA/pF(n=5)3的电流密度.结论 RGOs能显著提高SMs的Ito密度,影响移植的SMs的电生理特性.这为今后在提高干细胞移植有效性同时,增加其安全性提供了一个新的思路.
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低氧诱导因子-1α基因修饰后的成肌细胞移植治疗心肌梗死的研究
目的 评价低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因修饰骨骼肌成肌细胞(SkMs)治疗心肌梗死的可行性及其疗效.方法 将71只Wister大鼠采用结扎冠状动脉左前降支制备心肌梗死模型,通过局部注射法将细胞植入心肌梗死区域.其中将制膜成功的42只成活大鼠随机分为假手术组(SO组,6只)、注射培养液组(DMEM组,6只)、移植SkMs组(SkMs组,10只)、移植感染了携带HIF-1α空载体腺病毒的SkMs组(Ad/GFP组,10只)和移植感染了携带HIF-1d基因腺病毒的SkMs组(Ad/HIF-1α组,10只).术后28天用免疫组织化学法和血流动力学评价治疗效果.结果 28天后SkMs组、Ad/GFP组和Ad/HIF-1α组大鼠梗死心肌周围血管新生明显,以Ad/HIF-1α组为显著(P<0.05),且胶原沉积少;SkMs组、Ad/GFP组和Ad/HIR-1α组大鼠左心室收缩功能好转,Ad/HIF-1α组为显著(P<0.05).结论 HIF-1α基因修饰后的SkMs移植较单纯成肌细胞移植是治疗心肌缺血更为有效的方法.
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成年大鼠成肌细胞的原代培养
目的探索成年大鼠成肌细胞的原代培养方法.方法取成年SD大鼠的胸大肌,利用组织块培养法培养成肌细胞.绘制生长曲线,并对培养细胞进行形态学研究和免疫细胞化学鉴定.结果采用组织块培养法,2周后成肌细胞的密度可达10/ml,免疫细胞化学分析显示90%以上的细胞呈骨骼肌特异的肌细胞生成素(myogenin)抗体染色阳性.结论利用组织块法成功培养成年大鼠原代成肌细胞,该方法实用性强,所得成肌细胞纯度高,为深入研究心肌梗死疤痕中成肌细胞自体移植奠定了基础.
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骨髓基质细胞向成骨细胞诱导分化的研究进展
骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSC)是位于骨髓中的一种干细胞,因在体外经适当的培养条件可以向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞等多种间充质来源的组织细胞分化,又被称为间充质干细胞(mesenchymal stem cell).骨髓基质细胞位于骨髓,具有取材方便,易于体外扩增,自体移植无免疫排斥性等优点,是骨组织工程中种子细胞的理想来源.骨髓基质细胞,其向成骨细胞的定向诱导分化将是关键的一步.笔者就骨髓基质细胞向成骨细胞诱导分化有关影响因素的研究进展作一综述.
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成肌细胞-PLGA支架复合物修复比格犬半月板损伤的实验研究
目的 探讨成肌细胞种植于聚乳酸聚乙酸共聚物(PLGA)支架上,软骨定向诱导后植入比格犬体内修复半月板缺损的可能性.方法 将来源于比格犬的成肌细胞培养传代至第4代,收集后以5.0×106细胞/cm3材料体积密度将细胞接种于PLGA支架中,含50 ng/ml软骨源性形态发生蛋白-2(CDMP-2)和20 ng/ml转化生长因子β1(TGF-β1)软骨诱导培养基培养14 d.然后将细胞-支架复合体植入24只比格犬半月板缺损模型中,术后4、8、12周取材,采用大体观察、组织学、生物化学和生物力学作为评估指标.结果 术后4、8、12周各项检测结果显示PLGA支架材料逐渐降解吸收,而成肌细胞可逐渐合成分泌新生胶原,并终形成半月板样纤维组织,而对照各组缺损区则仅见少许纤维组织样的修复组织.结论 利用成肌细胞经体外扩增及细胞因子刺激后,以PLGA支架为载体,按一定的细胞密度复合培养后,植入关节腔内修复半月板局部缺损的方法,是一种较为可行的修复半月板损伤的方法.
