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镰刀菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇对心肌细胞Ca2+通道的阻滞作用
目的观察镰刀菌毒素单端孢霉烯族化合物脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)对培养心肌细胞Ca2+通道单通道电活动的影响.方法取新生1～2日龄Wistar大鼠,分离心肌细胞,培养基为80%DMEM与20%小牛血清,于37℃,在含5%CO2与95%空气的培养箱内进行培养,于培养24～48h期间进行实验记录.采用贴附式膜片钳技术,记录心肌细胞B、L、T三型Ca2+通道单通道电活动为加入毒素前对照,然后向培养基中加入1 mg·ml-1DON,以观察DON对心肌细胞Ca2+通道单通道电活动的影响.结果DON浓度为1 mg·ml-1时,心肌细胞B,L,T三型Ca2+通道均受到明显的阻滞.其阻滞作用表现在使B、L、T三型Ca2+通道的开放时间分别缩短47.3%,42.1%和17.1%,关闭时间分别延长283.3%,92.8%和40.7%,使通道的开放概率分别下降77.8%,71.1%和42.8%.而对流过B,L,T三型Ca2+通道的Ba2+流幅值均无明显影响.结论DON能抑制大鼠培养心肌细胞的Ca2+通道.
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兔颈上神经节神经元的急性分离及其通道电流记录
目的 探讨兔颈上神经节神经元分离及电生理研究的方法.方法 为了获得适用于膜片钳实验技术的单个颈上神经节神经细胞,应用酶和机械分离相结合的方法,急性分离20～30 d幼兔的单个颈上神经节神经元.通过倒置显微镜直接观察以及全细胞膜片钳技术的电压钳和电流钳分别对分离得到的颈上神经节神经元的形态学和电生理学特性进行研究.结果 急性分离所得活性较好的颈上神经节神经元胞体具有圆形和顶树突特征,立体感强,光晕明显.在全细胞膜片钳记录模式下可记录到全细胞电流、钠电流、钾电流及动作电位.结论 该方法可以得到形态和生理特性良好的单个颈上神经节神经元;该方法适用于膜片钳技术的研究,对深入探讨药物、物理因子等对神经节神经元离子通道的影响具有重要的应用价值.
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研究电压门控性钠离子通道的3种细胞处理方法比较
目的 建立适用于膜片钳技术记录电压门控性钠离子通道的3种细胞处理方法并进行比较.方法 采用急性分离技术、分离脑片技术、pCMV_SCN1A质粒钙转染HEK293细胞3种方式处理细胞,镜下观察细胞形态,膜片钳记录钠通道激活情况.结果 急性分离的神经元形态正常,有较长突起；膜片钳记录封接成功率达50％以上,记录到电流的细胞膜电容为(7.56±3.47)pF(n=20),串联电阻为(10.18±4.82)MΩ(n=20).分离脑片的神经元形态正常饱满；膜片钳记录封接成功率达30％以上,记录到电流的细胞膜电容为(9.45±4.26)pF(n=10),串联电阻为(12.53±3.87)MΩ(n=10).钙转染处理的细胞完整,有立体感；膜片钳记录封接成功率约20％,记录到电流的细胞膜电容为(8.79±4.54)pF(n=10),串联电阻为(14.12±4.26)MΩ(n=10).3种细胞处理方法均能提供研究所需的钠通道电流.结论 3种细胞处理方法均可以简单、快速记录电压门控性钠离子通道,各有优缺点,适用于不同的研究需求.
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膜片钳技术在麻醉研究中的应用
目前认为麻醉作用的产生是由于中枢神经元的突触抑制或其本身的兴奋性降低所致,其作用的分子机制可能与神经细胞膜上离子通道活性改变有关.而在麻醉药与离子通道的作用方面,以前主要采用电压钳技术进行研究,并且发现许多麻醉药物特别是局麻药可以抑制周围神经的钠、钾电流.但由于电压钳技术必须在细胞内插入二个电极,对细胞损伤很大,对于一些体积较小的哺乳动物细胞如中枢神经细胞就难以实现.因此始于1976年的一种叫做膜片钳技术的新记录方法,克服了上述缺点[1],引起了电生理学界一次新技术革命.此技术的开展也为麻醉学基础研究提供了一个直观的、先进的实验手段.
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咪达唑仑对人H441细胞上皮钠通道电流的影响
目的：咪达唑仑是一种常用的静脉麻醉药，本实验旨在探讨咪达唑仑与上皮钠通道电流之间的关系，明确咪达唑仑是否能够通过改变肺泡上皮 Na＋转运而影响肺泡液体的清除。方法应用膜片钳技术测定H441细胞全细胞电流，阿米洛利敏感性电流用总电流值减去阿米洛利可抑制的电流差值算得。结果应用0～100μmol/L咪达唑仑灌流后，阿米洛利敏感性电流剂量依赖性下降，由剂量效应曲线计算出IC50值为1.3μmol/L。结论临床上对合并肺脏损害的病人应用咪达唑仑时应考虑其可能对肺脏液体清除作用的影响。
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成年小鼠心房肌细胞分离方法的改进及钾电流记录
目的：建立稳定、重复性好的小鼠心房肌细胞分离技术，观察小鼠心房肌细胞形态以及钾通道电流特性，为进一步研究小鼠心房肌细胞的电生理特性打下基础。方法在体视显微镜下行主动脉插管，应用Langendorff装置恒流灌流，依次用无钙台氏液、酶消化液（含Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶）灌流，灌流完成后，剪除心室组织，心房组织块用消化酶液（仅含Ⅱ型胶原酶）行二步消化，分离出小鼠单个心房肌细胞，采用标准的全细胞膜片钳技术记录动作电位和钾电流，电流的电压-电流曲线（I-V曲线）以电压为横坐标，每个电压值下的电流密度（pA/pF）为纵坐标拟合而成。结果本法分离所得小鼠心房肌细胞呈长梭形、横纹清晰，细胞耐钙，具有正常电生理活性，细胞贴壁好，从而易于形成高阻封接；记录小鼠心房肌细胞动作电位为近似于三角形，静息电位为（-70.2±4.9）mV；记录的瞬时外向钾电流（Ito）激活非常快，达峰值后快速失活，峰电流存在明显的电压依赖性和外向整流特征，电流峰值为（11.1±1.9）pA/pF；超速激活的延迟整流钾电流（IKur）激活迅速，几乎无延迟现象，失活缓慢，峰电流呈现出外向整流特征，该电流约在-20 mV被激活，峰电流存在明显的电压依赖性，峰值（7.0±1.5）pA/pF。内向整流钾电流（IK1）随着超极化刺激电位的增加，电流密度增加，在-140 mV时，其内向电流的峰值为（27.0±2.3）pA/pF。结论此方法可成功获取适合做膜片钳实验的单个小鼠心房肌细胞，操作方法简便，可行性高，重复性好。
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急性胰腺炎大鼠心室肌细胞瞬间外向钾电流的变化
目的 探讨急性胰腺炎大鼠心室肌细胞瞬间外向钾电流的变化.方法 以开腹胆总管注射牛磺胆酸钠的方法制备大白鼠急性胰腺炎实验模型,24～48h后处死动物分离单个心室肌细胞,采用全细胞膜片钳技术观察心肌细胞瞬间外向钾电流(Ito)的变化,以正常大白鼠心肌细胞的Ito为对照.结果 急性胰腺炎大鼠心室肌细胞的瞬间外向钾电流受到抑制,电流密度-电压关系曲线下移,其峰值电流密度由对照组的(52.16±13.12)pA/pF下降为急性胰腺炎组的(11.83±4.20)pA/pF,+70mV的Ito电流密度较对照组下降了58.15%(P＜0.001),其失活曲线左移,半数大失活电位对照组为(-45.2±8.3)mV,急性胰腺炎组为(-55.0±8.6)mV,与对照组比较显著减小(P＜0.001),失活速度加快;急性胰腺炎组Ito恢复速度明显减慢,恢复时程延长(与对照组比较P＜0.001).结论 急性胰腺炎后心室肌细胞的Ito受抑制,可能为急性胰腺炎后发生心律失常发生的机制之一.
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模拟缺血再灌注对乳兔窦房结细胞起搏电流的影响
目的：观察模拟缺血再灌注（I/R）对乳兔窦房结细胞形态及起搏电流（If）的影响，阐明I/R制备窦房结细胞损伤的电生理特征改变。方法选用新生新西兰乳兔，采用双酶解法/差速贴壁法分离窦房结细胞，模拟I/R制备受损模型，利用膜片钳技术记录动作电位和If。结果乳兔窦房结细胞主要呈梭形，搏动频率快，细胞表面光滑完整。模拟I/R后大部分细胞肿胀变形，伪足回缩，胞膜有较多颗粒、欠光滑。模拟再灌注后窦房结细胞If大舒张电位由（-50.9±5.3）mV变为（-43.5±4.6）mV，电流密度由（-3.2±0.41）pA/pF变为（-2.47±0.32）pA/pF，其稳态激活曲线较对照组明显右移，半数激活电压由（-98.6±2.3）mV变为（-107.8±4.7）mV（P＜0.05）。结论模拟I/R导致窦房结细胞损伤，细胞电生理发生改变，尤以If重构为主。
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地黄低聚糖对骨骼肌成肌细胞瞬时外向钾电流的影响
目的 从细胞瞬时外向钾电流(Ito)角度,探讨地黄低聚糖(RGOs)对骨骼肌成肌细胞(SMs)电生理特性的影响.方法 分离成年大鼠心肌细胞和SMs,运用膜片钳技术研究心肌细胞和SMs以及0.625g·L-1RGOs干预后,SMs与心肌细胞Ito的差异.结果 两种细胞Ito均从-40mV时开始激活,RGOs对大鼠SMs Ito有增加作用,从-30mV到30mV,经过0.625g·L-1RGOs预处理的SMs组Ito密度[(7.3±0.7)to(65.3±2.3)pA/pF(n=5)]显著高于心肌组[(0.9±0.1)to(28.8±0.9)pA/pF(n=5)3和SMs组[(4.5±0.5)to(23.7±2.0)pA/pF(n=5)3的电流密度.结论 RGOs能显著提高SMs的Ito密度,影响移植的SMs的电生理特性.这为今后在提高干细胞移植有效性同时,增加其安全性提供了一个新的思路.
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二十二碳六烯酸对大鼠冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活性钾电流的影响
目的 探讨二十二碳六烯酸(DHA)对大鼠冠状动脉平滑肌细胞(CASMCs)上大电导钙激活性钾电流(BKCa)的影响.方法 采用酶消化法获得大鼠CASMCs,并用单通道内膜向外(inside-out)模式及全细胞膜片钳技术记录,分别加入10、20、30、40、50、60、70和80μLmol/L DHA后,大鼠CASMCs的BKCa变化.结果 (1)单通道inside-out模式下,测试电位-60 mV及DHA浓度>10 μmol/L时,BKCa的开放概率(Po)增大,且呈浓度依赖性,Po从[(0.072±0.003)μmol/L DHA,n=6]增至[(0.601±0.030)80 μmol/L DHA,n=10,P<0.05],半效激活浓度为(36.110±0.080)μmol/L;当DHA浓度<10μmol/L时,Po增加不明显(P>0.05);(2)全细胞模式下,随着DHA浓度增加,BKCa电流密度逐渐增大,且呈浓度依赖性.测试电位+80 mV,BKCa电流密度从[(48.95±2.5)pA/pF 0 μmol/L,n=6]增至[(226.3±11.3)pA/pF 60μmol/L,n=8,P<0.05].结论 随着DHA浓度的增加,BKCa Po及电流密度逐渐增大,DHA对BKCa的影响可能是舒张血管的机制之一.
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通心络对豚鼠肥厚心肌电压依赖性钾通道的影响
目的 观察通心络对腹主动脉缩窄高血压豚鼠心肌肥厚的影响,探讨其抗心律失常可能的机制.方法 选择豚鼠60只,随机分为假手术组、模型组和通心络组,每组20只.假手术组只分离腹主动脉,不做结扎,灌胃8周.模型组及通心络组采用腹主动脉缩窄法建立心肌肥厚模型成功后,分别以蒸馏水、通心络溶于蒸馏水灌胃8周.测量各组舒张末期室间隔厚度(IVSTD)、左心室舒张末期后壁厚度(LVPWTD),记录心肌细胞膜电容、慢激活延迟整流钾电流通道(Iks)及快激活延迟整流钾电流通道(Ikr)电流密度.结果 与假手术组比较,模型组和通心络组IVSTD和LVPWTD明显升高,且通心络组IVSTD及LVPWTD明显低于模型组,差异有统计学意义[(1.65±0.06)mm vs (1.88±0.05)mm,(1.74±0.11)mm vs (2.19±0.12)mm,P＜0.05].3组心肌细胞膜电容比较,差异有统计学意义(P=0.003).通心络组心肌细胞Ikr、Iks电流密度明显低于模型组,差异有统计学意义[(2.46±0.21)pA/pF vs (3.16±0.21)pA/pF,(10.09±1.07)pA/pF vs(13.76±0.19)pA/pF,P＜0.05].结论 通心络能阻断肥厚心肌细胞异常增大的电压依赖性钾离子电流,可能是干预肥厚心肌细胞电生理异常的重要机制之一.
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咪达普利对舒张性心力衰竭大鼠心房肌细胞L型钙通道电流及相关基因蛋白表达的影响
目的 探讨咪达普利对舒张性心力衰竭(DHF)大鼠心房肌细胞L型钙通道电流(ICa-L)和ICa-L相关基因Cav1.2蛋白表达的影响.方法 30只雄性SD大鼠随机分为对照组、DHF组、低、中、高剂量组,每组6只.后4组采用腹主动脉缩窄建立DHF模型,对照组和DHF组予等量生理盐水,低、中、高剂量组依次给予咪达普利1.5、3和6 mg/(kg·d)干预.各组干预4周后,采用心脏超声检测心功能,急性酶解法获得单个大鼠心房肌细胞和标准全细胞膜片钳技术记录通道电流,凝胶电泳法记录心房肌细胞ICa-L相关基因Cav1.2的蛋白表达.结果 与对照组比较,DHF组大鼠心房肌细胞ICa-L电流密度峰值和Cav1.2蛋白表达明显减少;与DHF组比较,低、中、高剂量组大鼠心房肌细胞ICa-L峰值电流密度和Cav1.2蛋白表达明显增加,该作用随着咪达普利剂量增加而增加.结论 咪达普利明显抑制DHF大鼠心房肌ICa-L下调,此作用与增加心房肌Cav1.2蛋白表达水平有关.
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膜蛋白LRRC8A在小鼠心肌细胞的表达及电生理特性
目的 探讨容积敏感性氯通道蛋白主要成分LRRC8A在小鼠心肌细胞的表达及电生理特性.方法 采用原代培养的小鼠乳鼠心肌细胞,上海吉玛公司合成4个不同LRRC8A的小干扰RNA(siRNA),片段依次为A组、B组、C组和D组,另将1个不包含siRNA的片段作为NC组.将含LRRC8A siRNA片段的腺病毒感染心肌细胞,用等渗、低渗、低渗加DCPIB、低渗加siRNA外液灌流.RT-PCR法和Western Blot法检测各组LRRC8A在心肌细胞的表达;应用膜片钳检测各种状态下LRRC8A电生理特性(ICLvol)的变化.结果 心肌细胞能正常表达LRRC8A,腺病毒成功感染细胞后,与NC组比较,A、B、C和D组LRRC8A mRNA及蛋白表达量均降低(P＜0.05).与等渗外液比较,低渗外液ICLvol明显升高,与低渗外液比较,低渗加DCPIB外液的ICLvol降低,抑制率达到(96.48±2.63)％(P＜0.01),与低渗外液比较,低渗加siRNA外液的电流密度值下降达(83.04±8.41)％(P＜0.01).结论 LRRC8A是小鼠心肌细胞膜重要的组成成分,是容积敏感性氯通道的重要构成蛋白.
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兔心肌心室间复极离散的电生理学机制研究
目的 观察生理和缺血状态下兔心室间复极离散,探讨临床缺血心肌发生室性心律失常的电生理机制.方法 酶解法急性分离兔心室肌细胞,采用细胞膜片钳技术,分别观察对照组(正常心室内膜动作电位时程)和缺血组(缺血心室内膜动作电位时程)在不同刺激频率下[即基础循环周长(basic cycle length,BCL)=2 000、1 000、500及250 ms]左右心室肌心内膜细胞的动作电位时程变化.结果 对照组生理心肌的室间离散分别为(47.70±7.89)ms,(45.50±7.00)ms,(40.30±7.33)ms,(37.90±6.45)ms;缺血后心室间离散则分别为(91.90±7.67)ms,(91.40±7.62)ms,(88.60±7.78)ms,(89.20±6.91)ms.结论 生理状态的心肌左右心室间存在复极离散,缺血状态下心室间复极离散增大.这种心室间的复极异质性可能是缺血心肌发生室性心律失常的电生理机制之一.
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厄贝沙坦对心力衰竭大鼠心室电生理重构及瞬时外向钾电流的影响
目的 探讨厄贝沙坦对心力衰竭大鼠心室肌细胞电生理重构及瞬时外向钾电流(Ito)的影响.方法 采用腹主动脉缩窄法建立心力衰竭大鼠模型,将制模成功的21只大鼠随机分为心力衰竭治疗组(治疗组,10只)、心力衰竭对照组(对照组,11只)和另选10只大鼠为假手术组.术后16周测定3组大鼠心率、ORS时间、QT间期、校正QT间期、心室有效不应期以及心功能.采用酶解法获得单个大鼠心室肌细胞并以标准全细胞膜片钳技术记录Ito.结果 与假手术组比较,对照组和治疗组大鼠血压、左心室舒张末压明显升高,对照组大鼠校正QT间期、心室有效不应期明显延长,心室肌细胞Ito密度明显减少;治疗组大鼠心室肌细胞Ito密度较对照组明显增加,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01).与对照组比较,治疗组大鼠心室有效不应期明显缩短(P<0.05).结论 厄贝沙坦治疗能明显改善慢性心力衰竭大鼠电生理失稳态变化,可能与其增加心室肌细胞膜Ito有关.
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动脉粥样硬化兔主动脉平滑肌细胞钙激活钾通道变化及意义
目的探讨动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)兔主动脉平滑肌细胞钙激活钾(Calcium-activated potassium,KCa)通道变化及意义.方法20只健康新西兰白兔随机分为AS组和对照组,每组10只.用酶消化法获取单个主动脉平滑肌细胞,通过膜片钳记录技术检测AS兔主动脉平滑肌细胞Kca通道的活性,并在浴液中分别加入不同浓度的Ca2+,实时采样记录通道的开放概率(Po)、平均开放时间(To)、平均关闭时间(Tc)和电流幅值(Am),以加钙前作为对照组观察上述参数的变化.结果AS组Kca通道的活性明显高于对照组.结论AS血管平滑肌细胞Kca通道的活性明显增加,可能是AS血管发生代偿性扩张的机制之一.
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氟桂利嗪对原代培养大鼠皮质神经元钠离子通道电流的影响
目的：探讨氟桂利嗪对大鼠皮质神经元电压门控钠离子通道电流的影响及机制。方法选择孕17～18 d SD胎鼠培养皮质神经元，应用全细胞记录式膜片钳技术记录神经元钠离子通道电流，先加入0．1、1．0、10．0和100.0μmol/L氟桂利嗪刺激，后续实验使用1μmol/L氟桂利嗪刺激，比较加药前后钠电流相关曲线的变化。结果0．1、1．0、10．0和100．0μmol/L氟桂利嗪对峰值电流抑制率分别为（14．70±4．39）％，（43．48±3．21）％，（61．91±7．41）％和（77．01±5．80）％，差异有统计学意义（ P＜0．05），氟桂利嗪达到半数大抑制率时的药物浓度为0．94μmol/L。与加药前比较，加药后钠电流失活曲线向超极化方向移动了17．03 mV ；钠通道复活时间常数由（7．51±0．05）ms增至（19.46±0．03）ms ，差异有统计学意义（P＜0．05）；10 Hz、50 Hz脉冲频率下，加药后钠电流较加药前减少幅度分别为[（21．63±7．36）％至（9．44±5．13）％]和[（45．83±10．04）％至（12．56±6.72）％，P＜0．05]。结论氟桂利嗪对皮质神经元钠电流的抑制效应，或能解释其预防偏头痛发作的另一可能机制。
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心房颤动发病机制的基因学研究进展
心房颤动(房颤)是临床上常见的一种心律失常,其发生与生活质量下降、脑卒中、心力衰竭、病死率的增加等密切相关[1-2].目前,房颤的发病率越来越高,然而具体的发病机制仍不明确.近年来,房颤基因学方面的研究为明确房颤发病机制提供了新的观点.近,一项包括2446例入选者的前瞻性队列研究发现了外周血中与持续性房颤紧密相关的7个基因,并详细比较了各个基因与房颤之间的关联度大小[3].父母患房颤者,则子女房颤发病率增加1.85倍.家族中有房颤患者,则该家庭成员发生心律失常的可能性要增加40％[4].众多流行病学研究证据表明,基因在房颤中都起到至关重要的角色.因此,明确房颤发病的易感基因,能够对房颤的发生、维持的机制,为未来的研究方向提供新的观点.我们将从房颤发病机制的角度分析房颤发病机制的基因学研究进展.
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电压门控钠通道的研究进展
电压门控钠通道(VGSC)是由用成孔的α亚基和多2个相关的β亚基组成,对于可兴奋细胞产生动作电位至关重要.1952年,科学家发现和描述了钠电流(INa),之后研究了其电压依赖的门控机制,通道的选择性以及VGSC一般结构.近,细菌的VGSC的α亚基晶体结构提供了对VGSC功能的新见解.本综述目的在于概述VGSC的重要发现,并讨论研究VGSC与疾病的关系.
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大麻素受体在海马CA1区锥体神经元的功能表达
目的 观察大麻素受体在孤立的海马CA1区锥体神经元的功能表达.方法 将出生15～20 d的Wistar大鼠取脑,急性分离出单个CA1区锥体神经元,用膜片钳技术记录神经元电活动,观察非选择性大麻素受体激动剂Win55212-2(5μmol/L)对神经元静息电位、动作电位、自发发放频率的影响.根据Win55212-2对膜电位的影响分为超极化组(n=7)和去极化组(n=6).组织切片活性用MTT染色法检测.结果 与给药前比较,超极化组神经元给药中动作电位频率和膜电压显著降低[0 Hzvs (4.3±3.2)Hz,P＜0.05;(-57.0±4.6)mV vs(-54.1±3.8)mV,P＜0.01];与给药中比较,给药后动作电位频率及膜电压显著升高,差异有统计学意义(P＜0.01).与给药前比较,去极化组神经元给药中动作电位频率显著降低,膜电压显著升高(P＜0.01);与给药中比较,给药后动作电位频率显著升高,膜电压显著降低,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 CA1区锥体神经元可能存在大麻素受体功能表达且不限于大麻素受体1;激活大麻素受体可能通过不同的机制起到抑制CA1区锥体神经元的作用.
