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多离子通道阻断的抗心律失常中药研究探讨
心脏电信号传导的基础是心肌细胞跨膜离子通道电流,心肌细胞钠、钾、钙等离子通道顺序开放并保持动态平衡是心脏正常工作的基础,一些心律失常易感因素可通过影响钠、钾、钙等离子通道功能,引起离子通道间平衡失调、心肌电信号传导紊乱、心律失常的发生[1].既往开展的抗心律失常中药机制研究多是初步探讨和推测性结论,未能明确其抗心律失常的基础[2],近年来广泛应用于细胞电生理学研究的膜片钳技术是以微弱电流信号测量为基础,利用玻璃微电极与细胞膜封接来测量多种通道电流,膜片钳技术的问世给细胞生物学研究带来了一场革命,尤其是近年来该技术开始应用于抗心律失常中药机制的研究中,既有膜片钳单通道记录,又有全细胞记录[3],进一步揭示了中药抗心律失常的机制,同时获得了临床证据.
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NR2A亚单位C末端的部分缺失对 NMDA受体功能和表达的影响
目的研究NMDA受体NR2A亚单位羧基末端(以下简称为C末端)不同部位缺失对该受体表面表达和功能的影响.方法以GFP-NR2A为起始质粒构建了4个依次缺失部分C末端的GFP标记的NR2A亚单位表达载体:NR2A-△C1(缺失897L至1017S)、NR2A-△C2(缺失1024D至1142P)、NR2A-△C3(缺失1149D至1347G)及NR2A-△C4(缺失1354S至1464V);通过活细胞免疫化学染色分析这些载体与NR1-1a亚单位共转染后在HEK293细胞和海马神经元的表面表达,并通过电生理检测转染HEK293细胞NMDA受体的功能. 结果当NR2A-△C1、NR2A-△C2、NR2A△C3、NR2A-△C4分别与NR1-1a共转染HEK293细胞时,均可获得细胞膜表面表达,其表面染色阳性的细胞在绿色荧光蛋白细胞中的百分比与共转染NR1-1a/GFP-NR2A时的百分比相比均无显著性降低;并且NR1-1a/NR2A-△C2或NR1-1a/NR2A-△C4转染的HEK293细胞均能记录到谷氨酸诱发的NMDA受体通道电流.在海马神经元中,当转染NR2A-△C1、NR2A-△C2或NR2A-△C3时,单位长度树突表面表达的受体簇数量均显著低于转染GFP-NR2A的神经元,而转染NR2A-△C4的树突表面表达的受体簇数量却无显著性降低.结论在HEK293细胞中,C末端部分缺失的NR2A亚单位不影响含NR2A亚单位的NMDA受体在膜表面表达;而在海马神经元中,含NR2A的NMDA受体的表面表达数量受NR2AC末端的调控.
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研究电压门控性钠离子通道的3种细胞处理方法比较
目的 建立适用于膜片钳技术记录电压门控性钠离子通道的3种细胞处理方法并进行比较.方法 采用急性分离技术、分离脑片技术、pCMV_SCN1A质粒钙转染HEK293细胞3种方式处理细胞,镜下观察细胞形态,膜片钳记录钠通道激活情况.结果 急性分离的神经元形态正常,有较长突起；膜片钳记录封接成功率达50％以上,记录到电流的细胞膜电容为(7.56±3.47)pF(n=20),串联电阻为(10.18±4.82)MΩ(n=20).分离脑片的神经元形态正常饱满；膜片钳记录封接成功率达30％以上,记录到电流的细胞膜电容为(9.45±4.26)pF(n=10),串联电阻为(12.53±3.87)MΩ(n=10).钙转染处理的细胞完整,有立体感；膜片钳记录封接成功率约20％,记录到电流的细胞膜电容为(8.79±4.54)pF(n=10),串联电阻为(14.12±4.26)MΩ(n=10).3种细胞处理方法均能提供研究所需的钠通道电流.结论 3种细胞处理方法均可以简单、快速记录电压门控性钠离子通道,各有优缺点,适用于不同的研究需求.
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人胚肾(HEK293)细胞自身的钾通道
目的 研究人胚肾(HEK293)细胞自身的电压依赖性的钾通道.方法 利用全细胞膜片钳技术,记录HEK293细胞上的外向电流及其通道的电生理特点.结果 HEK293细胞上未发现氯电流.59.7%的细胞表达一种类似瞬间外向钾电流(Ito)的钾电流,该电流对4-AP敏感,2mmol/L的4-AP可明显抑制此电流.在40mV时,此电流幅度为(175±112)pA.失活曲线显示其通道的半数失活电压为(-3.5±0.9)mV,斜率为(6.3±0.8)mV.该通道从失活状态中恢复的时间常数为(333.3±33.9)ms,其失活动力学曲线呈钟形.结论 HEK293细胞自身存在Ito样电流,且此电压依赖性钾通道是其自身表达的主要的有功能的离子通道,提示在利用此广泛应用的表达系统来研究外源性离子通道的时候,应该加倍注意.
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碘化二甲基粉防已碱对骨骼肌细胞烟碱诱发电流的抑制作用
目的比较碘化二甲基粉防已碱(DMTI)和二氢-β-刺桐啶碱(dHβE)对烟碱诱发电流的抑制作用,并确定DMTI在烟碱受体上的作用位点.方法取新生Wistar大鼠骨骼肌细胞体外培养获得肌球,用膜片箝全细胞记录技术,观察肌球的烟碱诱发电流.结果 0.08mmol*L-1 DMTI抑制烟碱诱发电流幅度的作用与0.02mmol*L-1 dHβE的作用类似.向单个细胞持续给烟碱覆盖诱发电流的全过程.电流的衰减过程反映了烟碱受体的失敏,DMTI使烟碱诱发电流的慢失敏时间常数减小,即加速受体失敏,但没发现dHβE有这种作用.在-30、-50、-70、-90mV钳制电压处观察电压改变对DMTI和对dHβE作用的影响,没有发现DMTI或dHβE抑制烟碱电流的作用随钳制电压改变而改变,即两者的作用都是非电压依赖性的,表明DMTI和dHβE都不是离子通道阻断剂.结论由于烟碱受体是变构蛋白,变构调节剂能加速受体失敏,DMTI的抑制作用符合变构调节剂的作用特点,并且作用位点不在烟碱受体离子通道,而dHβE不是变构调节剂.
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大鼠肺内动脉平滑肌细胞钾通道的研究
目的研究大鼠肺内动脉平滑肌细胞钾电流.方法用急性酶解分离法得到单个大鼠肺内动脉平滑肌细胞,采用膜片钳全细胞记录方式研究钾通道特性.结果将平滑肌细胞钳制在-70 mV,给予-70～50 mV的斜坡刺激,时间为600 ms.可引出一随电压逐渐增大的电流,在+50 mV时其值为359±31 pA.细胞内用CsCl取代KCl后,该电流几乎完全消失;细胞外用无钙台氏液灌流,电极内液用高浓度的EGTA时,电流可被抑制50%±1%;细胞外给予特异性钙激活钾通道阻断剂TEA和延迟整流钾通道阻断剂4-AP均可使该电流明显下降.结论大鼠肺内动脉平滑肌细胞的钾电流主要由钙激活钾电流和延迟整流钾电流组成.
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氟西汀对hERG钾通道的阻断作用及佛波酯的抑制作用
目的：探讨氟西汀对hERG( ether-a-go-go-related gene)钾通道的作用及蛋白激酶C( PKC)激动剂佛波酯( PMA )对氟西汀作用的影响。方法采用全细胞膜片钳技术记录氟西汀0.01,0.1,1和10μmol·L－1处理后稳定表达hERG钾通道的HEK293细胞( hERG-HEK293稳态细胞)上hERG钾通道电流(IKr)的变化,研究氟西汀对IKr作用的浓度依赖性和电压依赖性,并观察氟西汀1μmol·L－1处理后hERG钾通道激活、失活和复活动力学的变化。在此基础上,观察PMA 1μmol·L－1对氟西汀1μmol·L－1作用IKr后的影响。结果氟西汀0.01,0.1,1和10μmol·L－1对hERG-HEK293稳态细胞上IKr具有浓度依赖性和电压依赖性的抑制作用,半数抑制浓度( lC50)约为0.8μmol·L－1,Hill系数约为1.1。氟西汀1μmol·L－1可以减小IKr激活、失活和复活电流,并影响hERG钾通道的激活和复活过程。在氟西汀对IKr电流的抑制作用达到稳态后,PMA 1μmol·L－1可抑制氟西汀对hERG钾通道的阻断作用。结论氟西汀对hERG-HEK293稳态细胞上hERG钾通道具有明显的阻断作用,该作用可被PKC激动剂PMA抑制。
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芎归滴丸对海马神经元钠电流的保护作用
目的观察新药芎归滴丸对海马神经元是否有保护作用.方法用膜片箝全细胞记录方法检测缺氧-复氧前后体外培养的大鼠海马神经元的电压门控性Na+,K+电流.结果急性缺氧-复氧后海马神经元的电压门控性Na+电流幅度显著降低;K+电流幅度无显著改变.芎归滴丸预处理的海马神经元经缺氧-复氧后Na+,K+电流幅度都没有显著降低.结论在不损伤K+电流的缺氧条件下,芎归滴丸预处理能使海马神经元的电压门控性Na+电流免于缺氧损伤.
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大鼠心肌细胞容积敏感性与钾离子通道的关系
目的 观察大鼠心肌细胞调节性容积减小(regulatory volume decrease,RVD)过程,研究参与RVD过程的钾离子通道及其亚型.方法 采用膜片钳全细胞记录法,记录急性分离的大鼠心肌细胞在低渗刺激下钾离子电流的变化及特征,分析其所属亚型;用细胞容积测定法观察大鼠心肌细胞RVD的过程.结果 膜片钳全细胞记录法证实,低渗刺激激活了心肌细胞的K+通道电流,该K+通道电流可被CsCl和格列苯脲所阻断.同时钾离子通道阻断剂可明显阻断大鼠心肌细胞的RVD过程.结论 大鼠心肌细胞在低渗溶液作用下具有RVD过程,钾离子通道,尤其ATP敏感性钾离子通道在大鼠心肌细胞RVD过程中可能具有十分重要的作用.
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HEK293细胞内源性电压门控钾离子通道电生理学特性研究
目的探讨人胚胎肾细胞(HEK293细胞)内源性电压门控钾通道的电生理特性,避免HEK293细胞上内源性离子通道对外源性离子通道表达时的干扰.方法利用全细胞膜片钳技术分析了HEK293细胞内源性电压门控钾通道的电生理特性.结果在HEK293细胞上去极化电压从-80 mV开始可触发1个外向电流.在+100 mV时电流为(422.78±68.87)pA,电流密度为(21.91±3.20)pA/pF.钾通道阻断剂四乙胺(tetraethylammonium,TEA)、4-氨基吡啶 (4-aminopyridine,4-AP),在将细胞外液钾浓度由4 mmol/L提高到40 mmol/L时,对外向电流有影响.结论正常培养的HEK293细胞本身有内源性的钾通道.该外向电流可能包括了IK、IK1、IKur和Ito.
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α1-肾上腺素受体通过GABAB受体调控脊髓背角神经元谷氨酸能突触传递
目的 研究下行去甲肾上腺素系统α1-肾上腺素受体通过GABAB受体调控脊髓背角感觉神经元谷氨酸能突触传递的机制.方法 在急性切取的腰段脊髓切片上,利用全细胞膜片钳法记录α1-肾上腺素受体激动剂苯肾上腺素刺激诱发的脊髓背角浅层神经元谷氨酸能兴奋性突触后电流(eEPSCs),给予GABAB受体特异性拮抗剂CGP55845,进一步观察GABAB受体在苯肾上腺素对突触终末eEPSCs调节过程中的作用.结果 苯肾上腺素显著降低初级传入末梢单突触和多突触eEPSCs幅度,在突触后GABAB受体被从胞内阻断的条件下,再灌流CGP55845,阻断谷氨酸能突触前GABAB受体,可部分拮抗苯肾上腺素对刺激引发的EPSCs (eEPSCs)幅度的抑制作用.结论 位于脊髓背角神经元α1-肾上腺素受体,通过GABAB受体抑制初级传入纤维兴奋性谷氨酸能神经冲动的传入,这种突触前对谷氨酸释放的调节可能是下行肾上腺素能系统对伤害性刺激调控的作用机制.
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α1-肾上腺素受体参与调控脊髓背角神经元突触传递的作用机制
目的 研究α1-肾上腺素受体(α1- AR)调控脊髓背角感觉神经元谷氨酸能突触传递的作用机制.方法 在急性切取的腰段脊髓切片上,利用全细胞膜片钳法记录α1- AR激动剂苯肾上腺素对脊髓背角浅层神经元抑制性和兴奋性突触后电流(IPSCs和eEPSCs)的影响.结果 苯肾上腺素对IPSCs频率产生剂量依赖性兴奋作用,此作用可被α1- AR特异性拮抗剂WB4101完全拮抗.苯肾上腺素对eEPSCs振幅的抑制作用可以部分被GABAA受体拮抗剂印防己毒素(picrotoxin,PTX)拮抗.结论 位于脊髓背角神经元的α1-AR,促进初级传入纤维在脊髓背角释放γ-氨基丁酸(GABA),进而主要通过GABAA受体抑制初级传入纤维兴奋性谷氨酸能神经冲动的传入.下行肾上腺素能系统可能通过GABAA受体机制参与突触前对谷氨酸递质释放的调节作用.
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HEK293细胞上表达的人类超极化激活环核苷酸门控钾通道亚型2和亚型4的电生理
目的 将人类超极化激活环核苷酸门控钾通道亚型2(hHCN2)和亚型4(hHCN4)的基因表达于HEK293细胞系上,观察其表达的通道的电生理特点.方法 包含目的 基因hHCN2或hHCN4的cNDA亚克隆到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,穿梭载体和病毒骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌重组,病毒经过包装和扩增后分别转染HEK293细胞.利用全细胞膜片钳技术,记录分别转染了hHCN2和hHCN4的HEK293细胞上的超极化激活钾电流(If).结果 转染hHCN2和hHCN4的HEK293细胞上产生超极化激活的内向电流.两种通道的半数大激活电压分别为-114.8 mV±3.3 mV和-125.9 mV±2.9 mV,反向曲线斜率分别为11.1 mV±1.2 mV和13.7 mV±1.3 mV.两者的激活动力学明显不同,刺激电压为-110 mV时,通道的激活时间常数分别为0.99 s±0.21 s和8.47 s±2.85 s.两种通道对钠离子和钾离子的相对通透性分别为0.40和0.34.两种电流均可被2mmol/L的氯化铯(CsCl)阻断.结论 目的 基因hHCN2和hHCN4在HEK293细胞上成功表达,形成的两种通道具有明显不同的激活动力学.
关键词： 超极化激活环核苷酸门控钾通道 人类 全细胞记录 -
在体大鼠膜片钳全细胞记录技术初探
目的:建立在体大鼠膜片钳全细胞记录方法.方法:固定麻醉大鼠后对其顶叶皮层锥体神经元行全细胞记录.结果:成功记录到顶叶内锥体层神经元电压门控性钠离子通道电流及自发突触活动电流.结论:初步建立了在体大鼠膜片钳全细胞记录方法,但对记录的稳定性仍有待于进一步提高.
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可溶性Aβ25-35对大鼠海马脑片CA3区神经元延迟整流钾电流的影响
目的:观察可溶性β淀粉样蛋白(25-35)(Aβ25-35)对大鼠海马脑片CA3区神经元延迟整流钾电流(Ik)的影响,探讨可溶性Aβ25-35的神经毒性作用机制.方法:采用膜片钳全细胞记录技术观察可溶性Aβ25-35对大鼠海马脑片CA3区神经元Ik的影响.结果:可溶性Aβ25～35对大鼠海马脑片CA3区神经元Ik有明显抑制作用,且呈时间和电压依赖性.可溶性Aβ25-35使Ik激活曲线左移,加入可溶性Aβ25-35前后Ik半数激活电压分别为(5.88±0.67)mV和(-2.81±0.76)mV(P<0.05),但其斜率因子无显著改变.结论:可溶性Aβ25-35对大鼠海马脑片CA3区神经元Ik的抑制作用可能是其产生神经毒性作用的机制之一.
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大鼠海马CAⅠ区锥体细胞的急性分离及全细胞记录方法
目的 寻求一种适用于膜片钳技术(PCT)的大鼠海马CAⅠ区锥体细胞的急性分离及全细胞记录方法.方法 采用酶加机械分离的方法制备10～16 d鼠龄的海马CAⅠ区锥体神经元.其电生理学特性测定用全细胞PCT.结果 所分离的85%神经元不仅形态学特征保存完好,而且保存了主要的离子通道活性.结论 成功建立了一种简单、快速、可靠的适用于PCT的大鼠皮层神经元急性分离方法.
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灯盏花素对豚鼠心室肌细胞ICa的影响
目的 观察灯盏花素对豚鼠心室肌单细胞钙离子电流(Ica)的影响.方法 采用全细胞膜片钳制技术.结果 灯盏花素能使豚鼠心室肌细胞Ica减小,连续刺激后,对Ica的抑制作用加强,与给药前比较,差异显著(P＜0.01);此作用具有明显的电压依赖性,在峰电流电压下作用明显,而对其反转电位无明显影响;灯盏花素对Ica的作用随质量浓度升高而加强,在指令电压0mV时,5、10和20mg·L-1灯盏花素使Ica分别减小5.4%、22.9%和45.0%(P＜0.01),且可以恢复;在不同的刺激频率下,灯盏花素均可使Ica减小,尤其对高频率刺激细胞产生的Ica作用更明显(P＜0.05).结论 灯盏花素能抑制豚鼠心室肌细胞的Ca2+内流,此作用具有电压依赖性、质量浓度依赖性、药物使用-刺激频率依赖性和可恢复性.
关键词： 灯盏花素 钙离子电流(ICa) 膜片钳制技术 全细胞记录 -
豚鼠心室肌细胞的分离及其基本电生理特性的观察
目的 分离豚鼠单个心室肌细胞,并观察其基本电生理特性.方法 Langendorff灌流,胶原酶法分离心室肌细胞;应用膜片钳全细胞模式记录心室肌细胞的动作电位和L型钙通道电流.结果 酶法分离得到存活杆状细胞达50%以上.全细胞电流钳模式下记录,细胞静息电位为(-69.9±3.4)mV,复位到95%时的动作电位时程(APD95)为(313.1±38.9)ms.全细胞电压钳模式下记录到典型L型钙通道电流.结论 该方法能够简单有效地获得性能稳定的心室肌细胞,尤其适用于膜片钳心电生理学的研究.
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Mg2+对神经元保护机制的研究-Mg2+对培养的大鼠海马神经元GABAA受体介导电流的影响
目的研究镁离子(Mg2+)对神经元保护的机制.方法采用全细胞膜片钳技术,研究Mg2+对培养的大鼠海马神经元GABAA受体介导电流的作用.结果 (1)在钳制电压为-40 mV时,GABA可通过GABAA受体介导产生内向电流;(2)当GABA和Mg2+同时作用时,该电流峰值增高;(3)在Mg2+存在的情况下,GABA的浓度-效应曲线平行左移.结论 Mg2+通过正性变构调节机制影响GABAA受体的功能,达到保护神经元的作用.
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膜片钳新进展及在体膜片钳技术
自从1976年德国生理学家Neher和Sakmann领导的研究小组首次建立起一种叫做膜片钳的新记录方法,在现代细胞生理学及细胞生物物理学界引起了一次新技术革命.20世纪90年代一些实验室在借鉴脑片膜片钳的基础上,在活体动物上进行全细胞膜片钳记录;近年来Margrie等为改进"盲法"之不足引用双光子显微镜,结合荧光染色标记技术,进行双光子定标膜片钳技术(Two-Photon Targeted Patching)[1,6].
