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内质网应激联合线粒体在高血糖加重脑缺血再灌注损伤中作用的体外实验研究
目的:通过体外实验探讨内质网应激联合线粒体在高血糖加重脑缺血再灌注损伤中的作用.方法:采用腹腔注射链脲佐菌素(STZ)的方法构建高血糖大鼠模型,进而通过体外海马脑片缺氧缺糖/复氧复糖培养建立脑缺血再灌注模型.实验分为正常对照组(NC)、正常血糖缺氧缺糖/复氧复糖组(N-OGD/R)和高血糖缺氧缺糖/复氧复糖组(H-OGD/R).采用免疫组化法检测脑片中胱天蛋白酶(Caspase)-3、细胞色素C(Cyt C)蛋白表达,ELISA法检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量,以及荧光定量RT-PCR技术检测葡萄糖调节蛋白(GRP)78mRNA表达量.结果:与N-OGD/R组相比,H-OGD/R组Caspase-3和Cyt C的平均光密度(OD)明显升高(Caspase-3:0.348±0.004,F13.398,P﹤0.01;Cyt C:0.328±0.005,F15.444,P﹤0.01),LDH含量明显增加(6.323±0.499,F45.846,P﹤0.01),GRP78mRNA的表达量明显升高(2.350±0.522,F13.347,P﹤0.01).结论:高血糖可加重大鼠脑缺血再灌注损伤,内质网应激(ERS)联合线粒体途径可能协同参与了大鼠脑缺血再灌注损伤过程.
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调心方对β-淀粉样蛋白和皮质酮抑制大鼠海马脑片CA1区LTP的作用研究
采用细胞外微电极记录技术,观察调心方对β-淀粉样蛋白和皮质酮抑制大鼠海马脑片LTP作用的影响.结果发现,在正常情况下,海马脑片LTP诱发成功率约为60%,施以高频串刺激后PS幅度显著增高,PS潜伏期明显缩短.预先用β-淀粉样蛋白(0.2μM)或皮质酮(2μM)孵育海马脑片对正常PS的形状、幅度无明显影响;但两者均可显著抑制脑片LTP的诱发率,并且PS增幅程度与对照组相比也显著降低,提示两者对海马LTP的诱生具有抑制作用.若用调心方(7.45mg/m1)与β-淀粉样蛋白或皮质酮共同孵育脑片后,其LTP诱发率呈现上升趋势,同时PS增幅也显著提高.以上结果表明,调心方对β-淀粉样蛋白或皮质酮对海马LTP的抑制效应具有明显的对抗作用,这可能是其改善AD患者认知功能障碍的作用机制之一.
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调心方活性部位对大鼠海马脑片CA1区诱发LTP的影响
目的:研究调心方活性部位A对大鼠海马脑片诱发长时程增强(LTP)效应的影响.方法:采用细胞外微电极记录技术,记录大鼠海马脑片CA1区诱发群峰电位(PS),然后施以100Hz,100串的强直刺激诱发LTP.结果:调心方活性部位A对大鼠海马脑片正常PS的形状、幅度无影响,提示并不影响海马的基础突触传递.给予强直刺激后,高浓度活性部位A可以明显增大LTP幅度,提示具有促进和维持LTP的作用.结论:调心方活性部位A可能是调心方促进和维持大鼠海马脑片诱发LTP的有效成分之一,对LTP的促进作用也是调心方活性部位A益智作用的机制之一.
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调心方活性部位对β淀粉样蛋白抑制大鼠海马脑片CA1区诱发长时程增强的作用研究
目的研究调心方活性部位A(active fraction of Tiaoxin recipe, TXR-A)对β-淀粉样蛋白(beta arnyloid protein,β-AP)抑制大鼠海马脑片长时程增强(long-term potentiation, LTP)效应的影响.方法采用细胞外微电极记录技术,记录大鼠海马脑片CA1区诱发群峰电位(population spike, PS),然后施以100Hz,100串的强直刺激诱发LTP.结果与正常脑脊液组比较,β-AP(0.2 μmol/L)孵育海马脑片＞1.5 h,强直刺激后PS增幅程度显著降低,提示β-AP对海马LTP具有抑制作用;如用β-AP加TXR-A孵育脑片＞1.5 h,则强直刺激后高浓度TXR-A组的PS平均幅度显著提高,且作用优于调心方,提示TXR-A可以增强LTP幅度.结论 TXR-A可能是发挥调心方改善β-AP抑制大鼠海马CA1区诱发LTP作用的主要成分之一,拮抗β-AP对LTP的抑制可能是其益智机制之一.
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调心方对大鼠海马脑片长时程增强效应的影响
目的:观察调心方对大鼠海马脑片长时程增强(LTP)效应的影响.方法:采用细胞外微电极技术,记录大鼠海马脑片CA1区细胞外群峰电位(PS),然后施以100Hz、100串的强直刺激,诱发LTP产生.结果:在正常情况下,大鼠海马脑片LTP的诱发成功率约为60%,施以高频串刺激后PS幅度显著增高,PS潜伏期明显缩短.用调心方(7.45mg/mD预先孵育海马脑片对正常PS的形状、幅度均无明显影响,提示其并不影响海马脑片的基础突触传递;但施以高频刺激后脑片LTP的诱发率呈现升高趋势,同时其PS增幅与正常对照组比较也显著提高.结论:调心方可提高大鼠海马脑片LTP的诱发率及增幅,这可能是其改善海马学习记忆功能的作用机制之一.
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HIV-1 gp120对鼠海马长时程增强效应的影响
为了探讨人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)的包膜糖蛋白gp120对鼠海马脑片CA1区的突触传递及可塑性的影响,应用离体脑片记录技术,记录大鼠海马CA1区的兴奋性突触后电位(excitatory postsynaptic potential,EPSP),研究了gp120对高频电刺激Schaffer侧支引起的鼠长时程增强效应(long-term potentiation,LTP)的影响.结果发现:gp120对大鼠海马CA1区LTP产生抑制作用,对其基础EPSP没有影响,而且这种抑制效应随着gp120浓度增大而增强,即具有剂量依赖性.PKA/PKC蛋白激酶抑制剂H7可以反转这种抑制效应.提示:gp120可能是通过抑制海马CA1区的LTP而参与艾滋病相关性痴呆(HIV-1 associated dementia,HAD)的形成.
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HIV-1包膜糖蛋白gp120对大鼠海马脑片电生理特性的影响
目的探讨人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)的包膜糖蛋白gp120对大鼠海马脑片CA1区神经元电生理特性及突触传递的影响.方法用盲法全细胞记录技术,观察gp120对大鼠海马脑片CA1区神经元电生理特性及对高频电刺激Schaffer侧支引起的鼠海马长时程增强效应(LTP)的影响.结果①在电流钳,gp120可使终末去极化电流激发快速动作电位的数目增加;②在电压钳,gp120对大鼠海马CA1区神经元的全细胞电流无明显作用;③将gp120(100 pmol/L)与海马脑片共孵育1h后,在钳制电压为-60 mV时,发现HFS后海马CA1区的兴奋性突触后电流(EP-SC)显著减小,LTP的强度减少到(108.5±8.0)%(n=11,P＜0.01).结论gp120可使海马神经元的兴奋性增加,并可能通过抑制海马CAi区的LTP诱发参与艾滋病痴呆(HIV-1 associated dementia,HAD)的病理生理过程.
关键词： 人类免疫缺陷病毒Ⅰ型 gp120 兴奋性突触后电流 长时程增强 海马脑片 -
缺血、缺氧对小鼠海马DNA甲基化的影响
目的 建立缺血、缺氧脑片模型,探讨缺血、缺氧对小鼠海马的损伤及其机制.方法 利用C57BL/6J小鼠建立海马脑片缺血、缺氧性脑损伤(HIBD)模型,采用免疫组织化学染色法和Western blotting法分析正常对照组海马脑片与HIBD实验组海马脑片炎症损伤、DNA甲基化相关酶的表达情况.结果 HIBD实验组海马脑片氧化应激、炎症损伤细胞明显多于对照组(P＜0.01),诱发海马应激损伤;同时HIBD实验组海马脑片DNA甲基化水平高于对照组(P＜0.01).结论 脑片缺血、缺氧可促发炎症反应对海马组织造成损伤,DNA甲基化水平升高,提示DNA甲基化可能参与缺血、缺氧组织损伤过程;机制可能是HIBD影响DNA代谢活动,诱导DNA甲基化水平升高,DNA甲基化调控相关基因表达产生氧化应激,促发炎症反应,对海马造成损伤.
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HIV-1包膜糖蛋白V3环对大鼠海马长时程增强效应的影响
目的探讨人免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)的包膜糖蛋白V3环对大鼠海马脑片CA1区的突触传递及可塑性的影响. 方法应用离体脑片记录技术,记录大鼠海马CA1区的场兴奋性突触后电位(field excitatory postsynaptic potentials, f-EPSP),研究了V3环对高频电刺激Schaffer侧支引起的鼠长时程增强效应(long-term potentiation, LTP)的影响. 结果 V3环对高频电刺激(HFS, 100Hz, 1000ms×2, 串间隔20 s, 共2次)Schaffer侧支引起的大鼠海马CA1区LTP产生抑制作用,而对其基础f-EPSP没有影响.用浓度为200pmol/L的V3环灌流脑片,可引起LTP的维持发生抑制.这种抑制作用可被V3环特异抗体V3McAb(40ng/ml)所拮抗. 结论 V3环可能是通过抑制海马CA1区的LTP诱发和维持而参与艾滋病痴呆(HIV-1 associated dementia, HAD)的形成.
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丙泊酚对缺氧无糖损伤大鼠海马脑片的保护作用
目的探讨丙泊酚对缺氧无糖(OGD)损伤脑片的保护作用.方法采用缺氧无糖的人工脑脊液灌流离体大鼠海马脑片模拟缺血损伤,根据给药方式不同分为:OGD前给药组和OGD给药组,均给予1、10和20 μmol·L-1的丙泊酚和脂肪乳(溶剂对照).记录海马脑片顺向群峰电位(OPS)和缺氧损伤电位(HIP)的变化.结果 OGD给药组应用10 μmol·L-1的丙泊酚,与应用脂肪乳相比OPS消失时间推迟(P＜0.05),OPS恢复率升高(P＜0.05),HIP出现时间推迟(P＜0.01),HIP出现率降低(P＜0.05).结论在缺氧过程中应用10 μmol·L-1的丙泊酚对缺氧无糖损伤海马脑片具有保护作用.
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小鼠海马脑片和海马-内嗅皮层联合脑片癫痫样放电特性的比较研究
目的探索离体条件下无镁人工脑脊液（ ACSF ）诱导的成年小鼠海马脑片和海马-内嗅皮层联合脑片的不同癫痫样放电模式。方法分别制备两种脑片模型，使用无镁ACSF诱导脑片产生癫痫样放电，并用多电极阵列记录脑片不同区域神经元的放电情况。在两种脑片模型上诱导出稳定的癫痫样放电后，分析不同类型癫痫样放电模式的时空特性。结果无镁ACSF诱导海马脑片产生间期放电，间期放电频率为（11.6±2.4）次/min，平均放电持续时间为149.0～202.6 ms。无镁ACSF诱导海马-内嗅皮层联合脑片产生间期和发作期放电交替出现的模式，间期放电的频率为（12.9±3.3）次/min，平均放电持续时间为181.3～223.7 ms。发作期放电的频率为（0.26±0.07）次/min，平均放电持续时间为14.3～14.5 s。结论在海马-内嗅皮层联合脑片的网络水平研究癫痫问题，不仅能诱导产生稳定的间期放电，而且可以观察到发作期放电，因此海马-内嗅皮层联合脑片是一种研究癫痫的理想模型。
关键词： 癫痫 多电极阵列 海马脑片 海马-内嗅皮层联合脑片 -
谷氨酸增加大鼠海马脑片可溶性淀粉样前体蛋白的释放
目的观察兴奋性神经递质谷氨酸对于可溶性淀粉样前体蛋白(sAPP)释放的影响.方法雄性SD大鼠断头取海马后,于0～4℃Krebs-Ringer液中快速振动切片,37℃预孵育后,置含谷氨酸或不含谷氨酸Krebs-Ringer液(对照)中孵育,于15 000g离心,取上清,用二辛可宁酸法测定总蛋白含量.以Western blot法测定,释放入孵育液中的sAPP.结果正常孵育的海马脑片能够分泌基础量的sAPP,谷氨酸刺激能够导致海马脑片释放sAPP增加,但没导致新蛋白的产生.结论谷氨酸在10-15～10-3mol*L-1浓度范围内,均能导致海马脑片分泌sAPP增加.
关键词： 谷氨酸 可溶性淀粉样前体蛋白 阿尔茨海默病 海马脑片 Western blot -
谷氨酸对皮质与海马脑片sAPP释放促进作用的差异
目的观察谷氨酸对皮质与海马脑片可溶性淀粉样前体蛋白(sAPP)释放促进作用的差异.方法♂SD大鼠断头取皮质与海马后于0～4℃Krebs-Ringer液中快速振动切片,切片于37℃预孵育后置含50μmol·L-1的谷氨酸或不含谷氨酸Krebs-Ringer液(对照)中孵育后于15 000g离心取上清,应用二辛可宁酸法测定上清总蛋白含量;释放入孵育液中的sAPP以Western blot方法测定.结果 50μmol·L-1的谷氨酸作用于皮质与海马脑片后,其释放的sAPP均在97～116KD 之间,sAPP含量都非常低.而皮质中sAPP含量相对较高,且50μmol·L-1的谷氨酸对于其影响较影响海马大.结论 50μmol·L-1的谷氨酸促进sAPP的释放作用对皮质脑片的影响较其对海马脑片的影响显著.
关键词： 谷氨酸 可溶性淀粉样前体蛋白 皮质脑片 海马脑片 Western blot -
依达拉奉、米诺环素及ONO-1078对缺氧缺糖诱导大鼠海马脑片电生理改变的作用
目的建立离体海马脑片缺氧缺糖(OGD)电生理变化模型,观察依达拉奉、米诺环素和ONO-1078 {pranlukast,4-氧-8-[对-(4-苯丁氧基)苯甲酰氨基]-2-(5-四氮基)-4H-1-苯并吡喃半水化合物}的神经保护作用.方法大鼠海马脑片以无氧无糖处理,记录脑片群峰电位(PS),部分实验以TTC染色观察脑片活性.结果 OGD处理4 min为佳损伤条件,1 h后可恢复至基础水平的(29±6)%.自由基清除剂依达拉奉(1和10 μmol*L-1)明显增强PS波的恢复;抗炎药米诺环素(10 μmol*L-1)和白三烯受体拮抗剂ONO-1078(1 μmol*L-1)无显著恢复作用;阳性对照药氯胺酮也浓度依赖性促进PS恢复.结论 4 min OGD为离体海马脑片缺血电生理变化的可行模型;依达拉奉对OGD脑片损伤有浓度依赖性保护作用,而米诺环素和ONO-1078未显示保护作用.
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H2受体介导组胺对大鼠海马缺氧缺糖诱导细胞水肿及活性降低的保护作用
目的探讨组胺对海马脑片缺血诱导细胞水肿及活性降低的作用,以及与受体亚型的关系.方法大鼠海马脑片以缺氧缺糖(OGD)诱导缺血损伤后,实时检测CA1区透光度变化评价细胞水肿;并测定2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)产物甲(月替),评价脑片活性.观察不同浓度组胺的作用,以及组胺受体拮抗剂对组胺作用的影响.结果组胺(0.01～10 μmol·L-1)明显抑制OGD诱导的海马脑片透光度增加,并提高脑片活性.H1受体拮抗剂苯海拉明(0.1～10 μmol·L-1)不影响组胺的作用,H2受体拮抗剂西咪替丁(0.1～10 μmol·L-1)则部分拮抗组胺的保护作用.结论组胺对大鼠海马脑片缺血诱导细胞水肿及活性降低有保护作用,该作用与H2受体有关.
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二氢石蒜碱对离体海马脑片缺氧/复氧损伤的保护作用及与NO的关系
目的:观察二氢石蒜碱对大鼠离体海马脑片脑缺氧/复氧损伤的保护作用以及与NO的关系.方法:采用大鼠离体海马脑片缺氧/复氧(H/R)损伤模型,记录群峰电位(PS)恢复幅度和恢复率及检测乳酸脱氢酶(LDH)的活性和NO含量变化.结果:与H/R模型组比较,二氢石蒜碱1×10-6和1×10-5 mol·L-1浓度显著增加H/R损伤后PS恢复幅度[(94.3±49.1)%,(71.0±41.4)%vs(14.2±34.7)%,P＜0.05]和恢复率(P＜0.05);降低孵育液中LDH的活性[(250.57±12.57),(200.74±23.71)vs(300.57±16.08)U·L-1,P＜0.05～0.01]和NO量[(0.64±0.04),(0.02±0.06)V8(4.62±0.29)mmol·L-1,P＜0.01].结论:二氢石蒜碱对大鼠离体海马脑片脑缺氧/复氧损伤有保护作用,与降低NO产生有关.
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功能性多神经元钙成像技术在海马神经元动作电位观察中的应用
目的:观察海马脑片中锥体细胞层群体神经元的电活动.方法:取出生后7d的Sprague Dawley大鼠全脑,无菌条件下水平方向切片,转至6孔板中培养；另取出生后3～5周的C57-BL/6J小鼠全脑,无菌条件下水平方向切片,转至37℃氧饱和的人工脑脊液中稳定至少60 min备用.大鼠培养脑片及小鼠急性脑片负载钙离子荧光指示剂,采用功能性多神经元钙成像技术检测海马锥体细胞层中大规模神经元与动作电位相关的钙瞬变.结果:大鼠培养脑片及小鼠急性脑片中记录到大量单个神经元的与动作电位相关的钙瞬变.结论:功能性多神经元钙成像技术是揭示海马神经网络活动及中枢神经系统有关创新药物评价的全新且有效的研究方法.
关键词： 海马脑片 钙瞬变 功能性多神经元钙成像 神经网络 -
新生大鼠海马脑片培养方法
目的建立新生大鼠海马脑片体外长期培养方法.方法取出生后10 d的新生大鼠海马,切成300 μm厚的脑片,转至带有微孔膜插件的培养皿中进行培养.培养期间进行形态学观察,并通过MTT法鉴定组织活力,免疫组化法观察胶质细胞对损伤的反应,电生理反应以检测神经细胞功能.结果培养海马脑片逐渐变薄,5 d后结构清晰,细胞形态完整;MTT法显示培养40 d内的海马组织均能保持高摄入MTT能力;在Schaffer侧枝给予单脉冲刺激,于CA1区能接收到完整的群峰电位;谷氨酸导致胶质细胞抗胶质纤维酸性蛋白高表达.结论本方法培养40 d的海马脑片具有正常的活力和功能.
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氯化钴预处理对缺氧预适应小鼠缺氧耐受的影响
目的观察氯化钴对缺氧预适应小鼠缺氧耐受的影响.方法用氯化钴(CoCl2)处理小鼠,观察小鼠在重复缺氧中缺氧耐受时间的变化及其离体海马脑片缺氧时群峰电位(PS)消失时间的变化.结果 CoCl2预处理小鼠的缺氧耐受时间不随缺氧次数的增加而增加,缺氧耐受性显著增高,CoCl2预处理小鼠离体海马脑片缺氧时群峰电位消失的时间比对照组明显延长,但明显低于预适应组.结论小鼠CoCl2预处理激活缺氧诱导因子-1(HIF-1),可对脑产生保护作用,但其机制可能不同于由急性重复缺氧获得的缺氧耐受机制.
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调心方活性部位对皮质酮抑制大鼠海马脑片CA1区诱发长时程增强的作用
目的以长时程增强(LTP)为指标,研究调心方(TXR)活性部位A(TXR-A)对皮质酮抑制大鼠海马脑片LTP作用的影响.方法将脑片分为正常对照组、皮质酮组、皮质酮+TXR组、皮质酮+不同浓度TXR-A组,记录前脑片用含药人工脑脊液(ACSF)孵育1 h,记录时用相同ACSF灌流.采用细胞外微电极记录技术,记录大鼠海马脑片CA1区诱发群峰电位(PS),然后施以100 Hz、100个脉冲的强直刺激HFS诱发LTP.结果与正常脑脊液组相比,皮质酮(2 μmol/L)孵育海马脑片1.5 h以上,强直刺激后PS增幅显著降低,提示皮质酮对海马LTP具有抑制作用.用不同浓度的TXR-A+皮质酮孵育脑片1.5 h以上,强直刺激后高浓度TXR-A组的PS平均幅度显著提高,且作用优于TXR.提示TXR-A可以对抗皮质酮对LTP的抑制.结论该活性部位可能是发挥TXR改善皮质酮抑制大鼠海马CA1区诱发LTP作用的主要成分之一,拮抗皮质酮对LTP的抑制是其益智作用的机制之一.
关键词： 调心方 长时程增强(LTP) 皮质酮 海马脑片
