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HIV相关神经系统病变的研究进展
研究表明HIV(人类免疫缺陷病毒)感染机体后不仅破坏患者免疫系统,还可造成一系列神经系统病变(包括神经损伤、认知缺损、行为障碍等),从而引发多种神经变性疾病.HIV相关神经系统病变发生机制复杂,已有研究发现HIV具有神经毒性的蛋白产物、感染细胞产物及机体免疫反应均能对患者神经系统造成损伤,影响其学习与记忆功能.HIV相关神经系统病变种类繁多,目前相应治疗方法包括传统的高效抗逆转录病毒治疗、联合抗逆转录病毒疗法及新兴的基因治疗方法.
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HIV-1 gp120对鼠海马长时程增强效应的影响
为了探讨人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)的包膜糖蛋白gp120对鼠海马脑片CA1区的突触传递及可塑性的影响,应用离体脑片记录技术,记录大鼠海马CA1区的兴奋性突触后电位(excitatory postsynaptic potential,EPSP),研究了gp120对高频电刺激Schaffer侧支引起的鼠长时程增强效应(long-term potentiation,LTP)的影响.结果发现:gp120对大鼠海马CA1区LTP产生抑制作用,对其基础EPSP没有影响,而且这种抑制效应随着gp120浓度增大而增强,即具有剂量依赖性.PKA/PKC蛋白激酶抑制剂H7可以反转这种抑制效应.提示:gp120可能是通过抑制海马CA1区的LTP而参与艾滋病相关性痴呆(HIV-1 associated dementia,HAD)的形成.
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HIV-1包膜糖蛋白gp120对大鼠海马脑片电生理特性的影响
目的探讨人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)的包膜糖蛋白gp120对大鼠海马脑片CA1区神经元电生理特性及突触传递的影响.方法用盲法全细胞记录技术,观察gp120对大鼠海马脑片CA1区神经元电生理特性及对高频电刺激Schaffer侧支引起的鼠海马长时程增强效应(LTP)的影响.结果①在电流钳,gp120可使终末去极化电流激发快速动作电位的数目增加;②在电压钳,gp120对大鼠海马CA1区神经元的全细胞电流无明显作用;③将gp120(100 pmol/L)与海马脑片共孵育1h后,在钳制电压为-60 mV时,发现HFS后海马CA1区的兴奋性突触后电流(EP-SC)显著减小,LTP的强度减少到(108.5±8.0)%(n=11,P＜0.01).结论gp120可使海马神经元的兴奋性增加,并可能通过抑制海马CAi区的LTP诱发参与艾滋病痴呆(HIV-1 associated dementia,HAD)的病理生理过程.
关键词： 人类免疫缺陷病毒Ⅰ型 gp120 兴奋性突触后电流 长时程增强 海马脑片 -
利用磁珠分选和单细胞RT-PCR筛选HIV-1 Env特异性单克隆抗体的研究
目的 建立一种简单易行的从HIV-1感染者中筛选包膜糖蛋白(envelope glycoprotein,Env)特异性单克隆抗体的方法.方法 采集HIV-1感染者抗凝全血,分离外周血单个核细胞,利用生物素标记的HIV Gp120抗原与B细胞膜上的IgG特异性结合,然后用链霉亲和素标记的磁珠分选出能够产生Env特异性抗体的记忆性B细胞.用单细胞RT-PCR法从记忆性B细胞中扩增抗体的重链可变区基因与轻链可变区的基因并克隆到表达载体中,将携带重链基因的质粒与携带轻链基因的质粒共转染293T细胞,获得HIV-1特异性人单克隆抗体,并进行抗体结合活性的鉴定.结果 从1例我国HIV-1感染者记忆性B细胞中筛选出3株对HIV-1 Env抗原有结合活性的单克隆抗体.结论 利用生物素标记抗原与记忆性B细胞特异结合,并用亲和素标记的磁珠对细胞进行分选,结合单细胞RT-PCR技术可以成功筛选出抗原特异性的单克隆抗体.
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筛选CD4结合蛋白的酵母双杂交饵载体构建及功能鉴定
目的构建用于筛选人CD4结合蛋白的酵母双杂交饵载体,并对其功能进行鉴定.方法RT-PCR扩增编码CD4的cDNA.构建双杂交饵载体pAS2-1-CD4,并转化入宿主酵母菌Y190中.通过测定报告基因--β-半乳糖苷酶的活性,判断饵载体自激活报告基因能力.将CD4的已知HIV配体gp120构建入猎物载体pACT2,转入重组菌Y190/pAS2-1-CD4.检测其报告基因活性,鉴定pAS2-1-CD4是否具有筛选CD4结合蛋白的能力.结果DNA序列测定证实,获得了编码CD4蛋白的cDNA序列.β-半乳糖苷酶活性测定表明,pAS2-1-CD4单独无自激活能力,与猎物载体pACT2-gp120能够发生相互作用,激活报告基因表达.结论构建了酵母双杂交饵载体pAS2-1-CD4,为筛选CD4结合蛋白(尤其是筛选病毒编码的CD4配体),提供了技术平台.
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HIV-1糖蛋白gp120在昆虫细胞中的表达、纯化、性质鉴定以及免疫原性分析
目的 利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统建立高效分泌表达人类免疫缺陷病毒(HIV)-1 Env gp120糖蛋白的方法,并对其理化性质及免疫原特性进行分析.方法 选择B亚型HIV-1 NL4-3 gp120进行蛋白克隆设计,将目的蛋白基因序列克隆到杆状病毒转移载体pAcgp67B中pH启动子的下游,构建成重组转移载体pAc-gp120,利用同源重组的方式在宿主细胞内获得重组杆状病毒,并在High FiveTM昆虫细胞中表达gp120蛋白.之后使用酶联免疫吸附试验、分析超离和分子排阻色谱进行理化性质分析,并通过小鼠免疫实验分析其免疫原性.结果 建立昆虫细胞表达系统制备和纯化重组HIV-1 gp120蛋白的方法,终获得纯度约90％的gp120蛋白,多批次纯化后鉴定产量约为13 mg/L;酶联免疫吸附测定、分析超离和分子排阻色谱性质分析试验显示,重组HIV gp120蛋白在溶液有良好的抗原性并且在溶液中较为均一;通过弗氏佐剂与目的蛋白混合免疫BALB/c小鼠,免疫血清对NL4-3病毒具有一定程度中和活性,表明gp120蛋白能有效刺激机体产生免疫应答.结论成功建立了简便、可放大的HIV gp120蛋白表达和纯化方法,获得较为均一的、免疫原性良好的gp120抗原,为进一步开展HIV疫苗研究工作奠定了基础.
关键词： 人类免疫缺陷病毒1型 昆虫细胞表达系统 包膜糖蛋白 gp120 免疫应答 -
5株不同亚型HIV-1毒株gp120序列特征分析及其蛋白的表达
目的 分析我国HIV-1主要亚型毒株的gp120区域的序列特征,并表达出gp120糖基化蛋白,为研究gp120的致病机制和设计疫苗奠定基础.方法 利用巢式PCR从来自于不同省份的5名HIV-1感染者外周血单个核细胞DNA中扩增全长gp120基因并测序,对序列特征进行分析,并将获得的gp120基因克隆入真核表达载体,体外表达获得gp120糖基化蛋白.结果 序列分析显示,此5条gp120序列分属HIV-1 Thai-B、BC重组和AE重组哑型,虽然亚型不同,但这些gp120序列在相同的位置都存在着一些保守的糖基化位点,且都具备相同的Furin蛋白酶第一切割位点,与参考序列比较发现,不同的HIV亚型序列中,除V3序列长度较为保守外,V1、V2、V4、V5各区域都有不同程度的缺失现象,与BC重组和AE重组亚型相比,Thai-B亚型V3的顶端环呈现出多种组合.终将这5条gpl20序列都克隆人真核表达载体并表达出糖基化的gp120蛋白.结论 在设计疫苗和检测试剂时应考虑到膜区的高变性,gp120糖蛋白的体外表达有利于进一步开展针对我国主要HIV流行毒株膜蛋白致病机制和疫苗学的研究.
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共表达中国株HIV-1 gp120与hIL-6的重组鸡痘病毒研究
目的构建共表达中国株HIV-1 gp120与人白细胞介素6(IL-6)的重组鸡痘病毒. 方法分别将HIV-1 gp120基因和hIL-6基因插入到鸡痘病毒表达载体pUTAL复合启动子ATI-P7.5和P7.5串联启动子下游,构建重组鸡痘病毒表达质粒pUTA-GP-IL6.利用脂质体法将重组质粒和鸡痘病毒282E4株共转染鸡胚成纤维细胞.经BUdR加压筛选3次后,重组病毒分别用PCR、间接免疫荧光试验和Western blot进行鉴定,并进行小鼠免疫研究. 结果重组病毒基因组中可扩增出1.4kb大小片段,重组病毒感染细胞表面有绿色荧光物质,表达产物的Western blot分析表明重组病毒可表达gp120和hIL-6蛋白.重组病毒可刺激小鼠产生特异性体液免疫应答. 结论成功构建了共表达中国株HIV-1 gp120与hIL-6的重组鸡痘病毒,为研制HIV-1基因工程活载体疫苗提供有益的资料.
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人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)糖蛋白gp120部分糖基化位点突变对其抗原性影响
目的 研究HIV-1包膜糖蛋白gp120特定糖基化位点突变后对gp120抗原性的影响,并推测糖基化位点突变对结构的影响.方法 采用连接PCR方法,将获得的野生型gp120中选定N糖基化位点的Asn定点突变为Cln,使该位点去糖基化,构建DNA疫苗,免疫小鼠,ELISA检测鼠血清中的抗体,进行统计学分析,推测糖基化位点突变对gp120抗原性和结构的影响.结果 2组糖基化位点突变的gp120诱发非V3特异性抗体的能力较之野生型gp120有明显提高,但诱发V3特异性抗体能力没有显著提高,7个位点突变的gp120诱发V3特异性抗体能力有很大降低.结论 gp120部分糖基化位点的突变在一定程度上能提高或改变gp120的抗原性,这可能由突变导致的构象变化和/或糖基化寡糖链移除使原来被遮盖的抗原表位暴露引起.
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HIV感染合并鼻窦炎患者鼻腔黏膜病毒抗原表达的研究
目的 了解HIV感染合并鼻窦炎患者鼻黏膜病毒存储及免疫状态. 方法 采集9例非HIV感染合并鼻窦炎和11例HIV感染合并鼻窦炎患者外周血和鼻黏膜标本,采集患者外周血和鼻黏膜组织,外周血采用流式细胞仪进行CD4计数和单核细胞比例分析,血浆采用RT-PCR定量法进行病毒载量检测.对鼻黏膜石蜡切片采用HE染色分析病理情况和免疫组织化学染色分析gp120和p24表达水平.结果 HIV感染合并鼻窦炎患者HE染色结果表现为呼吸道黏膜呈慢性炎,间质明显水肿伴大量炎性细胞侵润,嗜酸性粒细胞多见.与非HIV感染合并鼻窦炎患者相比,免疫组织化学结果表明,HIV感染者合并鼻窦炎患者鼻黏膜gp120少量表达,p24未见明显表达,外周血具有调节功能的单核细胞亚群比例显著升高.结论 HIV感染合并鼻窦炎患者鼻黏膜局部组织可能含少量HIV病毒,外周单核细胞比例显著增高,这些HIV病毒存储细胞可能是HIV感染者鼻黏膜损伤和机会性感染的机制所在.
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HIV-1gp120真核表达载体的构建及表达
目的 模拟HIV-1包膜糖蛋白天然构象,在真核细胞中高效表达三聚体包膜糖蛋白.方法 本研究以原代HIV-1分离株06044包膜为研究对象,将不含信号肽序列的包膜gp120基因克隆至含有人类组织型纤溶酶原激活物(tPA)的信号肽序列的真核表达载体上,构建单体形式gp120蛋白表达载体;或将其克隆至含有tPA信号肽序列和蛋白质三聚化模序MTQ的真核细胞表达载体上,构建三聚体形式gp120蛋白表达载体.gp120重组表达载体体外瞬时转染293T细胞,western blot检测表达情况.结果 获得gp120蛋白单体和三聚体的真核细胞表达载体pcT.06044 gp120 m/co和pcT.06044 gp120T/co;重组质粒瞬时转染293T细胞后western blot分析,在变性条件下,两组细胞培养上清均检测到单体形式gp120蛋白;非还原条件下,pcT.06044 gp120T/co转染组的细胞培养上清中检测到三聚体、二聚体和单体三种形式gp120蛋白,其百分比分别为76%、14%和10%.结论 本研究成功构建了HIV-1原代06044株包膜gp120单体和三聚体表达载体,并在哺乳细胞中成功表达了gp120单体和三聚体蛋白.
关键词： Ⅰ型人类免疫缺陷病毒(HIV-1) gp120 三聚体 真核细胞 表达 -
肠道嗜性和神经嗜性 SIV 毒株 Gp120序列变异特点的比对分析
目的：研究SIVmac239在不同中国恒河猴体内由于免疫压力出现的病毒Env区的变异进化情况。比对分析可形成AIDS相关肠病和脑病的SIV病毒其Gp120序列的差异及特点。方法四株SIVmac239感染晚期发病恒河猴PBMC中分离的病毒及两株神经嗜性SIVmac251病毒，通过有限稀释分离培养病毒单克隆，提取病毒RNA后反转录，PCR扩增病毒gp120序列进行系统进化树分析。同时分析两组不同嗜性毒株Gp120氨基酸序列及糖基化位点的变化情况。结果 SIVmac239在四只恒河猴体内发生不同的变异进化。肠道嗜性毒株与神经嗜性毒株氨基酸序列的差异集中在V1和V4区，肠道嗜性毒株在V4区与一个糖基化位点的增加，而神经嗜性毒株的糖基化位点的变化都发生在保守区C1、C2和C3。结论 SIV肠道嗜性和神经嗜性的增强分别与包膜蛋白Gp120上V4区糖基化位点的增加和C1区的糖基化位点缺失相关，两种嗜性的差异并不表现在与嗜性形成有紧密联系的V3区上。
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树突细胞特异性非整合素与人免疫缺陷病毒
树突细胞特异性非整合素(DC-SIGN,dendritic-cell specific ICAM-3 grabbing non-intesrin),又称CD209,是一种主要由树突状细胞(dendritic-cell,DC)汾泌的细胞膜表面分子.DC-SIGN属Ⅱ类C-型凝集素膜受体(CRL)能与细胞间黏附分子(intercelluar adhesion molecule,ICAM)以及病毒、细菌、寄生虫等多种病原结合,如能与人免疫缺陷病毒表面蛋白gp120,并介导病毒感染靶细胞.研究表明DC-SIGN在HIV传播与致病中有重要作用.
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HIV-gp120人源单链可变区抗体筛选与鉴定
目的 通过制备抗人类免疫缺陷病毒(HIV)gp120蛋白人源单链可变区抗体(seFv),探索新型抗人获得性免疫缺陷病毒(HIV)治疗方法.方法 采用噬菌体表面展示技术,将HIV-gp120蛋白固相包被于Nunc板,应用半合成的人源单链可变区抗体文库技术,从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮吸附-洗脱-扩增筛选过程,随机挑选96个克隆,利用酶联免疫吸附法(ELISA)、交叉反应和竞争抑制实验,进行免疫学检测和鉴定,获得与HIV-gp120蛋白结合活性较强的scFv阳性克隆,并对HIV-gp120蛋白ScFv的编码基因进行序列测定分析.结果 经过筛选96个克隆中有39株克隆ELISA的吸光度(A450 nm)值较高,将这些噬菌体上清与牛血清白蛋白(BSA)进行交叉反应,确定其中有7株交叉反应较弱,结合3次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果,后确定1株阳性克隆.提取质粒,进行DNA序列测定,DNA为699 bp.结论 用噬菌体抗体库技术成功地获得抗HIV-gp120蛋白的scFv,为抗gp120蛋白的ScFv防治艾滋病研究创造了条件.
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HIV包膜糖蛋白gp120与艾滋病痴呆综合征
艾滋病痴呆综合征(AIDS dementia complex,ADC)是人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的并发症之一,常出现在HIV感染的晚期.主要表现为运动和认知功能障碍,如运动迟缓、共济失调,感情淡漠等[1].
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与植物多糖硫酸酯结合的HIV-1ⅢB灭活病毒免疫小鼠的研究
目的:为了探讨植物多糖硫酸酯(M33A)与gp120结合后,能否诱导HIV-1ⅢB的gp120暴露出中和抗体的表位,用它作为灭活疫苗以便诱导产生中和抗体.方法:用M33A结合的灭活HIV-1ⅢB作为免疫原,与佐剂混和后,免疫BALB/c小鼠,制备出免疫血浆.用ELISA检测血浆内抗HIV-1特异性IgG抗体的滴度,用改良的活细胞染色法中和试验检测免疫血浆的抗HIV-1ⅢB的中和活性.结果:从与M33A结合的HIV-1ⅢB免疫组的动物获得的免疫血浆内抗HIV-1抗体的滴度(C组:1.5×106;D组:1.5×106)比未结合M33A的HIV-1ⅢB免疫组(4.9×105)高,雌性小鼠的免疫血浆的特异性抗体滴度比雄性的高3倍.所有免疫组获得的免疫血浆均没有抗HIV-1中和活性.结论:M33A与gp120相互作用不能诱导暴露出gp120的中和抗体表位,但M33A可以增强机体免疫原的抗体反应强度,提示它可以作为免疫增强剂用于疫苗研究.
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HIV-1 GP120主要抗原性片段的制备及其在HIV诊断中的应用
目的研制HIV中国流行株RL42 GP120主要抗原性片段,以便进一步开发HIV抗体检测试剂.方法克隆RL42毒株GP120蛋白C-端250个氨基酸的编码序列,克隆入大肠杆菌表达载体pBV220进行表达.通过包涵体处理和离子交换层析纯化目的蛋白.将纯化后的蛋白用狭缝电转技术转印硝酸纤维素膜,利用HIV参考品血清检测其灵敏度和特异性.结果目的蛋白的表达量占菌体总蛋白的10%左右.纯化后其纯度高于95%,HIV参考品血清检测显示出良好的灵敏度和特异性,检测8份阳性临床标本无一漏检,而7份阴性临床标本元交叉反应.结论已研制出具有良好灵敏度和特异性的HIV-1 GP120主要抗原性片段.为开发HIV抗体检测试剂创造了条件.
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Ⅰ型人类免疫缺陷病毒包膜gp120与乙型肝炎病毒表面抗原免疫原性比较
目的 比较Ⅰ型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)及乙型肝炎病毒(HBV)包膜蛋白初次免疫及加强免疫后诱导产生抗体的规律,为提高HIV-1包膜蛋白诱导保护性抗体产生能力提供创新思路.方法 以10周龄雌性C57BL/6小鼠为动物模型,分别用HIV-1 06044毒株gp120三聚体(gp120T)、HBV表面抗原(HBsAg)蛋白与AddaVax佐剂免疫小鼠,背部皮下注射,共免疫3次,每次免疫间隔3周,第一、第二次免疫后7d和第三次免疫后3d、7d取血;第一次免疫后7d、第三次免疫后3d、7d取脾组织.用酶联免疫吸附实验(ELISA)及酶联免疫斑点实验(ELISpot)方法检测免疫小鼠血浆特异性结合抗体滴度及抗体分泌细胞(ASC)数量.结果 gp120T和HBsAg两种蛋白初次免疫后,动物均未产生明显的特异性抗体.两种蛋白加强免疫后特异性抗体水平明显升高,gp120T一次加强免疫及两次加强特异性抗体滴度逐渐升高,而HBsAg一次加强抗体滴度已经接近两次加强的水平.二次加强免疫后,gp120T和HBsAg免疫鼠脾脏特异性ASC数量差异不显著.结论 HIV-1包膜gp120T加强免疫诱导抗体水平达到高峰慢于HBsAg加强免疫,即加强免疫后gp120T诱导的回忆反应慢于HBsAg.
关键词： Ⅰ型人类免疫缺陷病毒 gp120 乙型肝炎病毒 表面抗原 -
原代HIV-1包膜糖蛋白修饰体诱导小鼠产生高滴度gp120抗体
目的 探索1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)包膜糖蛋白修饰对包膜免疫原性的的影响.方法 通过PCR扩增获得原代HIV-1 06044株包膜gp120基因及其突变体gp120/W427S基因,并构建gp120三聚体蛋白真核表达载体pcT-gp120和pcT-gp120/W427S,重组表达载体体外瞬时转染人胚肾HEK293T细胞,表达gp120三聚体蛋白.采取DNA初免-蛋白凝胶加强的策略免疫BALB/c小鼠,末次免疫后10 d检测免疫血清中结合抗体的水平.结果 获得真核表达载体pcT-gp120和pcT-gp120/W427S及gp120三聚体蛋白;末次免疫后10 d,gp120免疫血清中结合抗体滴度大于1∶1 000,gp120/W427S免疫血清中结合抗体滴度大于1∶10 000,而且,gp120/W427S免疫组血清抗体结合活性显著高于gp120免疫组血清.结论 HIV-1包膜第427位色氨酸突变为丝氨酸,改善了包膜的免疫原性,为包膜免疫原的设计和优化提供了新的线索.
关键词： Ⅰ型人类免疫缺陷病毒 gp120 Balb/c小鼠 免疫原性 -
HIV-1V2区175位变异可提高中和抗体对病毒的结合能力
目的 探讨HIV-1 V2区175位变异对于V3中和抗体与病毒结合能力的影响.方法 使用真核细胞表达质粒分别串联HIV-1野生型和突变型的env基因和绿色荧光蛋白GFP,并转染293T细胞,使gp120表达到293T细胞的表面,并根据GFP荧光来检出转染成功细胞.然后使用免疫染色和双荧光流式细胞仪检测几种常见V3区中和抗体对野生型和突变型gp120的结合力.结果 L175P突变使表达在293T细胞表面的gp120三聚体与3种V3区特异性抗体结合的荧光强度差异有统计学意义,与阴性对照的荧光强度分布差异有统计学意义,图形的位置和峰值均有变化,平均荧光强度MFI显著升高；而表达野生株gp120三聚体的293T细胞与V3抗体作用后,曲线与阴性对照的荧光强度分布基本重叠,MFI 基本相同.结论 提示V2区突变可以提升病毒对V3抗体中和作用的敏感性.
