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AP-1和ETS-1位点缺失的DC-SIGN启动子荧光素酶报告质粒的构建及其活性研究
目的 研究AP-1和ETS-1转录因子结合位点(TFBS)缺失对树突状细胞特异性胞间黏附分子-3结合非整合素(DC-SIGN)启动子活性的影响,探讨DC-SIGN表达的机制.方法 从人外周血中提取全基因组DNA,设计DC-SIGN启动子序列上下游引物、转录因子结合位点两侧的引物及其相应的连接引物,利用PCR方法,通过不同的引物组合扩增出转录因子结合位点两侧的片段,再用连接引物连接两片段,得到转录因子结合位点缺失的DC-SIGN启动子序列,通过双酶切、连接的方法,将得到的DC-SIGN启动子序列定向克隆入荧光素酶报告质粒,将上述质粒通过脂质体转染Hacat和293细胞,48 h后检测荧光素酶的活性.结果 体外扩增得到的转录因子结合位点缺失的DC-SIGN启动子序列以及重组的荧光素酶报告质粒经双酶切、基因测序鉴定正确,荧光素酶活性检测结果显示AP-1位点缺失使DC-SIGN启动子活性下降20%(293细胞)和10%(Hacat细胞),带增强子的DC-SIGN启动子活性下降了40%～50%;ETS-1位点缺失的普通型和带增强子型DC-SIGN启动子的活性几乎消失.结论 ETS-1转录因子结合位点在DC-SIGN启动子活性表达中起重要作用,AP-1转录因子结合位点作用不大.
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IL-4诱导THP-1细胞表达DC-SIGN的信号通路调节研究
目的 研究IL-4诱导THP-1细胞表达DC-SIGN的信号调节通路,探索DC -SIGN表达的信号调控网络.方法 以佛波脂(PMA)刺激THP-1细胞24h后加入IL-4作用48 h诱导DC-SIGN的表达,并设ERK阻断剂、NF-κB阻断剂、JAK-STAT阻断剂和MAPK阻断剂处理组.用RT-PCR检测DC-SIGN的mRNA表达,Western blot检测胞质内DC-SIGN蛋白的表达,流式细胞术检测细胞表面DC-SIGN的表达.另外,提取IL-4诱导0、10、20、30、60和120 min的THP-1细胞胞质和胞核蛋白,Western blot检测不同信号通路的信号蛋白及其磷酸化蛋白的变化.结果 IL-4可以大幅提高DC-SIGN在THP-1细胞上的表达,包括mRNA和胞膜蛋白水平.在mRNA、胞质和细胞表面蛋白表达3个水平上,ERK通路阻断剂阻断效果好,几乎完全阻断了IL-4的诱导效果,JAK-STAT和NF-κB通路阻断剂具有部分阻断效果,而p38通路阻断剂无阻断效果.信号蛋白检测结果显示,IL-4诱导0～120 min内,胞质磷酸化ERK1/2、磷酸化STAT6以及NF-κBp65、NF-κBp50、磷酸化IKB和磷酸化AKT随时间推移浓度逐渐升高,而p38MAPK及其磷酸化蛋白浓度无明显改变.胞核内胞质磷酸化ERK1/2、磷酸化STAT6以及NF-κBp65和NF-κBp50随时间推移浓度逐渐升高.结论 ERK、JAK-STAT和NF-κB通路参与了DC-SIGN启动子的活化,其中以ERK通路为主.
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DC-SIGN启动子活化信号通路对HIV-1 5'LTR活性的影响
目的 研究诱导DC-SIGN启动子活化的信号通路对HIV-1 5'LTR活性的影响.方法 PCR法扩增DC-SIGN启动子及HIV-1 5'LTR序列,通过双酶切重组到荧光素酶报告质粒中,构建DCSIGN启动子和HIV-1 5'LTR荧光素酶报告质粒.以PMA分化的THP-1细胞作为细胞模型,分别转染DC-SIGN启动子和HIV-1 5 'LTR荧光素酶报告质粒,并以相应的信号通路阻断剂处理,以1000IU/ml的IL-4诱导24 h后检测荧光素酶活性.结果 HIV-1 5'LTR荧光素酶报告质粒的活性明显弱于DC-SIGN启动子,IL-4诱导可以使DC-SIGN启动子和HIV-1 5'LTR荧光素酶报告质粒的活性升高至2倍以上.ERK、JAK-STAT和NF-κB信号通路阻断剂均能够降低DC-SIGN启动子荧光素酶报告质粒的活性,其中ERK1/2抑制剂抑制活性强,几乎完全阻断了IL-4的诱导效应.对于HIV-1 5 'LTR荧光素酶报告质粒,NF-κB信号通路阻断剂阻断效果明显,阻断效率为52.32％,ERK信号通路阻断剂阻断效率为43.31％.结论 IL-4诱导的信号通路在活化DC-SIGN启动子的同时,对HIV-15 'LTR也具有一定的活化作用,并主要通过NF-κB和ERK信号通路实现.
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DC-SIGN在树突状细胞传播HIV-1中作用的实验研究
目的 探讨DC-SIGN在树突状细胞(DC)传播HIV-1中的作用.方法 用M嗜性或T嗜性HIV-1原代分离株分别刺激未成熟DC(immature DC,iDC))和成熟DC(mature DC,mDC),数量与DC相同的CD4+ T细胞作为对照组,与活化的CD4+ T细胞共培养,用ELISA方法定量检测第4、7、10、14天共培养上清中p24抗原,观察DC在传播HIV-1的作用.预先加入抗DC-SIGN McAb和/或抗ICAM-3 McAb,观察抗DC-SIGN McAb和抗ICAM-3 McAb对DC传播HIV-1作用的影响.结果 用M嗜性HIV-1刺激的iDC以及用M和T嗜性HIV-1刺激的mDC的共培养上清中p24含量均随培养时间延长逐渐增加,显著高于对照组(P=0.001).加入抗DC-SIGN McAb后,共培养上清p24抗原明显降低;加入抗ICAM-3 McAb后上清中p24抗原并不减少.用T嗜性HIV-1刺激的iDC共培养上清中p24含量不随培养时间延长逐渐增加,与对照组相比差异无统计学意义.结论 iDC具有传播M嗜性HIV-1的作用,但不具有传播T嗜性HIV-1的作用;mDC既能将M嗜性也能将T嗜性HIV-1传播给CD4+ T细胞.抗DC-SIGN McAb能够抑制DC传播HIV-1的作用,提示DC-SIGN在DC向T细胞播散HIV-1过程中可能发挥重要作用.
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可溶性DC-SIGN的表达、纯化及其生物学活性分析
目的在大肠杆菌中表达并纯化DC-SIGN融合蛋白并对该融合蛋白的抗原特异性和生物学活性进行分析. 方法以重组质粒pcDNA3.1-DC-SIGN为模板,进行PCR扩增出带KpnⅠ和SacⅠ酶切位点的人DC-SIGN凝集素cDNA,经相应酶切后插入原核表达载体pET-32a(+),转化大肠杆菌AD494(DE3),经IPTG诱导表达DC-SIGN 融合蛋白,用Ni2+-NTA树脂对融合蛋白进行纯化,以Western blot试验进行鉴定,通过HIV与DC-SIGN的亲和实验研究融合蛋白的生物学活性. 结果酶切鉴定证实DC-SIGN凝集素基因已插入原核表达载体pET-32a(+).重组表达质粒pET-32a(+)-DL在大肠杆菌AD494(DE3)中成功表达了DC-SIGN 融合蛋白,其相对分子质量(Mr)约为35×103.Ni2+-NTA树脂纯化后,融合蛋白的纯度可达90%以上.Western blot试验显示DC-SIGN融合蛋白与鼠抗人DC-SIGN抗体有特异性免疫反应. 结论在大肠杆菌中表达DC-SIGN融合蛋白,用亲和层析的方法对其进行初步纯化;HIV与DC-SIGN的亲和实验表明,可溶性DC-SIGN融合蛋白能抑制R5和X4 HIV与DC-SIGN受体结合.
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DC-SIGN在肿瘤免疫中的研究进展
树突状细胞( dendritic cell, DC)是体内既能启动初始免疫应答,又能负向调控免疫反应的重要的专职抗原提呈细胞,在机体免疫应答中发挥着重要作用[1-2]. DC表面的抗原受体C型凝集素受体( C-type lectin receptor, CLR)及Toll受体(Toll receptor, TLR)与 DC 细胞的免疫调节功能密切相关.
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人DC-SIGN基因表达质粒的构建及其表达
目的构建含有人DC-SIGN基因的真核表达载体,并在293T细胞中表达目的蛋白.方法人血培养获得树突状细胞(DC),以DC的mRNA逆转录cDNA为模板,应用PCR体外扩增获得目的DNA,用限制性内切酶Sal I和BamH I分别酶切VRC4409载体和PCR产物,通过连接、转化及克隆的筛选将目的基因克隆入载体VRC4409,构建载体VRC4409-DC-SIGN,经PCR鉴定及测序分析证实,脂质体介导转染293T细胞,蛋白质印迹分析其表达DC-SIGN蛋白.结果重组质粒经双酶切和测序鉴定证实VRC4409-DC-SIGN构建成功,DC-SIGN蛋白在293T细胞中成功表达.结论成功构建质粒VRC4409-DC-SIGN并在293T细胞中表达目的蛋白,为进一步研究DC-SIGN的生物学功能奠定了基础.
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DC-SIGNR基因绞链区重复序列多态性检测方法的建立与应用
目的 建立树突状细胞表面的蛋白质DC-SIGNR基因绞链区重复序列多态性的检测方法,了解宿主因素在抗艾滋病病毒1型(HIV-1)所起的作用.方法 设计特定引物,用PCR方法对DC-SIGNR基因绞链区重复序列进行扩增,用凝胶电泳法对其产物进行分析.结果 根据DC-SIGNR绞链区重复序列的数量,DC-SIGNR绞链区重复序列具有高度基因多态性,而DC-SIGN则罕见基因多态性.结论 所建立的检测DC-SIGNR绞链区重复序列的方法简单,易于掌握.由于DC-SIGNR重复序列数量的改变可能会影响其正常功能,从而影响宿主与HIV-1的结合能力,因此该法为研究宿主因素在抗HIV-1感染中所起作用的一种好方法.
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DC-SIGN真核表达载体的构建及其稳定转染BHK21细胞系的建立
目的 构建DC-SIGN分子真核表达载体,获得可稳定表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系.方法 以pUNO-hDC-SIGN1Aa质粒为模板,通过PCR方法扩增人DC-SIGN基因,经过Not Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切之后,将其克隆入真核表达载体pIRES-neo,构建真核表达载体pIRES-neo-DC-SIGN,以Not Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切以及测序验证重组质粒的正确性.将重组质粒以Lipo-fectamine~(KM) 2000转染到BHK21细胞,通过G418及有限稀释法进行阳性克隆的筛选,建立稳定表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系,利用流式细胞仪、Western blotting及免疫荧光法检测DC-SIGN分子的表达.结果 双酶切鉴定证明DC-SIGN基因已经成功克隆入真核表达载体pIRES-neo中,测序结果表明EC-SIGN基因与原序列一致.pIRES-neo-DC-SIGN转染BHK21细胞后,获得了急定表达DC-SIGN分子的细胞系.流式细胞仪检测结果显示,阳性克隆中DC-SIGN分子的表达率为85.42%.免疫荧光结果显示,DC-SIGN分子主要表达于细胞膜表面.Western blotting能检测到DC-SIGN蛋白表达的特异条带.结论 成功构建了稳定、高效表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系,为后续DC靶向性疫苗研究奠定了基础.
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人DC-SIGN真核表达载体的构建及表达
目的 构建含有FLAG标签的人DC-SIGN真核表达载体,并在人胚肾293T细胞中进行表达.方法 通过PCR方法获得含有FLAG标签的人DC-SIGN分子基因,将其插入到真核表达载体pIRES-neo中.构建的重组质粒pIRES-neo-FLAG-DC-SIGN转染293T细胞,利用流式细胞仪、免疫荧光及Western Blot检测其表达情况.结果 含FLAG标签的人DC-SIGN基因测序正确,PCR和酶切鉴定证明FLAG-DC-SIGN基因已成功连入真核表达载体pIRES-neo中;检测结果显示重组质粒pIRES-neo-FLAG-DC-SIGN在293T细胞中得到表达.结论 成功构建了重组质粒pIRES-neo-FLAG-DC-SIGN,且在293T细胞中能有效表达,为后续DC靶向性疫苗研究奠定了基础.
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树突细胞特异性非整合素与人免疫缺陷病毒
树突细胞特异性非整合素(DC-SIGN,dendritic-cell specific ICAM-3 grabbing non-intesrin),又称CD209,是一种主要由树突状细胞(dendritic-cell,DC)汾泌的细胞膜表面分子.DC-SIGN属Ⅱ类C-型凝集素膜受体(CRL)能与细胞间黏附分子(intercelluar adhesion molecule,ICAM)以及病毒、细菌、寄生虫等多种病原结合,如能与人免疫缺陷病毒表面蛋白gp120,并介导病毒感染靶细胞.研究表明DC-SIGN在HIV传播与致病中有重要作用.
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人DC-SIGN基因表达质粒的构建及其表达
目的 构建含有人DC-SIGN基因的真核表达载体,并在293T细胞中表达目的 蛋白.方法 人血培养获得树突状细胞(DC),以DC的mRNA逆转录cDNA为模板,应用PCR体外扩增获得目的 DNA,用限制性内切酶Sal Ⅰ和BamH Ⅰ分别酶切VRC4409载体和PCR产物,通过连接、转化及克隆的筛选将目的 基因克隆入载体VRC4409,构建载体VRC4409-DC-SIGN,经PCR鉴定及测序分析证实,脂质体介导转染293T细胞,蛋白质印迹分析其表达DC-SIGN蛋白.结果 重组质粒经双酶切和测序鉴定证实VRC4409-DC-SIGN构建成功,DC-SIGN蛋白在293T细胞中成功表达.结论 成功构建质粒VRC4409-DC-SIGN并在293T细胞中表达目的 蛋白,为进一步研究DC-SIGN的生物学功能奠定了基础.
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人DC-SIGN绿色荧光融合蛋白真核表达与功能鉴定
目的:构建人DC-SIGN绿色荧光融合蛋白的真核表达载体,在COS7细胞表面表达鉴定.方法:用RT-PCR从人外周血单个核细胞扩增DC-SIGN蛋白基因片段,连接到T载体.测序鉴定后切下相应片段,连接到pEGFP-C1表达载体,重组质粒(命名为:DS-pEGFP-C1)转染COS7细胞,表达DC-SIGN绿色荧光融合蛋白(命名为:DS-EGFP).荧光定量PCR检测融合基因mRNA拷贝量,激光扫描共焦显微镜鉴定DS-pEGFP-C1的表达和摄取减毒牛型分枝杆菌BCG功能.结果:用RT-PCR扩增得到正确的目的基因片段并构建成真核表达载体DS-pEGFP-C1,转染COS7细胞,荧光定量PCR检测DS-pEGFP-C1转录mRNA拷贝量是4.52×1011 copies/ml,激光扫描共焦显微镜检测证实DS-EGFP在COS7细胞表面表达,同时具有摄取BCG的功能.结论:本研究成功构建人DC-SIGN绿色荧光融合蛋白的真核表达载体DS-pEGFP-C1,表达了融合蛋白,后者能够摄取BCG.
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肺炎支原体荚膜多糖抑制树突状细胞吞噬和膜分子表达
目的:了解肺炎支原体(Mp)荚膜多糖(CPS)通过结合树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素分子(DC-SIGN)对树突状细胞吞噬功能及细胞表面膜分子表达的影响.方法:复苏培养Mp菌株,抽提和纯化CPS.培养人外周血单个核细胞来源的DC,吉姆萨染色观察和流式细胞术(FCM)鉴定;用CPS刺激DC,FCM检测DC对FITC-多聚糖的吞噬指数、DC表面特异标志CD83、HLA-DR抗原以及协同刺激分子CD80和CD86的表达.结果:培养7d的DC有典型的树突状结构,并高表达CD11c分子.经CPS刺激后,DC内FITC-多聚糖的平均荧光强度较对照PBS处理组显著增加(P＜0.05),DC表面膜分子CD83、HLA-DR、CD80和CD86较对照组显著减少(P＜0.05).用CPS刺激被DC-SING受体封闭的DC,发现DC内FITC-多聚糖吞噬指数和四种膜表面分子的表达与对照组差异均无显著性(P＞0.05).结论:Mp CPS可促进DC的吞噬功能和减少细胞膜分子CD83、HLA-DR、CD80和CD86的表达.
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DC-SIGN:C型凝集素中的新成员
DC-SIGN是一种树突状细胞特征性的且具有多种功能免疫新分子,不但可以参与树突状细胞的迁移、粘附以及对抗原的识别与内化,还可以参与许多病原体的免疫逃避,本文拟就有关内容作一综述.
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085 树突状细胞与DNA疫苗
随着对DNA疫苗(DNA Vaccine)研究的深入,树突状细胞(DC)在DNA免疫中的独特作用逐渐被认识.本文综述了DC和DNA疫苗在免疫生物学领域的新进展,并阐述了DC在DNA疫苗引起的免疫应答中的作用.
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树突状细胞特异表面分子DC-SIGN的研究进展
DC-SIGN 是一种特异表达于树突状细胞(DC)表面的Ⅱ型跨膜蛋白,在机体生理和病理免疫调节中发挥着重要作用,可以与ICAM-3结合,从而介导 DC 与T细胞的相互作用,其 CRD 区可以与HIV-1、HCV、结核杆菌等多种病原体表面糖蛋白结合,从而促进病原体感染.近的研究表明 DC-SIGN 与肿瘤免疫、免疫逃避也密切相关.
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075 DC-SIGN结构和功能的研究进展
树突细胞(DC)是目前已知的功能强的抗原提呈细胞，它能直接激活静息T细胞的应答反应。90年代开始，DC在人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)感染过程中的作用逐渐受到重视，但是，研究结果颇具争议。近，在DC表面新发现一种蛋白质——DC-SIGN，它参与了静息T细胞的激活以及HIV-1的感染过程。DCSIGN的发现不仅有助于阐述HIV-1的致病机理，而且对DC功能的研究开辟了一个崭新的视角。本文就DCSIGN的研究近况做一综述。
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DC-SIGN与mCEACAM1a分子相互作用调控鼠冠状病毒复制
树突细胞特异性细胞间黏附分子-3结合非整合素分子(dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin,DC-SIGN)和肝/淋巴结特异性细胞间黏附分子-3结合非整合素分子(liver/lymph node-specific intercellular adhesion molecules-3-grabbing non-integrin,L-SIGN)是钙离子依赖的C型凝集素受体,通过识别病毒粒子表面含甘露聚糖或果糖寡聚糖的分子介导病毒进入细胞,但其在调节病毒复制中的作用较少被关注.本研究通过建立稳定表达DC-SIGN和L-SIGN及其功能域嵌合体的细胞系,分析两者过表达对鼠冠状病毒复制的影响.结果显示,L-SIGN比DC-SIGN更能显著抑制病毒复制,这种差异与两者胞内区序列和基序组成不同有关;鼠冠状病毒感染导致细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)信号通路分子磷酸化下调,过表达DC-SIGN和L-SIGN可抑制这种下调趋势.在没有鼠癌胚抗原相关细胞黏附分子1(mouse carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1,mCEACAM1)存在时,DC-SIGN不能介导病毒感染.这些结果提示,DC-SIGN通过与mCEACAM1a分子相互作用和调节细胞信号通路分子功能以调控鼠冠状病毒复制.
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炎症状态下NF-κB-mTOR通路及转录因子RUNX1调控肾小管上皮细胞DC-SIGN表达研究
探讨炎症状态下NF-κB通路、mTOR通路以及转录因子RUNX1对肾小管上皮细胞DC-SIGN表达调控.体外培养肾小管上皮细胞株(HK-2)并经TNF-α刺激,分别给予NF-κB抑制剂(BAY 11-7082)和mTOR抑制剂(Rapamycin)干预.采用免疫印迹试验和实时定量PCR法检测HK-2细胞DC-SIGN表达;免疫印迹试验检测mTOR的磷酸化水平.用上述经TNF-α刺激的HK-2以及建立的肾炎损伤小鼠模型,以实时定量PCR法检测HK-2细胞以及分离的模型鼠肾小管上皮细胞中RUNX1表达.进一步利用HK-2构建过表达RUNX1稳定转染细胞株并经TNF-α刺激,实时定量PCR法检测RUNX1和DC-SIGN表达.结果显示,HK-2经TNF-α刺激模拟炎症状态下,可促进mTOR磷酸化并诱导DC-SIGN表达;NF-κB抑制剂和mTOR抑制剂均能抑制HK-2细胞的DC-SIGN表达,NF-κB抑制剂亦可抑制mTOR的磷酸化.还发现炎症因素刺激下,人和小鼠肾小管上皮细胞体内体外均明显表达RUNX1,且过表达RUNX1的HK-2细胞稳转株显著表达DC-SIGN,并在TNF-α刺激下可进一步上调DC-SIGN表达.本研究表明,肾脏微炎症状态下,NF-κB-mTOR通路以及转录因子RUNX1均参与了肾小管上皮细胞DC-SIGN的表达调控.提示此过程中,NF-κB通路作为mTOR上游通路,通过激活后者参与DC-SIGN表达,而转录因子RUNX1可能是启动DC-SIGN表达的关键调控因素.
