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小鼠adam10基因启动子克隆和双荧光素酶报告基因系统构建及鉴定
本研究旨在克隆小鼠adam10基因启动子,构建以adam10基因启动子为启动序列的双荧光素酶报告基因系统并分析其活性,为研究adam10基因转录调控提供有效工具.以BALB/c小鼠脑组织为模板,采用PCR方法克隆小鼠adam10基因启动子序列至pCR-Blunt载体,酶切后连接至荧光素酶报告质粒pGL4.10启动子区域,构建重组荧光素酶报告质粒pGL4.10-adam10,采用阳离子脂质体法与阳性对照质粒pGL4.74共转染真核细胞293FT,以离子霉素刺激为刺激组、DMSO为未加干预组,同时以不含启动子的pGL4.10与阳性对照质粒pGLA.74共转染组为阴性对照组,化学发光仪检测荧光强度及比例.结果表明,酶切及测序验证克隆的adam10启动子序列正确且无突变,构建的重组荧光素酶报告质粒pGL4.10-adam10与阳性对照质粒pGL4.74载体成功共转染293FT细胞,pGL4.10-adam10转染细胞后具有转录活性.离子霉素刺激组活性明显高于DMSO组,荧光比值约为DMSO组2倍(P＜0.05),阴性对照组不具备转录活性.结论:成功克隆了adam10启动子并构建了重组荧光素酶报告质粒pGL4.1 0-adam1,离子霉素可增强adam10基因启动子转录活性.
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AP-1和ETS-1位点缺失的DC-SIGN启动子荧光素酶报告质粒的构建及其活性研究
目的 研究AP-1和ETS-1转录因子结合位点(TFBS)缺失对树突状细胞特异性胞间黏附分子-3结合非整合素(DC-SIGN)启动子活性的影响,探讨DC-SIGN表达的机制.方法 从人外周血中提取全基因组DNA,设计DC-SIGN启动子序列上下游引物、转录因子结合位点两侧的引物及其相应的连接引物,利用PCR方法,通过不同的引物组合扩增出转录因子结合位点两侧的片段,再用连接引物连接两片段,得到转录因子结合位点缺失的DC-SIGN启动子序列,通过双酶切、连接的方法,将得到的DC-SIGN启动子序列定向克隆入荧光素酶报告质粒,将上述质粒通过脂质体转染Hacat和293细胞,48 h后检测荧光素酶的活性.结果 体外扩增得到的转录因子结合位点缺失的DC-SIGN启动子序列以及重组的荧光素酶报告质粒经双酶切、基因测序鉴定正确,荧光素酶活性检测结果显示AP-1位点缺失使DC-SIGN启动子活性下降20%(293细胞)和10%(Hacat细胞),带增强子的DC-SIGN启动子活性下降了40%～50%;ETS-1位点缺失的普通型和带增强子型DC-SIGN启动子的活性几乎消失.结论 ETS-1转录因子结合位点在DC-SIGN启动子活性表达中起重要作用,AP-1转录因子结合位点作用不大.
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人miR-16真核表达载体的构建与鉴定
目的 构建人miR-16真核表达载体,为研究其基因表达调控机制建立实验基础.方法 从人类基因组 DNA中扩增miR-16的前体序列,引入酶切位点和polyT转录终止序列,酶切后插入siRNA表达载体pSuper中,构建miR-16真核表达载体pmiR-16,然后进行酶切和测序鉴定;同时构建含miR-16完全互补序列及乙肝表面抗原HBsAg的报告质粒pXF3H-HBs.将pmiR-16与pXF3H-HBs共转染肝癌细胞系HepG2,通过HBsAg ELISA检测试剂盒检测表达产物HBsAg的改变,鉴定真核表达载体pmiR-16的生物学活性.结果 成功构建了人miR-16真核表达载体pmiR-16及其报告质粒.pmiR-16与pXF3H-HBs共转染HepG2后,pmiR-16组HBsAg的基因表达与对照组相比显著降低,证实pmiR-16转染真核细胞后具有生物学活性.结论 miR-16真核表达载体的成功构建为进一步研究其基因表达调控机制建立了实验基础.
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肺炎链球菌绿色荧光蛋白报告质粒的构建及评价
目的:构建一个可高效报告基因表达的绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)报告质粒.为采用差异荧光诱导(Differential fluorescence induction,DFI)技术筛选肺炎链球菌(Streptoccus pneumoniae,S.pn)体内诱导的毒力基因奠定基础.方法:酶切质粒pGreenTIR的SD-ENH-GFP片段,将其插入含氯霉素抗性基因的自杀质粒pEVP3中,构建以绿色荧光蛋白为报告基因的自杀质粒pEVP3-SDGFP.再将肺炎链球菌的溶血素基因(Pneumolysin,ply)上游约500bp片段插入到该质粒报告基因上游的多克隆位点中,得到质粒pEVP3-SDGFP-Ply,将其转化入肺炎链球菌TIGR4中,比较新建质粒pEVP3-SDGFP与同样处理质粒pEGFP-1(报告基因gfp前无SD及ENH序列)报告上游基因表达的情况.结果:通过体内、外实验证实新建质粒pEVP3-SDGFP不但可以报告肺炎链球菌溶血素基因的表达,并且其报告上游基因表达的能力明显强于质粒pEGFP-1.结论:所构建的质粒pEVP3-SDGFP可用于DFI筛选肺炎链球菌体内诱导基因所需启动子诱捕文库的构建.
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含小鼠PPRE反应元件报告质粒的转化扩增
目的 对含小鼠过氧化物酶体增殖物反应元件(PPRE)报告质粒p4×PPRE-luc进行体外转化和扩增,为基于PPAR为靶标的药物筛选分子平台的建立提供高纯度、高丰度的报告载体.方法 取p4×PPRE-luc质粒转化DH5α感受态菌,再接种到含氨苄青霉素的LB琼脂培养板进行抗性筛选培养,挑取阳性克隆菌落进行培养后抽提质粒,紫外分光光度计测定提取质粒的纯度和浓度,并取样进行琼脂糖凝胶电泳验证.结果 经转化后获得了抗氨苄青霉素的阳性克隆菌落,挑取阳性克隆并经培养后提取的p4×PPRE-luc质粒其A260A280=1.84,浓度为750 ng/μl.结论 成功转化并扩增了p4×PPRE-luc质粒,为基于PPAR为靶标的药物筛选分子平台的建立提供了高纯度、高浓度的报告质粒.
关键词： 过氧化物酶体增殖物反应元件 报告质粒 质粒转化 -
转录因子KLF4与miR-106a的调控关系及其对人胃癌细胞迁移的影响
目的:探讨转录因子Krüppel样因子4(KLF4)与miR-106a表达的调控关系及其对人胃癌细胞迁移的影响.方法:使用基因组数据库UCSC预测miR-106a启动子,插入pGL3-Basic报告载体,构建野生型报告质粒pmiR-106a-WT-luc和点突变报告质粒pmiR-106a-MUT-luc.使用转录因子数据库JASPAR预测并筛选调控miR-106a的转录因子KLF4,克隆至pcDNA3.0载体,构建KLF4过表达质粒KLF4-pcDNA3.0.将KLF4+/-pcDNA3.0与pmiR-106a-WT/MUT-luc共同转染HEK293T细胞,双荧光素酶系统检测荧光值.收集30对胃癌和癌旁组织标本,采用实时定量PCR(qPCR)检测miR-106a、KLF4 mRNA表达水平.Transwell法检测人胃癌SGC-7901细胞的迁移能力.结果:miR-106a报告质粒及KLF4过表达质粒经双酶切、PCR扩增、测序及Blast比对提示构建正确.KLF4-pcDNA3.0显著抑制pmiR-106a-WT-luc荧光素酶活性(P=0.000),但对pmiR-106a-MUT-luc影响较小(P=0.553).胃癌组织中KLF4 mRNA平均相对表达量为0.716±0.624,miR-106a为3.367±2.165.KLF4-pcDNA3.0部分阻遏miR-106a对胃癌SGC-7901细胞迁移的促进作用(P=0.038).结论:转录因子KLF4与miR-106a启动子区存在直接结合位点,KLF4可能在上游转录水平负调控miR-106a成熟体表达,以此发挥部分阻遏miR-106a促胃癌细胞迁移的作用.
