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小鼠adam10基因启动子克隆和双荧光素酶报告基因系统构建及鉴定
本研究旨在克隆小鼠adam10基因启动子,构建以adam10基因启动子为启动序列的双荧光素酶报告基因系统并分析其活性,为研究adam10基因转录调控提供有效工具.以BALB/c小鼠脑组织为模板,采用PCR方法克隆小鼠adam10基因启动子序列至pCR-Blunt载体,酶切后连接至荧光素酶报告质粒pGL4.10启动子区域,构建重组荧光素酶报告质粒pGL4.10-adam10,采用阳离子脂质体法与阳性对照质粒pGL4.74共转染真核细胞293FT,以离子霉素刺激为刺激组、DMSO为未加干预组,同时以不含启动子的pGL4.10与阳性对照质粒pGLA.74共转染组为阴性对照组,化学发光仪检测荧光强度及比例.结果表明,酶切及测序验证克隆的adam10启动子序列正确且无突变,构建的重组荧光素酶报告质粒pGL4.10-adam10与阳性对照质粒pGL4.74载体成功共转染293FT细胞,pGL4.10-adam10转染细胞后具有转录活性.离子霉素刺激组活性明显高于DMSO组,荧光比值约为DMSO组2倍(P＜0.05),阴性对照组不具备转录活性.结论:成功克隆了adam10启动子并构建了重组荧光素酶报告质粒pGL4.1 0-adam1,离子霉素可增强adam10基因启动子转录活性.
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截短型小鼠成纤维细胞生长因子受体-1基因慢病毒载体构建及在真核细胞中的表达
本研究旨在克隆小鼠成纤维细胞生长因子受体1(fibroblast growth factor receptor 1,fgfr1)基因,构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的截短型fgfr1(△fgfr1)重组慢病毒载体并在真核细胞中表达.采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)以BALB/c胎鼠脑组织为模板克隆全长型fgfr1基因,连接至克隆载体pCR-Blunt,通过反向PCR技术删除胞内磷酸化区域获得△fgfr1,限制性内切酶酶切后亚克隆至慢病毒转移质粒,构建携带EGFP及△fgfr1双顺反子自身失活型重组慢病毒表达质粒,通过脂质体转染法与包装质粒及包膜蛋白质粒共转染包装细胞293FT,超速离心浓缩病毒颗粒后转染293FT细胞,用荧光显微镜及流式细胞术(FCM)检测EGFP的表达,免疫印迹法(Western btot)鉴定截短型FGFR1蛋白表达.结果表明,成功克隆小鼠fgfr1基因,构建重组慢病毒转移载体LV-IRES-EGFP-△fgfr1及对照载体LV-IRES-EGFP,三质粒系统共转染293FT细胞后获得病毒滴度达到108 TU/ml.以重组病毒载体转染293FT细胞后第4天在荧光显微镜下观察到较强绿色荧光表达,FCM检测转染效率可达95％,Westem blot检测显示,转染后293FT细胞表达截短型FGFR1蛋白.结论:成功构建了自身失活型慢病毒载体LV-IRES-EGFP- Afgfr1,并在真核细胞中获得表达.
关键词： 成纤维细胞生长因子受体基因 慢病毒载体构建 基因表达 293FT细胞 -
小鼠CXCR4基因慢病毒载体构建与真核表达
本研究旨在克隆小鼠CXC型趋化因子受体4(CXCR4)基因,构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的CXCR4重组慢病毒栽体并在真核细胞中表达.采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)以C57BL/6小鼠骨髓细胞为模板克隆全长型CXCR4基因,连接至克隆载体pCR-Blunt,经限制性内切酶酶切后亚克隆至慢病毒转移栽体,构建携带EGFP及CXCR4双顺反子结构的自身失活型重组慢病毒表达质粒；同时构建LV-IRES-EGFP作为对照质粒；通过脂质体转染法与包装质粒及包膜蛋白质粒共转染包装细胞293FT,超速离心浓缩病毒颗粒后转染293FT细胞,采用荧光显微镜和流式细胞术(FCM)检测EGFP的表达,Western blot鉴定CXCR4蛋白表达.结果表明,成功克隆小鼠CXCR4基因,构建重组慢病毒转移质粒LV-IRES-EGFP-CXCR4及对照质粒LV-IRES-EGFP,三质粒系统共转染293Fr细胞后获得病毒滴度可达到108 TU/ml.以重组慢病毒颗粒感染293FT细胞后第3天,在荧光显微镜下观察到较强绿色荧光表达,FCM检测显示感染效率可达95％,FCM及Western blot结果显示感染后293FT细胞表达CXCR4蛋白.结论:成功构建自身失活型慢病毒载体LV-IRES-EGFP-CXCR4,并在真核细胞中获得表达.
关键词： CXC型趋化因子受体4 慢病毒载体 基因表达 293FT细胞 -
癌胚抗原慢病毒表达载体的制备及鉴定
目的:构建人癌胚抗原(CEA)慢病毒表达载体,以期在哺乳动物细胞中高效、稳定表达.方法:提取CEA阳性的人结肠癌组织总RNA,逆转录获得cDNA序列,CEA全基因引物进行PCR扩增,对所扩增出的大小约2100bp的基因片段胶回收纯化,与pGEM-T Easy载体连接得到重组质粒pGEM-T-CEA.分别用XhoL和Hind Ⅲ双酶切重组质粒pGEM-T-CEA和慢病毒载体pLentiGFP,将双粘CEA片段与羟化后的双粘线形载体pLentiGFP连接得重组载体pLentiGFP-CEA.pLentiGFP-CEA与慢病毒辅助包装载体pΔ8.2和pVSVG共转染293FT细胞,Western Blot验证CEA在转染293FT细胞中表达,72h后收集病毒上清.结果:通过PCR扩增获得了CEA基因,将CEA正向克隆到慢病毒转移质粒pLentiGFP中,并在293FT细胞中包装产生慢病毒颗粒.结论:成功构建了CEA慢病毒表达载体,为进一步从分子水平探讨CEA功能奠定了基础.
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慢病毒介导的外源基因体外投递系统的建立
目的 针对不同哺乳类细胞建立相应的慢病毒体外感染体系,以建立慢病毒介导的外源基因体外投递系统.方法 按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒(携带EGFP基因)包装(脂质体介导的瞬时转染)、超速离心浓缩和保存等,随后用病毒上清或浓缩后的病毒感染293FT细胞.24～48 h后荧光显微镜下观察是否见绿色荧光以证实慢病毒是否成功生产:将携带EGFP基因的病毒上清或浓缩后的病毒分别加入内含293FT细胞、小鼠ES细胞、小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)或小鼠睾丸生殖细胞的培养板孔内,感染6～12 h后.用相应培养基替换感染液,数天后荧光显微镜下观察是否见绿色荧光以证实慢病毒是否成功感染不同哺乳类细胞.结果 按标准程序生产的携带EGFP基因慢病毒(病毒上清或浓缩后的病毒)成功高效率感染293FT细胞、MEFs或小鼠睾丸生殖细胞;用浓缩后的病毒(携带EGFP基因)感染小鼠ES细胞.亦可获得EGFP阳性的ES细胞克隆.结论 熟练掌握了慢病毒包装、浓缩及鉴定等技术.同时针对不同哺乳类细胞建立了相应的慢病毒介导的外源基因体外传递系统,这些为相关后续研究打下了良好的基础.
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真核表达人Wnt7b基因建立软骨细胞退变模型
目的：在真核细胞中表达人Wnt7b基因并且观察对大鼠原代软骨细胞的退变作用。方法取出生24 h SD大鼠关节处软骨，Ⅱ型胶原酶多次消化后获得原代软骨细胞，取P1代细胞进行实验。扩增人Wnt7b基因及克隆至PCDH-GFP上，转染PCDH-GFP和PCDH-Wnt7b至293ft细胞中，48 h后收集细胞上清及转染细胞，Western blot鉴定Wnt7b在293ft细胞中的表达。收集的上清分别稀释10倍和50倍培养大鼠软骨细胞，24 h后观察细胞形态并收集细胞蛋白和抽提RNA，Western blot和定量PCR检测软骨退变指标MMP13、MMP3、Ⅱ型胶原、A-can、ADAMTS5、ColⅩ和SOX9的表达。结果成功克隆人Wnt7b基因至PCDH-GFP载体上且在293ft细胞中得到有效表达。含Wnt7b培养基干预软骨细胞24 h后，软骨细胞形态由原来的多角形变成长梭形，Wnt7b处理组软骨细胞MMP13和MMP3表达显著上调，Ⅱ型胶原的表达下调。PCR结果表明A-can和Sox9表达下降，ColⅩ和ADAMTS5表达增强。结论有效在真核细胞中表达Wnt7b基因并且促进大鼠软骨细胞退变，建立软骨细胞退变的体外模型。
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稳定表达MACC1的胃癌BGC-823/pBaBb-puro-MACC1细胞株的建立及其肿瘤相关基因的研究基因
目的 构建含有全长肠癌转移相关基因(MACC1)的表达载体,建立稳定表达MACC1的胃癌BGC-823/pBaBb-puro-MACC1细胞系,通过基因芯片技术筛选出转染MACC1后胃癌细胞株的差异表达基因,探讨MACC1基因与差异基因之间可能的调节机制或信号通路.方法 以人胚肾293FT细胞为模板,经PCR扩增获全长MACC1 cDNA序列,将目的基因序列克隆入带有绿色荧光蛋白报告基因的pBaBb-puro表达载体,建立pBaBb-puro-MACC1表达载体.经限制性内切酶酶切鉴定、测序并转染293FT细胞观察报告基因表达情况判断是否构建成功.构建成功后的pBaBb-puro-MACC1表达载体转染人胃癌BGC-823细胞,建立稳定表达MACC1的BGC-823/pBaBb-puro-MACC1细胞.qRT-PCR及western blot检测转染细胞的MACC1基因表达,应用基因芯片技术筛选出转染MACC1基因后胃癌细胞株的差异表达基因并对其探讨研究.结果 成功扩增全长MACC1cDNA,经测序鉴定序列完全正确；转染293FT细胞可见清晰的绿色荧光表达.BGC-823/pBaBb-puro-MACC1细胞能够稳定表达MACC1.基因芯片筛选出差异基因发现上调基因33个,下调基因24个,这些差异表达基因的功能涉及多个方面.结论成功构建了含有全长MACC1cDNA的表达载体系统,建立了稳定表达MACC1的BGC-823/pBaBb-puro-MACC1细胞,通过对差异基因的分析发现MACC1可能引起胃癌细胞株BGC-823基因表达谱中一些非常重要的分子的改变,为MACC1基因进一步研究奠定了良好基础.
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稳定表达新抑癌基因WTX的胃癌BGC-823/WTX-EGFP细胞株的建立
目的 构建含有全长WTX(Wilms tumor gene on the X chromosome)目的 基因的表达载体,建立稳定表达WTX基因的胃癌BGC-823/WTX-EGFP细胞系,为WTX基因功能研究提供保障.方法 以人胚肾293FT细胞为模板,经PCR扩增获得全长WTX cDNA序列,将全长WTX目的 基因序列克隆人带有绿色荧光蛋白报告基因的pEGFP-NI表达载体,建立pEGFP-WTX表达载体.经限制性内切酶酶切鉴定、测序并转染293FT细胞观察报告基因表达情况,判断pEGFP-WTX表达载体构建是否成功.构建成功的pEGFP-WTX表达载体转染人胃癌BGC-823细胞,建立稳定表达WTX的BGC-823/WTX-EGFP细胞.qRT-PCR及免疫组化检测转染细胞WTX表达.结果 PCR方法从人胚肾293FT细胞扩增获得全长WTX cDNA,经测序鉴定序列完全正确;pEGFP-WTX质粒DNA经酶切鉴定片段大小正确、转染294FT细胞可见清晰的绿色荧光表达.BGC-823/WTX-EGFP细胞能够稳定表达WTX.结论 本研究成功构建了含有全长WTX cDNA的表达载体系统,建立了稳定表达WTX的BGC-823/WTX-EGFP细胞,为WTX基因功能研究奠定了良好基础.
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CCL20基因短发夹RNA表达载体转染人胚胎肾细胞的干扰效应
目的 观察人CCL20基因短发夹RNA表达载体(pSCS-EGFP)转染人胚胎肾细胞(293FT细胞),以及对其表达CCL20mRNA和分泌CCL20蛋白的抑制作用.方法 用脂质体转染法把构建成功的3个pSCS-EGFP质粒(其中pSCS-EGFP-1为CCL20基因错配型,pSCS-EGFP-2和pSCS-EGFP-3均为CCL20基因特异型)转染到293FT细胞,24 h后分别用荧光显微镜照相和流式细胞仪检测293FT细胞的转染率.将未转染及分别转染3种质粒的293FT细胞培养48h,用TNF-α和IL-1β刺激培养24 h后,分别用荧光定量RT-PCR和ELISA法检测CCL20基因mRNA和蛋白的表达水平,计算其抑制率.结果 3种质粒(pSCS-EG-FP-1～3)转染293FT细胞的效率分别为(73.8±5.3)%、(50.0±4.8)%、(56.8±2.9)%.加细胞因子刺激下,3种载体对293FT细胞表达CCL20mRNA相应的抑制率分别为(18.53±34.44)%、(90.40±3.94)%和(92.50±6.15)%;上清中CCL20蛋白相应的抑制率分别为(14.88±17.39)%、(71.76±8.27)%和(88.56±1.74)%.未加细胞因子刺激下,CCL20 mRNA的相应抑制率分别为(61.37±11.72)%、(84.33±12.78)%和(80.27±15.84)%;CCL20蛋白的相应抑制率分别为(19.91±48.12)%、(-27.87±50.24)%和(87.21±8.36)%.结论 特异性CCL20shRNA表达载体能明显下调细胞因子刺激人胚胎肾细胞表达CCL20 mRNA及蛋白,该载体为研究肾移植排斥反应等CCL20相关性肾脏疾病的治疗提供了一定的实验基础.
