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小鼠CXCR4基因慢病毒载体构建与真核表达
本研究旨在克隆小鼠CXC型趋化因子受体4(CXCR4)基因,构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的CXCR4重组慢病毒栽体并在真核细胞中表达.采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)以C57BL/6小鼠骨髓细胞为模板克隆全长型CXCR4基因,连接至克隆载体pCR-Blunt,经限制性内切酶酶切后亚克隆至慢病毒转移栽体,构建携带EGFP及CXCR4双顺反子结构的自身失活型重组慢病毒表达质粒；同时构建LV-IRES-EGFP作为对照质粒；通过脂质体转染法与包装质粒及包膜蛋白质粒共转染包装细胞293FT,超速离心浓缩病毒颗粒后转染293FT细胞,采用荧光显微镜和流式细胞术(FCM)检测EGFP的表达,Western blot鉴定CXCR4蛋白表达.结果表明,成功克隆小鼠CXCR4基因,构建重组慢病毒转移质粒LV-IRES-EGFP-CXCR4及对照质粒LV-IRES-EGFP,三质粒系统共转染293Fr细胞后获得病毒滴度可达到108 TU/ml.以重组慢病毒颗粒感染293FT细胞后第3天,在荧光显微镜下观察到较强绿色荧光表达,FCM检测显示感染效率可达95％,FCM及Western blot结果显示感染后293FT细胞表达CXCR4蛋白.结论:成功构建自身失活型慢病毒载体LV-IRES-EGFP-CXCR4,并在真核细胞中获得表达.
关键词： CXC型趋化因子受体4 慢病毒载体 基因表达 293FT细胞 -
沉默CXCR4基因对胃癌细胞增殖和侵袭能力的影响
目的探 讨沉默CXC型趋化因子受体4(CXCR4)基因对胃癌细胞增殖、侵袭能力的影响.方法 培养人胃癌细胞株MKN45,将细胞分为三组:空白组不转染质粒,对照组转染含无义质粒的腺病毒载体,观察组转染含靶向CXCR4-siRNA的腺病毒载体.RT-PCR检测CXCR4 mRNA的表达,MTT法检测胃癌细胞增殖情况,Transwell小室检测细胞侵袭能力.结果 与观察组相比,空白组和对照组CXCR4 mRNA表达较高(P＜0.05).观察组细胞增殖较空白组和对照组减少(P＜0.05).观察组细胞侵袭数少于对照组和空白组(P＜0.05).结论 沉默CXCR4基因能够抑制胃癌细胞的增殖及侵袭能力,CXCR4可能与胃癌的发生、发展有关.
关键词： CXC型趋化因子受体4 胃癌 -
布比他丁促进大鼠骨髓间充质干细胞CXC型趋化 因子受体4膜向分布及迁移能力的研究
目的:研究药物布比他丁(Blebbistatin)能否调节大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)表面CXC型趋化因子受体4(CXC chemokine receptor type 4,CXCR4)向胞膜分布,从而促进大鼠BMSCs的迁移.方法:分离培养SD大鼠BMSCs,Blebbistatin处理细胞15、30、45、60 min,设置对照组;流式细胞术测定细胞表面CXCR4表达;Transwell迁移实验检测细胞迁移能力;测定成骨诱导前期培养基碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,待诱导完成进行茜素红染色.结果:处理组细胞表面CXCR4表达率明显升高(P<0.01),且呈时间依赖性;15、30和60 min组细胞迁移效率升高(P<0.01).成骨诱导期间各组间ALP活性比较差异无统计学意义,诱导至21 d时各组均形成大量钙化结节.结论:Blebbistatin能促进BMSCs表面CXCR4向胞膜分布,并能提高BMSCs的迁移效率.
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蛋白酶激活受体1活化对小鼠内皮祖细胞增殖和迁移的影响
目的:研究蛋白酶激活受体1(PAR-l)活化对小鼠内皮祖细胞(EPCs)增殖和迁移的影响,及CXC型趋化因子受体4(CXCR4)的作用.方法:取对数生长期的小鼠EPCs,加入PAR-1激活剂SFLLRN(50 μmol/L)进行活化,再加入CXCR4拮抗药AMD3100使后者终浓度分别为0、50、100、200 nmol/L(即b、c、d、e组);另设不活化、不加AMD3100的为空白对照(即a组)进行比较.采用荧光定量实时聚合酶链式反应法检测各组细胞中CXCR4 mRNA表达水平,Transwell小室共培养分析EPCs的迁移能力,MTT法检测各组细胞作用24、48、72、96h后的EPCs增殖情况.结果:与a组比较,b组EPCs中CXCR4 mRNA表达水平和细胞迁移能力均明显增加(P＜0.05),细胞增殖能力增强;与b组比较,d、e组EPCs中CXCR4 mRNA表达水平明显降低(P＜0.05),c、d、e组EPCs细胞迁移能力均明显减弱(P＜0.05),增殖能力明显减慢,且呈剂量依赖性.结论:PAR-1活化能促进小鼠EPCs的增殖和迁移,其作用可能与CXCR4表达的上调有关.
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PAR-1激活对小鼠内皮祖细胞CXCR4 mRNA 表达及细胞增殖与迁移的影响
目的：研究蛋白酶激活受体-1（PAR-1）活化后对小鼠内皮祖细胞（EPCs） CXC型趋化因子受体4（CXCR4） mRNA表达及细胞增殖、迁移的影响。方法分离鉴定小鼠 EPCs ，分别以不同浓度 PAR-1激活剂SFLLRN加入培养的EPCs中，以PAR-1小干扰RNA（siRNA）转染EPCs ，并设立空白对照组。采用荧光定量实时聚合酶链反应（RT-PCR）分析各组细胞PAR-1、CXCR4 mRNA表达；MTT法检测各组EPCs增殖情况；Transwell小室共培养分析各组EPCs的迁移能力。结果 SFLLRN激活组EPCs增殖率、迁移率及PAR-1、CXCR4 mRNA表达均较空白对照组、PAR-1特异siRNA转染组增高，差异有统计学意义（ P＜0．05）。CXCR4 mRNA与PAR-1 mRNA表达呈明显正相关（r＝0．991）。结论 PAR-1可能通过促使CXCR4的表达增加，从而促进EPCs的增殖和迁移。
关键词： 内皮祖细胞 蛋白酶激活受体-1 CXC型趋化因子受体4 细胞增殖 迁移
