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过表达miR-10b促进肺癌细胞系A549增殖
目的 探讨非小细胞肺癌(NSCLC)患者肺癌及癌旁组织中miR-10b(miR-10b)表达水平及miR-10b是否通过调控锌指转录蛋白基因(KLF4)对肺癌细胞系A549恶性化的影响.方法 40例NSCLC患者病理切片,原位杂交检测肺癌及癌旁组织中miR-10b的表达量;对肺癌细胞系A549转染miR-10b mimics后,CCK-8法检测肺癌细胞增殖;real-time PCR及Western blot检测KLF4 mRNA及蛋白水平;软琼脂克隆形成实验检测过表达miR-10b对A549细胞的肿瘤恶性化程度的影响.结果 肺癌细胞A549及肺癌组织中miR-10b的表达量分别高于正常肺上皮细胞16HBE及癌旁组织;过表达miR-10b模拟物的A549细胞中,KLF4蛋白水平显著下降(P<0.05);过表达的miR-10b可显著增加A549细胞的增殖速度及在软琼脂内的成瘤性.结论 miR-10b在不同类型细胞及组织中具有分布差异性、可能是通过抑制KLF4的表达促进肺癌细胞增殖及恶性化.
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KLF4过表达抑制人白血病K562细胞系的增殖及迁移
目的 探索人锌指转录因子Krüppel样因子4(KLF4)过表达对人慢性髓系白血病细胞K562增殖及迁移能力的影响.方法 设稳定过表达KLF4的白血病K562细胞系作为实验组(命名为K562-KLF4细胞),空白K562细胞及空质粒转染的K562细胞(命名为K562-C1细胞)作为对照组.实时荧光定量PCR检测各组细胞KLF4 mRNA的表达含量;Western blot检测各组细胞KLF4的蛋白相对表达含量;MTS法检测各组细胞的增殖水平;Transwell检测各组细胞的迁移能力.结果 K562-KLF4细胞KLF4 mRNA的相对表达量比2个对照组明显增高(P<0.05);与对照组相比,K562-KLF4细胞KLF4蛋白相对表达含量明显增加(P<0.05),其过表达率为77.78%;K562-KLF4细胞增殖和迁移能力明显被抑制(P<0.05).结论 KLF4过表达能抑制K562细胞的增殖及迁移能力.
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KLF4、Ki-67和E-cadherin在宫颈鳞状细胞癌中的表达及意义
目的 观察干性转录因子KLF4及Ki-67、E-cadherin在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达,探讨三者表达的关系及其意义.方法 采用免疫组化检测KLF4、Ki-67和E-cadherin在高-中分化鳞状细胞癌(28例)、低分化鳞状细胞癌(52例)和慢性宫颈炎(26例)组织中的表达,并统计分析三者表达的关系及KLF4在宫颈鳞状细胞癌中的表达与临床病理特征的关系.结果 KLF4在慢性宫颈炎中均呈阳性表达,而宫颈鳞状细胞癌中有不同程度下调,在高及中分化宫颈鳞状细胞癌中阳性率为85.7％(24/28),低分化宫颈鳞状细胞癌中为59.6％(31/52),两者比较差异显著(P＜0.01).宫颈鳞状细胞癌中,KLF4表达与年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移及肿瘤分期无关,而与肿瘤分级有关(P＜0.05).KLF4表达与增殖指数Ki-67呈负相关(P＜0.05),而与E-cadherin呈正相关(P＜0.01).结论 KLF4在宫颈鳞状细胞癌中与细胞增殖和迁移相关,KLF4可能在宫颈鳞状细胞癌发生、发展中起重要作用.
关键词： 宫颈鳞状细胞癌 KLF4 Ki-67 E-cadherin 免疫组化 -
KLF2、KLF4预测内毒素所致急性肺损伤大鼠的研究
目的 研究Krüppel样转录因子KLF2、KLF4在内毒素诱导大鼠急性肺损伤时的动态表达,分析两者与急性肺损伤的相关性.方法 将100只SD大鼠随机(随机数字法)分为健康对照组和模型组,模型组进一步随机分成3组.模型组采用尾静脉注射LPS(5 mg/kg)复制ALI模型,分别于尾静脉注射后2、4、24h后采血及肺组织.观察各组病理表现、RT-PCR检测KLF2mRNA、KLF4 mRNA在血清中及肺组织的表达,分析KLF2、KLF4在急性肺损伤中的动态表达,采用SPSS 17.0软件进行统计学分析.结果 病理显示造模后4h肺损伤为明显,KLF2 mRNA、KLF4 mRNA在正常大鼠肺组织及血清中均有明显表达,模型组各组KLF2、KLF4的表达较对照组显著减弱(P＜0.01),其中KLF2 mRNA在2h表达明显低于4h组和24 h组(P＜0.01),KLF4mRNA在4h表达明显低于2h组和24h组(P＜0.01).结论 KLF2在大鼠急性肺损伤表达变化早于病理变化,KLF4具有同步性;KLF2、KLF4可作为急性肺损伤早期诊断的分子标志物.
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转录因子KLF4在动脉硬化中的作用
动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是危害人类健康的主要疾病之一,目前认为炎症因子、损伤和涡流可引起血管内皮功能紊乱,促进血小板黏附和血栓形成,诱导平滑肌细胞过度增生,是导致AS、斑块破裂和介入治疗后损伤血管内膜不良修复发生发展的关键环节~([1]).已有研究揭示,在血管的生成的过程中需要多种基因表达在空间上的精确性和时间上的协调性.
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食管癌组织KLF4和Survivin蛋白表达及其相关性研究
目的:通过对KLF4和Survivin蛋白在食管癌中表达的研究,结合临床病理特征,探讨KLF4和Survivin的临床意义及相关性.方法:应用免疫组织化学SP法检测85例食管癌组织及正常食管黏膜中KLF4和Survivin的表达.结果:KLF4在癌旁正常黏膜阳性表达率为89.4％,食管癌组织为42.3％(P＜0.05).低、中高分化癌的阳性表达率差异有统计学意义,P＜0.05;有、无淋巴结转移者的阳性表达率分别为30.4％和56.4％(P＜0.05)；与肿瘤WHO临床分期之间有统计学意义,P＜0.05.随着临床分期等级的增加,KLF4表达呈现递减趋势；与患者的性别、年龄无关(P＞0.05).Survivin在食管癌组织的阳性表达率为53.0％,癌旁正常黏膜为7.1％(P＜0.05)；低、中高分化癌的阳性表达率无统计学意义,P＞0.05；有、无淋巴结转移者的阳性表达率分别为65.2％和38.4％(P＜0.05)；其表达与肿瘤的临床分期差异有统计学意义,P＜0.05,与患者的性别、年龄无关(P＞0.05).Survivin和KLF4在食管癌中的表达呈负相关(r=-0.337,P＜0.01).结论:KLF4低表达及Survivin的过表达与食管癌的发生及其生物学行为密切相关,可作为食管癌诊断及分期预后的客观指标.
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锌指蛋白750在抑制食管鳞癌细胞生长中的作用及相关机制
目的：探讨锌指蛋白750（ ZNF750）在食管鳞癌中的作用及相关机制。方法裸鼠体外成瘤实验分析ZNF750敲除后对食管鳞癌细胞成瘤能力的影响，Western blot检测敲除ZNF750基因的食管鳞癌细胞株和裸鼠移植瘤中下游靶基因的表达情况，四甲基偶氮唑蓝法检测ZNF750敲除后，导入下游基因对细胞增殖的影响。结果空白对照组、非特异序列组和ZNF750敲除组的肿瘤重量分别为（137±26）mg、（161±31）mg和（463±89）mg，差异有统计学意义（P＜0．01）。敲除ZNF750基因的食管鳞癌细胞株及ZNF750敲除组的裸鼠移植瘤组织中，KLF4蛋白的表达均明显下调。在稳定敲除ZNF750的食管鳞癌细胞中导入KLF4基因，细胞的增殖能力降低（ P＜0．01）。结论 ZNF750基因可能是与食管鳞癌发生密切相关的新的肿瘤抑制基因，其可能通过调节KLF4的表达抑制食管癌细胞的生长。
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DNA甲基化和组蛋白乙酰化对人口腔鳞癌细胞中KLF4基因的调控研究
目的：探讨人口腔鳞癌中DNA甲基化和组蛋白乙酰化对KLF4基因的调控作用。方法体外培养人口腔鳞癌细胞系SCC-6,分别用DNA甲基化抑制剂5-氮-2’-脱氧胞苷(DAC)、组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A( TSA)处理SCC-6细胞,并据此将SCC-6分为4组,阴性对照组(不做处理)、DAC处理组、TSA处理组、DAC+TSA联合处理组,采用荧光定量PCR方法检测SCC-6细胞经DAC或/和TSA处理前后KLF4 RNA水平的变化；用免疫细胞化学方法检测SCC-6细胞经DAC或/和TSA处理前后KLF4蛋白的变化。结果 SCC-6细胞DAC处理组、TSA处理组、DAC+TSA 组的KLF4 RNA水平与阴性对照组相比均有显著升高(P<0.01)。另外,DAC处理组KLF4 RNA水平均高于其他3组(P<0.01)。 SCC-6细胞DAC处理组中KLF4蛋白表达明显升高,均高于其他3组(P<0.01)。 TSA处理组与DAC+TSA联合组KLF4蛋白表达也都高于阴性对照组(P<0.01)；TSA处理组与DAC+TSA处理组间无显著差异(P>0.05)。结论在口腔鳞状细胞癌SCC-6细胞中导致KLF4基因沉默的主要原因可能为DNA甲基化,此外组蛋白乙酰化可能也参与了KLF4表达的调控,但组蛋白乙酰化在提高KLF4表达方面与去甲基化无明显协同作用。
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KLF4对口腔鳞癌细胞增殖的抑制作用
目的 探讨KLF4对人口腔鳞癌细胞CAL27的增殖抑制作用.方法 构建KLF4慢病毒表达载体,并转染人口腔鳞癌细胞系CAL27,转染不含KLF4开放读码框的慢病毒载体LV105作为对照.采用RT-PCR、免疫细胞化学法对KLF4表达进行鉴定.MTT实验、流式细胞术检测KLF4对口腔鳞癌细胞系CAL27的增殖抑制作用.结果 RT-PCR、免疫细胞化学实验均表明实验组细胞KLF4的表达明显高于对照组(P＜0.01).MTT实验结果表明与对照组CAL27/LV105组相比,CAL27/KLF4能够抑制细胞的增殖能力(P＜0.01).CAL27/KLF4主要通过使细胞周期中的G2/M期阻滞来抑制CAL27细胞的增殖(P＜0.01).结论 KLF4转染能够抑制口腔鳞癌细胞系CAL27的增殖能力,可能在口腔鳞状细胞癌中作为抑癌基因发挥作用.
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Krüppel-like factor 4在小鼠舌黏膜癌变过程中的表达
目的 检测Krüppel-like factor4 (KLF4)在小鼠舌黏膜癌变模型中的表达,探讨KLF4与口腔黏膜癌变的关系.方法 选用C57BL/6J小鼠75只,其中阴性对照组15只,饮用纯净水;实验组小鼠60只,饮用4-硝基喹啉-1-氧化物(4NQO)水溶液(50μg/ml).实验组分别在第8、12、16、24周末各处死15只小鼠,取舌组织,观察并记录标本的大体损害,将其固定在10％中性福尔马林溶液中,用于HE染色及KLF4免疫组织化学染色.结果 在4NQO的诱导下,成功构建了小鼠舌黏膜癌变模型.HE染色结果显示,随着4NQO处理时间的延长,小鼠舌黏膜病变逐步加重,呈现出从单纯增生、异常增生到癌的变化.免疫组化结果显示,KLF4在口腔癌变过程中呈现动态变化,与正常口腔黏膜上皮相比,KLF4在单纯增生、异常增生上皮中的表达没有明显变化,但在鳞癌中,KLF4的表达量明显下降,具有显著性差异(P＜0.01).结论 KLF4可能在口腔黏膜上皮癌变过程中发挥抑癌基因的作用.
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Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4基因慢病毒载体的构建
目的 构建Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4基因慢病毒表达载体,为诱导性多能干细胞研究奠定基础.方法 将Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4基因利用Infusion技术重组构建慢病毒载体穿梭质粒pGC-FU-Oct4、pGC-FU-Sox2、pGC-FU-c-Myc、pGC-FU-Klf4,经PCR和测序后与与结构质粒pHelper1.0和包膜质粒pHeiper2.0在脂质体Lipofeetamine2000介导下共转染293T细胞包装生产慢病毒,浓缩纯化后检测滴度.结果 PCR扩增和测序结果证实成功构建Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4的慢病毒载体并包装慢病毒,检测Oct4基因重组慢病毒、Sox2基因重组慢病毒、c-Myc基因重组慢病毒的滴度均为1×109TU/mL,Klf4基因重组慢病毒的滴度为1.9×109 TU/mL.结论 成功建立重组慢病毒载体的三质拉包装细胞系统.
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雌雄激素协同作用联合KLF4发挥抗动脉粥样硬化效应探究
目的 探讨睾酮、雌二醇和KLF4与急性心肌梗死相关性,评估其对冠心病的临床应用价值.方法 选择2017年1～5月我院心内科住院急性心肌梗死男性患者162例为试验组,134名健康男性为对照组.血清KLF4浓度采用酶联免疫吸附法测定,血清雌、雄激素检测采用化学发光免疫法测定.结果 对照组睾酮浓度高于试验组[(450.05±14.42)ng/dl比(33.49±2.43)ng/dl,P＜0.01];试验组雌二醇较对照组明显升高[(277.32± 13.84)pg/ml比(37.68-± 1.29)pg/ml,P＜0.01];试验组KLF4浓度较对照组明显升高[(38.53±5.61)ng/ml比(15.83±2.99)ng/ml,P＜0.01].在AMI相关性分析中,KLF4与睾酮呈负相关,KLF4与雌二醇呈正相关(P＜0.05).结论 雌、雄激素协同作用联合KLF4对防治动脉粥样梗化(AS)具有临床应用价值,为冠心病防治提供新的治疗思路.
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Krüppel样锌指转录因子在内皮细胞中的生物学作用
Krüppel样锌指转录因子(Krüppel-like transcription fac-tom,KLFs)是spl/Krüppel样转录因子(Spl-like and Krüappel-like transcription factors,Spl/KLFs)家族中的一个亚家族.在Spl/KLFs家族中spl首先被克隆和纯化,在SV40启动子中Spl通过3个C2H2锌指与富含CC的位点特异性结合.在果蝇属胚胎调节因子Krüppel中也存在类似的DNA结合区,随后具有与Spl高度相似锌指结构的其他转录因子相继发现,形成一个Spl/KLFs家族[1].
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KLF4在低氧诱导肺动脉平滑肌细胞增殖及表型转化中的作用初步研究
目的：本实验通过观察低氧诱导大鼠原代肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cell,PASMC)增殖与分化标志改变过程中,krǖppel 样因子4(krǖppel-like factor 4, KLF4)表达的变化,并检测 KLF4过表达对该过程的影响,探讨 KLF4是否在其中担当一定作用。方法采用贴片法培养原代 PASMC,低氧(5%O 2)培养24 h、48 h、72 h 后,以正常氧浓度培养细胞为对照,采用实时荧光聚合酶链反应(real-time PCR)、Western blot 及免疫共沉淀方法,观察低氧24 h、48 h、72 h,PASMC 中 KLF4乙酰化水平及表达水平的变化。cck-8检测细胞增殖情况,碘化丙啶(PI)染色检测细胞周期,提取细胞总 RNA 和蛋白,采用 real-time PCR、Western blot 方法检测细胞中增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达水平,综合分析低氧对细胞增殖的影响,同时采用 real-time PCR、 Western blot 方法检测 PASMC 分化标志物平滑肌肌动蛋白α(smooth muscleα-action,SMα-actin)的表达水平。通过转染 KLF4表达质粒,提高 PASMC 中 KLF4的表达水平,检测细胞周期、增殖活力及 PCNA、SM α-actin 的变化,观察低氧下 KLF4过表达对PASMC 增殖、分化的影响。结果低氧24 h,PASMC 中 KLF4表达水平均较常氧培养细胞明显增高,期间 SMα-actin 表达较常氧培养细胞明显减少,PASMC 增殖不明显。随后 KLF4表达水平逐渐降低,至72 h 降低至正常水平,而 SMα-actin 逐渐增高,同时 PASMC 增殖活力明显增强,S 期细胞逐渐增多。KLF4过表达后,低氧刺激 PASMC 增殖活力明显降低,SMα-actin 表达水平也降低,细胞阻滞于 G1期。结论低氧诱导 PASMC 发生去分化与增殖不同步；KLF4参与调节低氧诱导的PASMC 表型转化与增殖过程,该作用涉及 KLF4乙酰化水平改变。
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慢性骨髓增殖性疾病患者JAK2 V617F点突变和KLF4 mRNA表达及其相关性的研究
目的 探讨JAK2 V617F基因突变与KLF4 mRNA表达水平与BCR/ABL阴性的慢性骨髓增殖性疾病(CMPDs)的关系.方法 用AS-PCR技术检测各组JAK2 V617F点突变、RT-PCR技术检测各组KLF4 mRNA的表达水平.根据结果分成阳性、阴性2组.结果 JAK2 V617F基因突变在慢性特发性骨髓纤维化(IMF)中阳性率55.6%(5/9),原发性血小板增多症(ET)中阳性率57.7%(15/26),真性红细胞增多症(PV)中阳性率88.5%(23/26).慢性嗜中性粒白血病(CNL)、急性白血病(AL)、对照组均没有阳性病例.KLF4 mRNA在每例样本中均有表达,KLF4 mRNA表达水平在PV组显著高于其他各组(P<0.05).结论 BCR/ABL融合基因阴性CMPDs患者存在高频率的同一种分子异常--JAK2 V617F点突变,该突变与BCR/ABL阴性的CMPDs发病之间存在明显的关联.JAK2 V617F突变导致了KLF4 mRNA表达的增高.
关键词： JAK2 V617F KLF4 骨髓增殖性疾病 -
KLF4基因表达与JAK2 V617F点突变的关联性研究
目的 检测骨髓增殖性疾病(MPDs)中JAK2 V617F点突变与锌指蛋白转录因子(KLF4 mRNA)表达,探讨JAK2 V617F点突变与KLF4 mRNA表达水平与BCR/ABL阴性的MPDs的关系.方法 用等位基因特异性聚合酶链反应(AS-PCR)技术检测4组JAK2 V617F点突变,根据结果分为阴性、阳性.反转录特异性聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测4组KLF4 mRNA的表达水平.结果 BCR/ABL阴性的MPDs的62例患者中JAK2 V617F 基因突变慢性特发性骨髓纤维化(IMF)中有5例,阳性率55.56%(5/9), 原发性血小板增多症(ET)中有15例,阳性率57.69%(15/26),真性红细胞增多症(PV)中有23例,阳性率88.46%(23/26),慢性嗜中性白血病1例.慢性粒细胞性白血病(CML)、急性白血病(AL)、对照组均没有阳性病例.KLF4 mRNA在每例样本中均有表达.KLF4 mRNA表达水平在PV组显著高于其他3组(P＜0.05).结论 BCR/ABL融合基因阴性的MPDs患者存在高频率JAK2 V617F点突变,KLF4 mRNA在PV患者中高表达.JAK2 V617F突变导致了KLF4基因表达的增高.JAK2 V617F突变阳性的ET患者,易出现并发症.AS-PCR是一种简单、有效检测JAK2 V617F突变方法.
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沉默KLF4表达对人肝星状细胞HSC-LX2生物学行为的影响
目的 筛选有效沉默KLF4基因表达的siRNA,观察KLF4基因沉默对人肝星状细胞HSC-LX2生物学行为的影响.方法 设计并化学合成针对人KLF4基因的3对siRNA(siRNA1、siRNA2、siRNA3),转染人肝星状细胞HSC-LX2,以转染非特异siRNA作为阴性对照.采用实时荧光定量RT-PCR(Real-time RT-PCR)和Western blot方法分析KLF4 mRNA和蛋白的表达情况,筛选出沉默KLF4效果好的1个siRNA,将其转染入HSC-LX2后,用MTT法检测KLF4沉默对HSC-LX2增殖的影响.采用ELISA法检测细胞培养上清中的转化生长因子1(transforming growth factor,TGF-1)、白介素1(interleukin-1,IL-1)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表达情况.结果 Real-time RT-PCR和western blot均显示siRNA3沉默效果好.故后续试验均采用siRNA3沉默KLF4的表达.MTT实验结果 显示,在转染siRNA3,12 h、24 h和48 h后,细胞活力出现明显下降.ELISA结果 显示,转染siRNA3,48 h以后,TGF-β1、TNF-α、IL-1β表达量也明显降低.结论 siRNA3可有效沉默KLF4基因表达,KLF4基因沉默可以抑制HSC-LX2的增殖,影响其生物学行为,使细胞中的促进胶原表达的三种细胞因子TGF-1、TNF-α以及IL-1表达量下降.
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氧化应激对C2C12肌原细胞中KLF4表达的影响
.结论:细胞氧化应激反应能显著诱导C2C12肌原细胞中KLF4的高表达.
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Klf4基因在人神经胶质瘤细胞U251中的稳定表达
目的:建立稳定表达Klf4基因的神经胶质瘤细胞U251 ,为探讨该基因在神经胶质瘤细胞中的功能奠定基础.方法:以低表达Klf4基因的人胶质瘤细胞系U251为材料,以Klf4基因转染U251细胞系,G418筛选,获取G418抗性单克隆进行培养,扩增后分别用免疫荧光技术、免役印迹技术(Western blot)验证获得的表达细胞株.结果:经转染和G418筛选后,荧光显微镜下见有明显表达Klf4基因的细胞,Western blot检测到转染基因Klf4后细胞KLF4蛋白的表达增高,而作为对照的转空载体的细胞Klf4的表达较低.结论:该方法成功建立了稳定转染基因Klf4的人胶质瘤U251细胞系,为进一步探讨该基因在肿瘤细胞的功能奠定了一定基础.
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microRNA-92a在弥漫大B细胞淋巴瘤患者中的表达及可能机制
目的 分析miR-92a在弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者中的表达与临床病理特征的关系,观察miR-92a对弥漫大B淋巴瘤细胞系OCI-LY10增殖、侵袭能力的影响.方法 采用实时荧光定量PCR方法检测86例DLBCL患者肿瘤组织和22例正常淋巴结组织中miR-92a的表达,分析miR-92a表达水平与患者临床病理特征的关系.对弥漫大B淋巴瘤细胞系OCI-LYl0进行miR-92a反义核苷酸(ASO)转染并培养,MTT法检测细胞增殖能力,Transwell小室检测细胞侵袭能力,real-time PCR方法与Western blot方法检测细转染miR-92a ASO后各组细胞KLF4的mRNA和蛋白的表达.结果 DLBCL患者淋巴结组织中miR-92a表达水平显著高于对照组(P＜0.05).miR-92a在DLBCL患者中的表达与疾病分期显著相关(P＜0.05),但与患者年龄、性别无关(P＞0.05).与对照组相比,miR-92a ASO组OCI-LYl0细胞的增殖侵袭能力明显降低,KLF4蛋白与mRNA表达水平显著升高(P＜0.05).结论 miR-92a在DLBCL中表达上调,其促进OCI-LY10细胞增殖侵袭的作用机制可能与下调KLF4蛋白表达有关.
