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旋毛虫抗原基因Ts87在真核细胞中的表达
目的在体外真核细胞COS7中表达重组质粒pcDNA3.1/Ts87,为旋毛虫病DNA疫苗的研究奠定基础. 方法将重组质粒pcDNA3.1/Ts87经脂质体Lipofectamine介导,体外转染真核细胞COS7,通过细胞免疫组化,细胞裂解物的SDS-PAGE电泳和Western-blot分析检测表达产物. 结果重组质粒能够在COS7中表达出约38 ku的目的蛋白,并能够被旋毛虫阳性血清特异识别. 结论构建的重组质粒可在体外真核细胞COS7中成功表达.
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KGF基因在COS7细胞中的表达及其活性检测
目的:利用COS7细胞表达角质细胞生长因子(KGF)并检测其活性.方法:利用脂质体把KGF基因转入COS7细胞中,再用Western印迹和ELISA方法检测KGF蛋白的表达,然后用MTT法检测其活性.结果:KGF基因在COS7中得到了表达,并对小鼠肠上皮细胞(IEC-6)具有刺激增殖作用.结论:KGF有望成为肠型放射病治疗的新型药物.
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人骨保护素在COS7细胞内的瞬时表达
目的:在COS7细胞内初步表达入骨保护素(OPG)并观察其表达水平.方法:将OPG的重组表达载体pcDNA3.1/OPG-GFP-转染COS,细胞进行瞬时表达,经RT-PCR和ELISA鉴定表达载体的功能及表达水平.结果:以人OPG全长编码序列构建的OPG表达载体pcDNA3.1/OPG-GFP-,通过瞬时表达实验证实了该载体具有表达OPG的功能.结论:通过基因克隆技术可以成功构建有表达OPG功能的哺乳类表达载体,为后续的高效、稳定表达OPG奠定了基础.
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大鼠热休克蛋白72基因真核表达载体构建及在COS7细胞中的表达
背景:体外克隆、表达热休克蛋白,尤其正常时少量或不表达,而应激时大量表达的热休克蛋白72对研究其缺血再灌注损伤中的作用尤为重要.目的:构建热休克蛋白72基因真核表达载体并于COS7细胞内表达,为HSP72蛋白免疫调节功能的研究奠定基础.方法:采用RT-PCR技术从BABL/C大鼠肝细胞中扩增出热休克蛋白72 cDNA,经限制性核酸内切酶消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1(+)的相应酶切位点,并将重组质粒转染COS7细胞,进行基因表达鉴定.结果与结论:重组质粒插入基因序列检测证实为热休克蛋白72 cDNA,并能在COS7细胞稳定表达.成功构建热休克蛋白72真核表达载体,并于COS7细胞中成功转录与表达.
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人DC-SIGN绿色荧光融合蛋白真核表达与功能鉴定
目的:构建人DC-SIGN绿色荧光融合蛋白的真核表达载体,在COS7细胞表面表达鉴定.方法:用RT-PCR从人外周血单个核细胞扩增DC-SIGN蛋白基因片段,连接到T载体.测序鉴定后切下相应片段,连接到pEGFP-C1表达载体,重组质粒(命名为:DS-pEGFP-C1)转染COS7细胞,表达DC-SIGN绿色荧光融合蛋白(命名为:DS-EGFP).荧光定量PCR检测融合基因mRNA拷贝量,激光扫描共焦显微镜鉴定DS-pEGFP-C1的表达和摄取减毒牛型分枝杆菌BCG功能.结果:用RT-PCR扩增得到正确的目的基因片段并构建成真核表达载体DS-pEGFP-C1,转染COS7细胞,荧光定量PCR检测DS-pEGFP-C1转录mRNA拷贝量是4.52×1011 copies/ml,激光扫描共焦显微镜检测证实DS-EGFP在COS7细胞表面表达,同时具有摄取BCG的功能.结论:本研究成功构建人DC-SIGN绿色荧光融合蛋白的真核表达载体DS-pEGFP-C1,表达了融合蛋白,后者能够摄取BCG.
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突变型和野生型MBL基因在COS7细胞中的瞬时表达
采用PCR技术,从质粒pMBLm52、pMBLm54和pMBLm57中分别获取含CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAA点突变的人甘露聚糖结合凝集素(MBL)突变体全长编码区cDNA序列,将其分别插入质粒pcDNA4/HisMax C中,构建成相应的3种真核表达载体.将各突变型MBL基因的真核表达载体和野生型MBL基因真核表达载体以脂质体法分别转染COS7细胞.72 h后,以双抗体夹心ELISA技术检测各细胞培养上清中目的蛋白的含量分别为0.980 μg /ml、0.971 μg /ml、0.900 μg /ml和1.047 μg /ml;用One-way ANOVA分析这些目的蛋白的含量无显著性差异(P＞0.05).因此,MBL结构基因的点突变并不影响MBL蛋白的合成与分泌.
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人FcγRⅡ真核表达质粒的构建及稳定转染细胞系的建立
目的:建立稳定表达人FcγRⅡ(human Fc gamma receptor Ⅱ ,huFcγRⅡ)的真核细胞系,为后续研究奠定基础.方法:采用RT-PCR方法从人外周血白细胞合成FcγRⅡcDNA,构建huFcγRⅡ表达质粒pcDNA3-huFcγRⅡ,经酶切和PCR鉴定后,将pcDNA3-huFcγRⅡ质粒通过脂质体转染法转染COS7细胞,并经G418筛选获得稳定表达huFcγRⅡ的细胞克隆.采用免疫荧光法和玫瑰花环试验检测huFcγRⅡ的表达.结果:构建的pcDNA3-huFcγRⅡ真核表达质粒经酶切鉴定与预期一致,稳定转入COS7细胞后,经免疫荧光染色,约90%的转染细胞可见荧光,而未转染的COS7对照细胞未见荧光.结论:成功构建pcDNA3-huFcγRⅡ真核表达质粒,建立了稳定表达huFcγRⅡ的细胞系,为进一步研究奠定了基础.
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小鼠ACE2基因的克隆和体外表达以及序列分析与组织分布
目的:深入研究血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)在心血管疾病发病机理中的作用及在高血压基因治疗中的应用,克隆和体外表达小鼠ACE2基因,并进行核苷酸和氨基酸序列分析和组织分布特征研究.方法:采用RT-PCR方法,从小鼠肾组织中扩增出ACE2基因的全长cDNA序列,TA克隆到pGEM-T easy载体,亚克隆到pcDNA3.1+载体,构建重组真核表达质粒pmACE2,测序鉴定.采用脂质体法将pmACE2转染Cos7细胞,分别用RT-PCR和SDS-PAGE检测ACE2的转录和表达.CLUSTALX 1.8生物软件分析小鼠和大鼠及人ACE2蛋白的多序列比较.采用RT-PCR技术研究小鼠ACE2组织分布的特异性.结果:①RT-PCR扩增片段约2.6 kb,重组真核表达质粒pmACE2测序结果表明,克隆片段存在A701G、T1102C和T1330C 3处变异,其序列与以往报道不一致,cDNA全长为2 397 bp,而与NCBI Refseq数据库(XM-136130)中cDNA全长1 902 bp不符;②SDS-PAGE显示pmACE2表达产物的相对分子量约80 kD;③氨基酸序列分析表明,小鼠ACE2主要由N末端的信号肽序列(第1-18位残氨)、含有锌结合位点保守序列HHEMGHIQ(第373-380位残氨)的催化结构域和跨膜结构域(第738-765位残氨)组成;④小鼠ACE2与人有84%的相似性,与大鼠有90%的相似性,三者同源;⑤ACE2在肺、心和肾组织中大量表达,在睾丸和肝组织中也有表达.结论:成功克隆并体外表达了小鼠ACE2基因,不同物种ACE2组织分布的特异性不尽相同.
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人IL-26的基因克隆及其真核表达载体的构建
目的:克隆人白细胞介素-26(human interleukin-26,hIL-26)基因,构建其真核表达载体并探讨在真核细胞中的表达.方法:提取人外周血单个核细胞总RNA,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增hIL-26基因;目的片段与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌E.coli-DH5α,菌落PCR、酶切分析和DNA序列分析鉴定重组克隆.用SalⅠ和EcoR Ⅰ将目的片段切下,插入pIRES2-EGFP的相应位点,构建表达载体pIRES2-EGFP/hIL-26并进行酶切鉴定.将重组质粒用非脂质体试剂Fugene 6转染至COS7细胞中.结果:重组克隆载体pMD18-T/hIL-26内插入片段序列与GenBank上报道的hIL-26基因序列完全一致;pIRES2-EGFP/hIL-26经酶切鉴定与预期结果一致;荧光显微镜观察可见转染后的细胞有荧光出现,Western blotting鉴定证明hIL-26基因得到了有效表达.结论:成功构建了hIL-26基因的真核表达载体并在真核细胞中获得了有效表达.
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人骨保护素哺乳类表达载体的构建及初步表达
目的 构建人骨保护素(OPG)哺乳类表达载体并在非洲绿猴肾COS7细胞内初步表达. 方法 用RT-PCR方法 将人OPG cDNA的全长编码基因扩增后,将其克隆于哺乳动物表达载体pcDNA3. 1/CT-GFP上,构建OPG的重组表达载体pcDNA3.1/OPG-GFP.将其转染COS7细胞进行瞬时表达,经RT-PCR和ELISA鉴定表达载体的功能及表达水平.结果 成功地获取了人OPG全长编码序列并构建了OPG的表达载体pcDNA3.1/OPG-GFP;瞬时表达试验证实该载体具有表达OPG的功能.结论 采用基因克隆技术成功构建了有表达OPG功能的哺乳类表达载体;此为高效、稳定表达OPG的研究奠定了基础.
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重组鸡Igλ轻链真核细胞分泌表达及其单克隆抗体的制备与鉴定
目的: 构建重组载体pcDNA-λ并在COS7细胞分泌表达鸡Igλ轻链, 制备抗鸡Igλ轻链的单克隆抗体(mAb).方法: PCR扩增带有信号肽的鸡Igλ轻链基因, 限制性酶切消化后, 定向克隆于真核表达载体pcDNA3, 构建具有6×His标签、分泌表达的重组载体pcDNA-λ.重组载体转染COS7细胞后, SDS-PAGE分析真核表达载体pcDNA-λ在COS7细胞的分泌表达.用2×106个雏鸡B淋巴细胞免疫BALB/c小鼠, 取脾细胞与骨髓瘤细胞融合, 分别采用细胞免疫荧光和间接ELISA筛选阳性杂交瘤克隆.结果: 成功构建分泌表达鸡Igλ轻链的重组载体, SDS-PAGE分析表明在COS7细胞上清有目的蛋白的分泌表达.杂交瘤细胞经筛选与鉴定, 获得2株分泌抗鸡Igλ轻链mAb的杂交瘤细胞株, Western blot检测到该mAb对重组鸡Igλ轻链的反应性.结论: 构建了重组表达载体pcDNA-λ并在COS7细胞上清分泌表达了重组鸡Igλ轻链.并用淋巴细胞杂交瘤技术成功筛选出抗鸡Igλ轻链mAb.为深入研究鸡Igλ轻链的结构与功能奠定了基础.
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TEF-1δ基因真核细胞稳定表达系统的构建与鉴定
目的: 构建TEF-1δ (mouse translation elongation factor-1δ) 的稳定表达系统.方法: 采用磷酸钙介导转染技术和G418细胞筛选法,以pcDNA3.1/V5-His-TOPO为表达载体,构建了TEF-1δ转基因CHO和COS7细胞系,Western Blot分析与鉴定表达蛋白.结果: 在10株转染和经G418反复筛选的CHO细胞系中,有3株(编码为COH-pcDNA3.1-TEF-1δ#3,#6,#14)具有高效稳定表达的TEF-1δ编码蛋白质(Mr约31×103),其余CHO细胞株的TEF-1δ蛋白质表达相对较弱或无表达.在4株转染和经G418反复筛选的COS7细胞系中,4株细胞(编码为COS7-pcCDNA3.1-TEF-1δ #4,#8,#14和#17)均有高效稳定的TEF-1δ编码蛋白表达,相应的无转染组及载体对照组的CHO和COS7细胞均无TEF-1δ蛋白质表达.结论: 这两类TEF-1δ转基因哺乳动物细胞稳定表达系统已成功构建与鉴定,该表达系统的建立对于TEF-1δ这一新基因的生物学功能研究,尤其是镉的致癌作用与致癌机制的研究有重要应用价值.
关键词： TEF-1δ基因 稳定转染 CHO细胞 COS7细胞 Western blot
