首页 > 文献资料
-
利用红花瞬时表达aFGF-GFP融合基因的研究
目的:利用红花表达aFGF可以使aFGF的组织创伤修复的活性和红花的活血通经、散瘀止痛以及跌打损伤等功效累加,直接用于外伤修复.方法:利用分子生物学方法构建aFGF与GFP的融合基因载体,通过农杆菌介导法将其转化到红花中,形成抗性红花愈伤组织后,利用荧光显微镜进行检测.结果:通过PCR分别扩增了aFGF和GFP基因片段,确定出PCR反应体系和佳反应条件,合成了融合基因片段aFGF-CFP,成功构建了植物荧光表达载体pCAMB认1390::35S::aFGF-GFP,用其转化红花,获得的抗性愈伤组织在蓝色光激发下能发出强烈的绿色荧光.结论:抗性红花愈伤组织中的GFP表达效果良好,初步判断aFCF基因在植物细胞中也已经表达.
-
汉坦病毒84Fli株S和M片段基因克隆、序列分析及在真核细胞中表达的研究
目的克隆汉坦病毒84Fli株S,M片段,测定这些基因的核苷酸序列,用瞬时表达了解S和M片段在真核细胞中的表达.方法以我国分离的汉坦病毒84Fli株感染的Vero-E6细胞提取总RNA,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增其S及M片段的全长cDNA.然后将84Fli株的S,M片段cDNA基因分别克隆入pCR2.1-TOPO载体中,随机挑选其中的3个克隆测定核酸序列,确定汉坦病毒84Fli株S和M片段核苷酸序列.根据S和M片段核苷酸序列设计引物,PCR扩增S及M片段的编码区,构建了真核表达质粒pcDNA3/84SC及pcDNA3/84MC.用质脂体法把质粒转入COS7细胞,瞬时表达NP及G1和G2糖蛋白.用免疫荧光(IFA)、Western blot和免疫沉淀方法检测核蛋白及糖蛋白的表达.结果汉坦病毒84Fli株的基因组S片段长度为1 688个核苷酸,编码430个氨基酸.汉坦病毒84Fli株的基因组M片段长度为3 616个核苷酸,编码1 136个氨基酸.用免疫荧光(IFA)检测S和M片段在COS细胞中的瞬时表达为阳性.Western blot结果显示,存在有相对分子质量为50 000左右的核蛋白表达,免疫沉淀法显示有核蛋白、G1和G2糖蛋白的表达.结论 84Fli株病毒和其他汉滩病毒在核苷酸序列上虽有差异,但在氨基酸水平上的同源性仍很高,成功地在COS7细胞中瞬时表达了汉滩病毒的核蛋白及糖蛋白.
-
SARS-CoV N蛋白对真核细胞基因谱的影响
N蛋白位于SARS冠状病毒(SARS-CoV)颗粒的核心,是SARS-CoV的主要结构蛋白之一,它可以与病毒基因组RNA结合.目前研究表明N蛋白可以选择性激活AP-1(activator protein 1)信号转导途径;并发现在压力条件下(即缺乏生长因子时),N蛋白可以诱导COS-1细胞凋亡和肌动蛋白重组.本文研究了体外转染N蛋白真核表达载体后细胞基因转录水平的变化.通过长寡核苷酸芯片和SAM统计学处理,得到了瞬时表达N蛋白的真核细胞转录谱.N蛋白对哺乳动物细胞转录的影响可能与SARS-CoV的致病机理相关.
-
含CpG基序的大肠杆菌DNA对柯萨奇病毒基因免疫的增强作用
柯萨奇病毒B组(CVB)有6个血清型,即CVB1～6.由于CVB血清型多,采用传统疫苗预防本病难度较大.为此我们构建了CVB1/B3型VP1基因重组质粒pCR3-uniB1B3,将该重组质粒转染后进行RT-PCR及免疫荧光检测,证明该表达系统可以在细胞内获得瞬时表达,并应用该质粒免疫BALB/c小鼠,免疫后小鼠体内产生了相应的抗体,但是其抗体水平并不令人满意.为了获得更好的免疫效果,本研究探讨了大肠杆菌CpG DNA作为免疫佐剂以期增强pCR3-uniB1B3的免疫效果.
-
HCV-Fc融合基因疫苗真核表达载体的构建及表达
目的:构建能表达HCV C-Fc融合基因的真核表达载体,为进一步修饰和转染树突状细胞,制备能高效表达HCV C和Fc基因的树突状细胞疫苗做准备.方法:用分别含有Kpn Ⅰ和XholⅠ酶切位点的HCV C区基因上、下游引物,以含有HCV H株基因序列的质粒pBRTM/HCVl-3011为模板,通过PCR扩增获得HCV C区基因片段回收后,以Kpn Ⅰ和Xhol Ⅰ双酶切,定向插入到含IgGl Fc基因的质粒pIgC3双粘端位点之间,获得重组表达质粒pHCVFc.通过Kpn Ⅰ双位点酶切、PCR及插入片段序列测定对质粒进行了鉴定.以抗HCV C单克隆抗体为一抗,利用间接免疫荧光法检测了pHCV-IgFc在人肝癌细胞7 721中的瞬时表达.结果:酶切、PCR及测序鉴定证实,pHCV-IgFc插入片段为HCV C区基因片段,免疫荧光法检测表明其可以在7 721细胞中瞬时表达.结论:构建的质粒pHCV-IgFc可以在7721细胞中瞬时表达HCV C区基因,为研究HCV C-Fc融合基因修饰的树突状细胞的功能奠定了基础.
-
人转化生长因子β1重组腺病毒体外转染羊传代椎间盘及软骨细胞的比较生物学研究
椎间盘及软骨退变的生物治疗是近年来研究的热点.转化生长因子β1(TGF-β1)重组腺病毒作为基因治疗的高效载体,几乎可以转染所有的体细胞表达目的蛋白,而达到生物治疗的目的.我们以人TGF-β1重组腺病毒载体(Ad/hTGF-β1),分别感染体外扩增的取自同一山羊个体的椎间盘及软骨细胞,对转染后的瞬时表达及二者的生物学行为进行了比较研究,为以生物学方法尤其是组织工程技术修复椎间盘退变提供依据.
-
过表达野生型和突变型α-synuclein的细胞毒性实验研究
α-synuclein是一个广泛分布于中枢神经系统突触前末梢的小分子蛋白,近年来发现α-synuclein基因突变G209A 或G88C可引起家族性帕金森病(PD),但α-synuclein在神经元变性过程中的作用目前尚不清楚.本试验构建了野生型和突变型α-synuclein真核表达质粒 pEGFP-N1/α-synuclein(wt/mut),并在PC12细胞中瞬时表达,观察野生型和突变型α-synuclein在细胞内的分布情况,了解α-synuclein(wt/mut)对PC12细胞形态和活性的影响.
-
新型抗EGFR人源化抗体基因的构建和表达
目的:构建并表达进一步人源化且效果显著增强的抗EGFR抗体.方法:通过计算机辅助设计的结果,合成新型抗EGFR抗体的轻链和重链可变区序列,拼接成完整的轻链和重链基因并克隆入pIRES双表达载体.瞬时转染293T细胞,用rProtein A亲和层析柱从细胞培养上清中纯化抗体,并进行SDS-PAGE和免疫印迹鉴定.采用Biacore3000技术检测抗体结合抗原的能力;细胞侵袭实验初步检测抗体的功能.结果:成功构建3种不同突变体表达载体C2、C3和C5,纯化的抗体在还原SDS-PAGE中表现为相对分子质量约为25×10~3和50×10~3两条带;免疫印迹分析表明,该人源化抗体可与羊抗人IgG特异性结合.Biacore3000实验结果表明,C3抗体与抗原具有良好亲和活性(亲和力为6.13×10~(-10) mol/L);细胞侵袭实验结果表明,C2和C3抗体对肿瘤细胞生长迁移均具有一定的抑制作用.结论: 成功构建、表达了3种抗EGFR人源化抗体C2、C3和C5,其中C3具有良好的抗原结合能力和抑制肿瘤细胞生长迁移能力.
-
新型抗uPAR人源化抗体的表达和活性检测
目的 制备抗尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)人源化抗体并初步检测它们与抗原的亲和能力.方法 通过计算机辅助设计的结果,合成新型抗uPAR抗体的轻链和重链可变区基因序列,通过重叠PCR方法,拼接成完整的轻链和重链基因并克隆入pIRES双向表达载体.瞬时转染293T细胞,收取细胞上清,rProtein A亲和层析法纯化目的 抗体,并进行SDS-PAGE和免疫印迹鉴定,采用Biacore3000技术检测抗体与抗原的结合能力.结果 成功构建5种表达载体S1～S5,纯化的抗体在还原SDS-PAGE中表现为相对分子质量约为25×103和55×103两条带;免疫印迹分析表明,该人源化抗体可与羊抗人IgG特异性结合.Biacore3000实验结果表明,S2、S4和S5抗体与抗原具有良好的亲和活性,且素和活性分别为1.74×10-8,1.49×10-8和1.05×10-8 mol/L.结论 成功构建并表达了5种抗uPAR人源化抗体,其中S2、S4和S5具有良好的抗原结合能力.
-
6A8α-甘露糖苷酶酶解p-nitrophenyl-α-D-mannopyranoside
目的明确6A8 cDNA编码蛋白质的α-甘露糖苷酶性质.方法利用基因重组技术将克隆到的3个DNA片段拼接成完整6A8 cDNA,将其插入到真核表达载体pCDI,转染COS-7细胞,用酶活性检测与Western blot对瞬时表达的蛋白质的性质进行鉴定.结果拼接后的cDNA片段经测序完全符合6A8 cDNA碱基顺序.转染重组表达载体pCDI-6A8的COS-7细胞的匀浆对p-nitrophenyl-α-D-mannopyranoside的酶解作用为转染空载体pCDI的细胞及野生型细胞的3～4倍,且这种酶解作用不能被swainsonine所抑制.Western blot检测显示在相对分子质量(Mr)120 000处有一明显蛋白带,此带的显影于转染pCDI-6A8 cDNA的细胞明显深于转染空载pCDI及野生型细胞.结论6A8 cDNA编码的蛋白质确为一种α-甘露糖苷酶,属于Ⅱ类α-甘露糖苷酶.
-
体外表达探讨凝血因子Ⅸ Arg327Ile新突变导致血友病B的分子发病机制
目的 探讨凝血因子Ⅸ(FⅨ)Arg327Ile(R327I)突变导致血友病B的分子发病机制.方法 在野生型FⅨ表达质粒FⅨWTpcDNA3.1(-)的基础上,定点突变法构建FⅨ R327I、R327Ala(A)、R327Lys(K)和R327Asn(N)突变的表达质粒,重叠PCR构建FⅨ324～329(β折叠结构域)换成FⅦ298～303同源结构突变表达质粒[FⅨβFⅦ pcDNA3.1(-)].将野生型及各种突变体表达质粒分别瞬时转染胚肾293T细胞,一期法检测培养上清液中FⅨ活性(FⅨ∶C)及ELISA法检测细胞培养上清和细胞裂解液中FⅨ抗原(FⅨ∶Ag),Western blot法检测突变蛋白的相对分子质量及表达水平.荧光蛋白表达载体瞬时转染法检测活细胞中突变蛋白合成与分泌.结果 体外瞬时转染FⅨR327I突变基因的细胞FⅨ∶C为正常野生型的4.49%,细胞上清液和细胞裂解液FⅨ∶Ag水平分别为野生型的31.02%和129.29%,为交叉反应减低型(CRMR).活细胞免疫荧光观察发现FⅨR327I突变蛋白在细胞内含量较野生型显著增高,并且在细胞溶酶体内的含量较野生型也显著增多.FⅨR327A、R327K、R327N及FⅨβFⅦ突变基因转染的细胞FⅨ∶C水平较野生型减低,其中以FⅨβFⅦ突变降低为明显;转染的细胞培养上清FⅨ∶Ag水平除R327K突变型较野生型增加,其余突变型均比野生型有不同程度的降低.Western blot法检测显示各种突变蛋白的相对分子质量与野生型相同而表达水平降低.结论 FⅨR327I突变基因可影响蛋白质合成和分泌,R327位点与FⅨ功能特异有关,其所在的β折叠结构域在FⅨ特异性功能中发挥重要作用.
-
CD80鼠-人嵌合抗体的CHO细胞表达及体外生物学功能的初步研究
目的:CHO细胞表达抗人CD80鼠-人嵌合抗体ch4E5,并研究其在体外阻断CD80介导的共刺激信号转导的生物学功能.方法:构建含有嵌合重、轻链基因的表达载体pIRES/ch4E5;表达载体先转染293T细胞,FCM检测到ch4E5抗体的瞬时表达后,表达载体再转染CHO细胞,构建稳定表达细胞株CHO-ch4E5;Protein G亲和层析法从CHO-ch4E5细胞无血清培养上清中纯化ch4E5抗体,FCM检测ch4E5抗体对膜型CD80的识别;以丝裂霉素处理的正常人外周血单核细胞PBMCs为刺激细胞,以异体正常人外周血淋巴细胞PBLs为反应细胞,用MTT法分析ch4E5抗体的阻断作用.结果:ch4E5抗体在293T细胞的瞬时表达于48小时达到高峰,上清与L929-B7-1细胞结合率为96.0%;CHO-ch4E5细胞持续表达ch4E5抗体,其培养上清与L929-B7-1细胞结合率为95.7%;3天培养上清中,ch4E5抗体的产率约为5.56 mg/L;ch4E5抗体和L929-B7-1、Daudi、Sub-T细胞结合率分别为94.1%、25.7%、23.5%;ch4E5抗体可以阻断CD80介导的共刺激信号转导,抑制异体PBLs的体外增殖.结论:在CHO细胞中成功表达了抗人CD80鼠-人嵌合抗体ch4E5,在体外该嵌合抗体具有亲本抗体阻断CD80介导的共刺激信号的生物学活性.
-
表达EGFP的质粒和目的基因共转染用于检测目的基因对细胞周期的影响
在基因功能研究过程中,常常使用的一种方法就是将目的基因转到靶细胞内进行瞬时表达(transient expression),以流式细胞仪检测细胞周期的变化,观察转基因对细胞增殖的影响.由于各种转基因方法的不同,转基因的效率也不同,往往是仅有一部分细胞可以表达目的基因,没有转基因的细胞将影响检测的结果.如何将已经转基因的细胞同未转基因的细胞区分开来进行检测,是一个技术上的难点.一种直接的方法是采用目的基因表达蛋白的抗体直接标记表达目的基因的细胞,条件是该目的基因必须是细胞内特异的,且表达的蛋白位于细胞膜.另外一种方法就是采用双基因共转染方法,常用的共转染基因有B或T淋巴细胞的分化抗原,如:CD19、CD20等[1].
-
抗人CD25嵌合抗体基因的构建及其瞬时表达研究
目的:构建抗人CD25嵌合抗体基因并在哺乳动物细胞中进行瞬时表达和初步鉴定.方法:采用RLM-RACE法克隆WuTac抗体可变区和信号肽序列,并利用基因拼接法构建嵌合抗体基因.用脂质体法瞬时转染三种哺乳动物细胞,并使用ELISA、FCM、WB、Dot blot和免疫荧光法进行检测.结果:成功克隆WuTac抗体可变区和信号肽序列,并构建了抗人CD25嵌合抗体表达质粒.瞬时转染结果表明所表达的嵌合抗体保留了亲本抗体WuTac的抗原结合力.结论:成功构建了抗人CD25嵌合抗体基因,为其进一步研究打下基础.
-
携带tPA信号肽序列HuZP3核心抗原核酸疫苗质粒的构建与体外瞬时表达
目的:构建含有组织型纤溶酶原激活剂(tPA)信号肽的人卵透明带3(HuZP3)蛋白核心抗原核酸疫苗质粒并进行体外瞬时表达.方法:将HuZP3基因用PCR方法扩增并分别引入限制性内切酶酶切位点,然后克隆入pIRESIneo载体中获得核酸疫苗质粒,经筛选鉴定后,将上述核酸疫苗质粒及空载体质粒pIRESIneo分别用脂质体瞬时转染CHO细胞,应用免疫印迹法检测核心抗原在体外CHO细胞中的表达,并将其免疫实验小鼠,以酶联免疫吸附法验证其免疫原性.结果:成功构建以pIRESIneo为载体的含tPA 信号肽的HuZP3核心抗原核酸疫苗质粒,体外瞬时表达证实含tPA信号肽的HuZP3核心抗原在CHO细胞胞内和胞外均能表达,含tPA信号肽的HuZP3核心抗原核酸疫苗质粒的核心抗原表达水平较高,核酸疫苗质粒具有很好的免疫原性.结论:以pIRESIneo为载体的含tPA信号肽的HuZP3核心抗原核酸疫苗能够将细胞内的HuZP3核心抗原分泌到细胞外,构建的核酸疫苗质粒pIRES1-ZP3/tPA具有很好的免疫原性,为进一步研究其免疫原性奠定了基础.
-
抗CD25人鼠嵌合抗体基因真核表达质粒的构建与瞬时表达
目的 构建抗CD25人鼠嵌合抗体基因真核表达质粒,并在293T细胞中进行瞬时表达.方法 采用RT-PCR技术,设计针对信号肽的简并引物,钓取抗CD25杂交瘤细胞的重、轻链可变区基因,以质粒PAG4622为模板,钓取人抗体IgG1重、轻链恒定区基因,分别将重、轻链可变区基因与相应的恒定区基因进行拼接,将完整的重、轻链嵌合基因分别与真核表达载体pOptiVEC和PcDNA3.3连接,构建抗CD25人鼠嵌合抗体基因真核表达质粒,将其通过脂质体法共转染至293T细胞中进行表达.通过RT-PCR法检测嵌合抗体基因的转录水平,ELISA法检测嵌合抗体的表达,流式细胞术(FCM)分析嵌合抗体的结合活性.结果 抗CD25人鼠嵌合抗体基因真核表达质粒构建正确;RT-PCR显示嵌合抗体基因在293T细胞中成功转录;转染后48、72、96和120 h,细胞培养上清中嵌合抗体的含量分别为7.47、11.72、8.02和18.28 ng/ml;FCM检测其能特异性与IL-2Rα链结合.结论 已成功构建了抗CD25人鼠嵌合抗体基因的真核表达质粒,并能在293T细胞中瞬时表达.
-
在烟草中瞬时表达人角质细胞生长因子1
目的 在烟草中瞬时表达人角质细胞生长因子1(Keratinocytegrowth factor1,KGF1),旨在寻求一种低成本、方便、大量生产rhKGF1的方法.方法 以重组质粒pET3c-hKGF1为模板,通过PCR法扩增hKGF1基因片段,插入经改造的马铃薯病毒X双元表达载体pGR 107中,冻融法转化感受态农杆菌GV3101,以获得的GV3101-pGR107-rhKGF1侵染烟草.以绿色荧光蛋白基因(smGFP)为报告基因,建立马铃薯X病毒(PVX)瞬时表达体系.用紫外灯连续20 d观察经GV3101-pGR107-smGFP侵染的烟草中smGFP的表达.经RT-PCR法分析烟草中rhKGF1基因mRNA的转录,SDS-PAGE 、Western blot分析烟草中rhKGF1蛋白的表达.结果 重组表达质粒pGR107-rhKGF1经PCR及测序证实构建正确；转化的农杆菌GV3101-pGR 107-rhKGF1侵染的烟草中目的蛋白的表达量在第8天达大.目的蛋白rhKGF1在烟草中获得成功表达.结论 在烟草中瞬时表达了rhKGF1,为其单克隆抗体的制备及产业化奠定了基础.
关键词： 烟草 人角质细胞生长因子1 瞬时表达 -
CHO-DG44细胞瞬时转染条件的优化
目的 优化CHO-DG44细胞瞬时转染的条件.方法 采用TubeSpin一次性生物反应器,以绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)为报告基因,氯醚酰亚胺(Polyether imide,PEI)为转染试剂,将质粒pIRESneo3-eGFP瞬时转染CHO-DG44细胞,优化瞬时转染的基本条件[细胞密度、DNA浓度和DNA:PEI比例(w/w)]以及其他条件(换液、渗透压和温度),采用优化的条件转染质粒pIRESneo3-eGFP,流式细胞术检测细胞转染效率,生物发光仪检测相对荧光强度.结果 CHO-DG44细胞瞬时转染的佳条件为:采用XLG-P8培养基进行转染,细胞密度为2×106个/ml,DNA浓度为6.25μg/5 ml,DNA∶PEI(w/w)比例为1∶5；转染后4h更换新鲜培养基,添加30 mmol/L NaCl,并于31℃继续培养.在此条件下,CHO-DG44细胞的瞬时转染效率可达81.45％,相对荧光强度可达9×105 RFU/106 cells.结论 优化了CHO-DG44细胞瞬时转染的条件,为下一步药物蛋白的研发奠定了基础.
关键词： CHO-DG44细胞 转染 瞬时表达 优化 -
抗人CD86人-鼠嵌合抗体的构建及在CHO细胞的表达
从分泌鼠抗人CD86单克隆抗体的杂交瘤细胞株(克隆号:1D1)中抽提总RNA,采用简并引物,经RT-PCR扩增单抗VH和VL的DNA编码区基因.通过SMART-PCR扩增VH和VL基因相应的信号肽序列.采用基因重组技术,将单抗VH、VL基因及其相应信号肽序列,与人IgGl的CH基因、Ck链基因进行拼接,构建人-鼠嵌合抗体基因的表达质粒pIRES/1D1.转染293T细胞进行瞬时表达,采用流式细胞术分析,转染上清与L929-CD86基因转染细胞的阳性结合率为97.6%.既而转染CHO细胞,经G418筛选,获取稳定分泌嵌合抗体的基因转染细胞株(CHO-ch1D1).收集无血清培养基的培养上清,采用Protein G亲和层析柱分离纯化,经Lowr法定量.从上清中获取的嵌合抗体蛋白的得率为3.066 mg/L.经进一步间接免疫荧光及流式细胞术分析,纯化嵌合抗体与L929-CD86基因转染细胞,及Daudi细胞膜型CD86分子的阳性结合率分别为98.5%和95.7%.将嵌合抗体(终浓度为5 μg/ml)加入到Daudi细胞的培养体系中,经显微镜观察及MTT法分析,嵌合抗体对Daudi细胞的生长具有抑制作用(P<0.05).本研究获取的嵌合抗体在CD86分子的基础和应用研究中具有重要的价值.
-
突变型和野生型MBL基因在COS7细胞中的瞬时表达
采用PCR技术,从质粒pMBLm52、pMBLm54和pMBLm57中分别获取含CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAA点突变的人甘露聚糖结合凝集素(MBL)突变体全长编码区cDNA序列,将其分别插入质粒pcDNA4/HisMax C中,构建成相应的3种真核表达载体.将各突变型MBL基因的真核表达载体和野生型MBL基因真核表达载体以脂质体法分别转染COS7细胞.72 h后,以双抗体夹心ELISA技术检测各细胞培养上清中目的蛋白的含量分别为0.980 μg /ml、0.971 μg /ml、0.900 μg /ml和1.047 μg /ml;用One-way ANOVA分析这些目的蛋白的含量无显著性差异(P＞0.05).因此,MBL结构基因的点突变并不影响MBL蛋白的合成与分泌.
