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中药及其活性成分基因转录水平机理研究进展
千百年来,在中医药理论指导下,无论单味还是复方中药,在临床实践中不断地得到验证是有良效的,且在临床适用的范围筛选出有显效的活性单体成分的事例也屡见不鲜.但中药的作用机理研究如同药效物质基础研究一样,是中药基础研究的一个瓶颈,其中一个重要原因是中药特别是中药复方的成分复杂,很难找到有效的研究手段.近年来,分子生物学技术的发展使得从基因转录水平研究中药的作用机理成为可能.笔者根据近10年来中药基因转录水平机理研究的文献报道,对这方面的国内外进展综述如下.
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Siglec-1与自身免疫性肝炎的相关性研究
人Siglec-1表达于特定组织巨噬细胞上,当单核巨噬细胞受到炎症刺激时,Siglec-1表达迅速上调,说明Siglec-1在巨噬细胞促炎症反应中起重要作用.本研究分别从蛋白和基因转录水平观察Siglec-1在自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)患者外周血的表达变化,并探讨其在AIH发生发展中的意义.
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SARS-CoV N蛋白对真核细胞基因谱的影响
N蛋白位于SARS冠状病毒(SARS-CoV)颗粒的核心,是SARS-CoV的主要结构蛋白之一,它可以与病毒基因组RNA结合.目前研究表明N蛋白可以选择性激活AP-1(activator protein 1)信号转导途径;并发现在压力条件下(即缺乏生长因子时),N蛋白可以诱导COS-1细胞凋亡和肌动蛋白重组.本文研究了体外转染N蛋白真核表达载体后细胞基因转录水平的变化.通过长寡核苷酸芯片和SAM统计学处理,得到了瞬时表达N蛋白的真核细胞转录谱.N蛋白对哺乳动物细胞转录的影响可能与SARS-CoV的致病机理相关.
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酸性成纤维细胞生长因子对缺血再灌注小肠绒毛细胞内bax和bcl-2表达的影响
目的:探讨外源性酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)对大鼠肠缺血再灌注后小肠绒毛细胞凋亡以及凋亡相关基因bax和bcl-2表达的影响.方法:采用肠系膜上动脉(SMA)夹闭45 min后松夹造成缺血再灌注(I/R)损伤的动物模型,将108只Wistar大鼠随机分成假手术组(C)、肠缺血组(I)、肠缺血-再灌注组(R)和aFGF治疗组(A).根据缺血后再灌注时间的不同又将R组和A组又分成0.25,0.5,1,2,6,12,24和48 h共8组,每组6只动物.A组和R组在松开动脉夹的同时,分别经尾静脉注入20μg/kg aFGF和生理盐水0.15 mL.各时相点取小肠组织,通过末端脱氧核糖转移酶介导的生物素化脱氧尿嘧啶缺刻标记技术(TUNEL)检测细胞凋亡率;利用免疫组织化学方法检测bax和bcl-2蛋白表达;用RT-PCR方法测定bax和bcl-2基因的表达水平.结果:缺血再灌注后2,6,和12 h,A组中大鼠小肠绒毛组织的细胞凋亡率分别为(41.17+3.49%),(42.83+5.23%)和(53.33+6.92%),显著低于C组中各对应时间点上的细胞凋亡率(P<0.05).I/R后小肠绒毛细胞内bax基因表达逐渐增强,蛋白含量升高,而bcl-2基因转录迅速降低,蛋白含量减少.在再灌注2-12 h,A组中bcl-2基因转录水平和蛋白含量都较C组增加,而bax基因的mRNA含量和蛋白水平均较C组降低.结论:外源性aFGF能够减轻缺血再灌注对小肠绒毛的损伤,其机制可能与aFGF促进bcl-2基因转录、抑制bax基因表达相关.
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复杂性疾病生物信息学研究的策略与方法
本文简述近年来复杂性疾病生物信息学研究的策略与方法,并介绍清华大学生物信息学教育部重点实验室的有关工作.由于遗传、环境的相互作用及基因型-表型复杂的内部结构,常用的家系研究、基于遗传图谱的连锁分析、基于物理图谱的定位克隆以及关联分析等单基因病策略与方法,在复杂性疾病的分子机制研究上存在局限.在后基因组时代,生物信息学的发展,为从分子水平和系统观念研究复杂性疾病,以及研究模式从"序列→结构→功能"向"相互作用→网络→功能"的转变提供了契机.从多因素分析、基因的相互作用着手研究复杂性疾病成为热点.我们以信息、系统的观点,从功能基因组系统学出发研究复杂性疾病的机制,并在复杂性疾病的基因组合及相互作用信息提取、复杂性疾病基因转录水平和表达水平的芯片分析、多层次生物信息整合、分子调控网络建模、中医药生物信息学等方面进行了有益的尝试.
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胃癌发生中后生修饰的异常
胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤,其发生与发展与肿瘤相关基因的表达异常,包括癌基因的过度表达和抑癌基因的失活等有关.染色体由DNA和组蛋白等组成,DNA的甲基化和组蛋白的乙酰化是调控各种基因表达的后生修饰的主要内容.甲基化使基因转录水平降低,而与基因相关的组蛋白的乙酰化往往活化该基因.胃癌的发生中常常有总基因组DNA甲基化水平降低、c-Ha-ras等癌基因的低甲基化和包括p16INK4A等抑癌基因的高甲基化,及p21WAF1基因相关组蛋白的低乙酰化紊乱等.本文重点讨论几种较重要的肿瘤相关基因的后生修饰变化和纠正策略.
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乙肝病毒表面抗原基因启动子Ⅱ的结构及调节研究
0引言乙型肝炎病毒(HBV)为含有一段单股区的双链环状DNA病毒,属嗜肝DNA病毒科,其基因组结构紧密,可分为结构基因序列和调节基因序列两部分,二者可具有相互重叠的特点.HBV基因的负链核苷酸序列中,至少有4个开放读码框(open reading frame,ORF),包括编码外膜蛋白的S基因区,编码核衣壳蛋白的C基因区,编码聚合酶的P基因区和调节病毒基因转录水平的X基因区,4种ORF分别有各自的启动子.HBV的外膜蛋白能使病毒由感染的细胞分泌,并能附着和侵入新的细胞;同时其也是引起宿主保护性应答的免疫原表位[1-6].因此,作为指导S基因组RNA转录的SP启动子序列,在HBV的生活周期中,具有较为重要的作用.
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清热活血健脾中药对大鼠肝癌基因转录差异的调整
目的:观察中药抑癌扶正行气活血方(全方)及其不同治法的拆方:清热方、活血方、健脾方对肝癌大鼠的作用和对肝组织基因转录的整体调节作用.方法:采用二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠肝癌,设正常组、模型组、不同中药组及FT-207组对照,分别观察各组大鼠生存率、肝、体、肝/体及肝组织的病理、甲胎蛋白(AFP)免疫组化变化;以及采用DDPCR技术显示正常肝组织与模型组肝癌组织中呈差异转录的cDNA片段,Northern blot验证这些cDNA片段在各组中转录的差异,并将呈差异转录的cDNA片段进行克隆与测序.结果:全方其及拆方均能不同程度地改善肝癌大鼠的一般情况,提高大鼠的生存率.各拆方中以清热组与活血组为优;全方其及拆方均能不同程度地抑制肿瘤的生长及肝脏AFP的合成,其中以全方组与清热组为优;采用DDPCR结合Northern blot筛选出在各组中呈显著差异转录的9个阳性cDNA片段,经与Genbank比较4个为新的基因,且这9个基因在肝癌发生与转归中的作用至今未见报道;全方及其拆方对这些基因的转录水平有不同程度的调节作用,其中DD29下调57-78%,DD11 、DD25也有下调至60%和78%,使基因转录水平接近正常肝组织.结论:全方及其不同治法的拆方中药对大鼠肝癌具有直接治疗作用,能不同程度地广泛地调控肝组织(含肝癌组织)有关基因的转录水平.
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雷公藤抑制致敏小鼠T细胞IL-5 mRNA表达及GATA3活性
通过对致敏小鼠T细胞IL-5 mRNA表达和GATA3活性的观察,探讨雷公藤内酯醇(TP)对IL-5基因转录水平的调节机制,并与地塞米松(DM)的作用比较。 材料与方法(1)动物模型建立及分组:BALB/c小鼠24只,随机平均分为4组:正常对照组,以生理盐水代替卵蛋白(OVA)致敏和激发;致敏组,以OVA致敏和激发[1];TP组,每次激发前1 h腹腔注射TP 40 μg/kg体重;DM组,每次激发前1 h腹腔注射DM 10 mg/kg体重。TP组与DM组后一次激发后24 h再给药1次。(2)原位杂交(ISH):制备脾脏T细胞涂片。IL-5寡核苷酸探针序列:5′TCT CAA AGA ACC ACA TTA CTT GTG GCT CAC 3′。随机观察200个细胞,计数杂交阳性T细胞数。(3)凝胶电泳迁移率实验(EMSA):BALB/c小鼠30只,随机分为正常对照组(5只)和致敏组(25只),致敏方法同上。Panning法[2]分离CD+4T细胞,用丝裂霉素C处理的B细胞作为抗原呈递细胞(APCs)。将CD+4T细胞分为4组:A组:正常对照组,即正常小鼠CD+4T细胞;另3组分别为将致敏小鼠CD+4T细胞随机分成的B组:刀豆蛋白A(ConA)刺激组,C组:TP组和D组:DM组。各组加入OVA至终浓度0.2 g/L、ConA至终浓度25 mg/L、1×107个APCs,相应组加入TP至终浓度10-4mol/L,DM至终浓度10-5mol/L。B组取0.5 h、1 h、2 h和4 h时相点,其余组取2 h时相点。GATA3寡核苷酸序列:P1 5′CCT CTA TCT GAT TGT TAG CA,P2 5′ TGC TAA CAA TCA GAT AGA GG,末端标记[γ-32P] ATP。EMSA反应产物经6%聚丙烯酰胺凝胶电泳3 h,-70℃放射自显影8 h。相同实验重复3次。(4)凝胶电泳迁移率竞争实验:特异性竞争抑制实验组:加入100倍和200倍未标记GATA3探针;非特异性竞争抑制实验组:加入200倍非特异性的其它未标记探针序列:P1 5′ATA AAA TTT TCC AAT GTA AA,P2 5′TTT ACA TTG GAA AAT TTT AT。
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阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征的遗传规律研究
阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)是以睡眠时反复上气道塌陷导致打鼾、频繁呼吸暂停及呼吸浅慢、低血氧和睡眠中断、白天嗜睡为主要表现的一种疾患.流行病学调查表明,OSAHS可累及10%的中年男性和5%的中年女性,是一种常见病.OSAHS是心脑血管疾病的重要危险因素,而后者正是目前全球第一位的死亡原因.OSAHS具有明显的家族聚集性,是一种由多个基因和环境因素共同作用引起的复杂多基因遗传性疾病.研究OSAHS遗传规律,识别和克隆OSAHS易感基因,将从根本上阐明OSAHS的遗传本质,揭示OSAHS的发病机制,并将对该病易患者的早期检出及预防,提高治疗水平产生重大影响,尤其是OSAHS易感基因一旦确认后,研制出能调控这些基因表达的药物,有望在基因转录水平上实行病因治疗.因此,OSAHS的遗传研究,近年受到了国内外学者的关注,但与其他多基因疾病一样,由于其遗传模式的复杂性,其致病基因的发现和确认尚需大量的研究工作.目前对OSAHS遗传规律的研究尚无既定的方法模式,主要采用候选基因法、定位基因克隆法和动物模型.
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卵巢恶性肿瘤的蛋白质组学研究现状与展望
1995年,Wasinger等[1]发表在Electrophoresis的文章中首次使用了由澳大利亚学者Wilkins和Williams于1994年提出的蛋白质组(proteome)的概念,这标志着蛋白质组学(proteomics)的诞生.这一全新学科的诞生有着深刻的时代和科学发展的背景.随着人类基因组计划的顺利完成,生命科学研究已进入了后基因组时代.由于基因只是遗传物质的载体,蛋白质才是生理功能的执行者;基因转录水平的研究只能在一定程度上反映基因表达产物的变化,而真正发挥功能的蛋白质要经过转录后加工、翻译调控以及翻译后加工等许多步骤和调控才能形成;因此,对基因组的研究有时并不能完全反映机体功能的变化,为了减少这种客观存在的相对误差,蛋白质组学作为快捷、有效的蛋白质分析技术应运而生.
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川崎病患儿急性期Th1/Th2细胞功能状态的研究
川崎病(Kawasaki disease,KD)迄今病因不明,从流行病 学特征推测可能与病原体感染或毒素超抗原引起的免疫学异常有关.认为超抗原有强大的激活T细胞能力,通过T细胞介导血管炎性反应[1].但仍有着诸多争议.本研究旨在通过对KD患儿外周血淋巴细胞干扰素γ(IFN-γ)和白细胞介素4(IL-4)及各自的特异性转录因子T盒21(T-bet)和锌指转录调解因子3(GATA-3)mRNA的检测,在基因转录水平上探讨KD患儿T细胞功能状态.
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原位明胶酶谱法检测胶质瘤18例基质金属蛋白酶活性
胶质瘤是常见脑肿瘤之一,具有肿瘤早期就能侵袭周边正常脑组织的特性,尤其是胶质母细胞瘤,恶性度高.基质金属蛋白酶(MMPs)是一组锌依赖性内肽酶,与肿瘤细胞侵袭、转移相关的细胞外基质(ECM)降解过程密切相关[1],目前已知有26 种,其中对MMP-2 和MMP-9 的研究比较深入.MMPs 的活性会受到基因转录水平、无活性酶前体经蛋白水解作用而激活,以及特异性抑制因子(TIMP)等的影响.本研究的目的是了解胶质瘤有无表达MMPs活性、活性具体表达的部位,以及与恶性度的关系.
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乙型肝炎病毒基因突变研究的临床意义
在乙型肝炎病毒(HBV)基因的负链核苷酸序列中,至少有4个开放读码框架(ORF),包括编码外膜蛋白的S基因区,编码核壳蛋白的C基因区,编码聚合酶的P基因区和调节病毒基因转录水平的X基因区.
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L1壳蛋白和p16INK4a蛋白在不同类型宫颈上皮内瘤变1级中的表达意义
p16属于抑癌基因CDKN2A家族,通过阻断细胞由G0期进入S期抑制细胞的增殖而发挥抑癌作用.在CIN组织中P16INK4a过度表达,可能是人感染高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)后,E7癌蛋白在宫颈细胞内表达,竞争性抑制CDK4与Rb蛋白的结合,使Rb蛋白失活,激活了E2F家族转录因子,基因转录水平上升,从而导致p16INK4a阳性表达[1].病理科
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弹性蛋白的表达调控
弹性蛋白是肺、大动脉、皮肤等器官中的主要细胞外基质成分之一,对维持这些器官的伸缩功能具有重要作用.大量体内和体外研究结果表明,多种细胞因子及理化因素参与了对弹性蛋白基因表达的调控,其中具有正性调控作用的主要有TGF-β、TGF-I、IL-10、IL-1β等细胞因子和应力等,具有负性调控作用的主要有bFG、EGF、TNF-α、INF-γ、血管紧张素II等.调控作用可以发生在基因转录水平、mRNA稳态水平以及转录后的翻译修饰等.
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RNA干扰在乳腺癌研究中的应用
RNAi(RNA interference)是指内源性或外源性双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)分子在基因转录水平上关闭相应序列基因转录所致的细胞内有效的、特异性的基因封闭[1].
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应用实时RT-PCR技术的mRNA定量分析
1 mRNA定量的意义 特定基因的表达水平可反映细胞的生长、存活状态,对特定基因转录水平的定量分析已成为基因功能研究的核心部分[1].近,分子生物学技术的飞速发展使得mRNA定量分析用于临床诊断成为现实,其应用涉及面很广,包括检测肿瘤细胞耐药基因的调节与表达、化疗疗效的分析、基因治疗的生物动力学与转录、表达水平的研究;并提供了评价肿瘤进展,检测外周血中肿瘤细胞的有效手段;此外,RNA定量分析还可用于病菌、病毒的检测[2-6].
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肿瘤相关基因转录调控蛋白的识别与研究进展
癌相关基因主要包括两大类,即原癌基因与抑癌基因.在自然或实验条件下原癌基因的活化或者抑癌基因的失活具有诱导细胞恶性转化功能.癌相关基因的表达调控异常是细胞癌变中的重要事件.在癌相关基因转录调控中,转录调控蛋白作为反式作用因子(trans acting factors)与基因自身的顺势作用元件(cis acting elements)相互作用,实现对基因转录水平的调控.故深入研究癌相关基因的反式作用因子,有助于我们解析癌相关基因的表达调控机制,从而为以基因干预为目的的靶向治疗提供有价值的理论依据.
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地高辛标记的cDNA探针检测 IL-6mRNA表达的方法
IL-6(interleukin-6)是一种由多种细胞分泌的细胞因子,在血液病及心、脑疾病时有异常表达.IL-6被认为是目前治疗各种血小板减少症的佳药物,在治疗白细胞减少症及抗白血病、抑制肿瘤转移及骨髓移植方面也有重要作用.迄今,IL-6的检测多采用以细胞培养为基础的生物学活性检测,该方法不仅难以反映IL-6基因转录水平,而且特异性和灵敏度均受到限制.本文采用随机引物法对人IL-6cDNA探针进行地高辛标记,核酸分子原位杂交技术,建立了在转录水平上直观检测IL-6mRNA表达的实验技术,为研究IL-6的基因表达与调控奠定了基础.