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恶性血液病细胞端粒酶活性检测及其临床意义
目的:分析恶性血液病细胞端粒酶活性检测及其临床意义.方法:2016年2月-2017年1月收治血液系统恶性肿瘤疾病患者90例,另外在同期选择部分良性血液疾病患者30例进行对比分析.两组患者均接受相同检查方法,总结不同疾病患者的端粒酶活性差异.结果:良性血液疾病患者的端粒酶活性与其他恶性血液疾病患者的端粒酶活性数据差异较大,差异有统计学意义(P<0.05).结论:恶性血液病细胞端粒酶活性检测临床意义显著,能够作为恶性血液疾病检查标志物,尤其是可以作为白血病残留量的监测新标准之一,值得推广普及.
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黄檗果皮提取物化感作用的研究
目的:通过对黄檗果皮化感作用的研究,探讨其在黄檗野生种群自我更新障碍中的作用,为黄檗野生资源的保护寻求方法和途径.方法:用4℃蒸馏水浸泡(水浸液)及蒸馏水回流提取(水提液)的黄檗果皮提取液培养白菜、小麦种子,研究其对受体种子萌发及幼苗生长的作用.结果:20 g·L-1水浸液及水提液对白菜、小麦种子的萌发有显著的抑制作用,100g·L-1时完全抑制小麦的萌发;20 g·L-1水浸液显著抑制白菜、小麦的生长,完全抑制白菜根的生长,100 g·L-1水浸液完全抑制白菜、小麦的生长;相比于水浸液,水提液对种子萌发及幼苗生长的作用强度都有所减弱.结论:黄檗果皮的化感作用是多物质作用的结果,部分化感物质对热敏感;黄檗果皮的化感作用总体上表现为对种子萌发及幼苗生长的抑制,推测黄檗果皮的物理及化学特性是致使其种群自我更新困难的因素之一.
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中药复方血清药理学方法规范化探讨
利用给药后血清的特殊药理活性检测以观察药物(包括中药)作用已有长久历史,但作为观察中药特别是中药复方作用的常规则刚起步,历时近10年,日本和我国的一些研究都取得了较好结果,表明其不失为值得推广应用的方法,但这一方法也存在一些问题与局限性.在中药复方血清药理学的实验研究中,含药血清的制备技术的规范化研究是一切研究的基础,其中包括给药天数、给药次数、给药剂量、采血时间、含药血清的灭活与保存等一系列问题需要探讨.
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HIV P66蛋白的表达、纯化及活性检测
此研究的目的是体外表达HIV-1逆转录酶P66亚单位蛋白,并得到纯度较高且具有活性的重组蛋白.首先通过PCR方法从含HIV-1 HXB2标准株全基因的质粒中扩增出全长p66基因,插入表达载体pTWIN1,构建pTWIN-p66质粒.再将该质粒转化到表达菌BL21,在IPTG诱导下表达P66蛋白.表达产物经几丁质柱一步纯化后得到P66蛋白纯品.纯化的P66蛋白分别催化B95-8细胞总RNA、RT试剂盒中对照RNA进行逆转录;同时以试剂盒中的M-MLV RT为对照进行相同的逆转录,PCR后电泳比较活性.结果显示我们构建的pTWIN-p66质粒在IPTG诱导下在原核细胞中P66亚单位蛋白表达量较高,经一步纯化后蛋白凝胶扫描纯度达88%,并具有较好的逆转录活性.与M-MLV RT体外活性比较,两者活性相当.该研究为进一步开发国产HIV确证诊断试剂及抗AIDS药物的研究打下了初步基础.
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循环温差法测定生物组织活性的实验研究
如何测定低温损伤后的生物材料活性是低温保存和低温医疗领域中的重要课题.本文提出了循环温差法测定生物组织活性的新方法,并进行了初步的实验研究,给出了定量评价生物组织活性的数学关联式.实验证明,该方法所采用的测试装置简单,易于操作,结果稳定可靠,重复性较好.本文后指出了进一步的改进方法.
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家蝇细胞色素P450还原酶的原核表达与活性鉴定
目的 家蝇是重要的卫生害虫,其抗药性问题突出,其中细胞色素P450介导的代谢解毒作用增强是其抗药性的重要机制.细胞色素P450还原酶(cytochrome P450 reductase,CPR)是细胞色素P450酶系的重要组分,建立家蝇细胞色素P450还原酶(MdCPR)表达体系有助于通过重组家蝇细胞色素P450酶系以鉴定家蝇抗药性的生物化学机制.方法 将家蝇CPR基因的编码区克隆到表达载体(pB508)上构建重组质粒,在大肠埃希菌中重组质粒经异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,对表达的MdCPR蛋白进行细胞定位分析和活性测定.结果 MdCPR蛋白在大肠埃希菌中成功地得到表达,分子质量为76×103左右,表现出细胞色素C还原酶活性,主要定位在细胞的膜成分中.结论 在大肠埃希菌中表达了具有还原酶活性的MdCPR蛋白,为进一步研究家蝇细胞色素P450的功能及其在抗药性中的作用奠定了基础.
关键词: 家蝇 细胞色素P450还原酶 功能表达 活性检测 -
生物发光共振能量转移技术在蛋白酶活性检测中的应用
生物发光共振能量转移(BRET)是20世纪中叶在海洋生物,例如维多利亚水母和软体珊瑚虫海肾中发现的一种自然现象[1],能量从生物发光蛋白如荧光素酶(供体)转移到荧光物质(受体)。在软体珊瑚虫海肾中海肾荧光素酶将腔肠素氧化,发出波长为480 nm的光,与近距离的海肾绿色荧光蛋白之间发生一个非辐射的能量转移,发出509 nm的光[1-3]。实际上,共振能量转移理论早在1948年就已经被 F?rster提出并被称为共振能量转移(F?rster resonance energy transfer,FRET)[4]。根据供体不同,共振能量转移分为以荧光物质如荧光蛋白[5]、有机分子[6-7]、纳米无机荧光材料等为供体的 FRET以及荧光素酶或者发光蛋白为供体的 BRET[8]。共振能量转移发生时,供体发出的部分光转移到受体荧光蛋白,受体发出波长更长的光。共振能量转移只有在受体分子的吸收光谱与供体分子的发射光谱有效重叠后才能发生。其发生取决于供体分子与受体分子的距离(一般在1~10 nm)和两者的相对方向[9-10]。
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rAAV2/1-Acrp30病毒的纯化、扩增与活性检测
目的 将大鼠脂联素基因(Acrp30)克隆到腺相关病毒(AAV)载体中,经包装、纯化、扩增后获得rAAV2/1-Aerp30病毒,并进行活性检测.方法 筛选阳性克隆获得pSNAV2.0-Acrp30,EcoR Ⅰ/Sal Ⅰ双酶切鉴定,并行测序.转染BHK21细胞,G418筛选培养,获得抗药克隆细胞株.HSV1-re/△UL2感染,包装此细胞株并收获病毒载体rAAV2/1-Acrp30.行DNA斑点杂交法测定病毒滴度,SDS-PAGE分析判断病毒纯度,Western blot法检测目的 蛋白脂联素在HEK293细胞中的表达活性.结果 PCR电泳及酶切鉴定表明,pSNAV2.0-Acrp30重组成功,基因测序显示装入pSNAV2.0质粒中的Acrp30基因正确.rAAV2/1-Acrp30病毒的大致滴度为1.0×1012μg/ml,HEK293细胞分泌蛋白浓度为50 ng/ml,病毒载体纯度在95%以上.结论 实验获得的脂联素病毒载体滴度高、感染性好,可试用于GK(Goto-Kakizaki)大鼠脂联素转基因治疗.
关键词: rAAV2/1-Acrp30 扩增 活性检测 -
不同种属来源明胶及其他因素对明胶酶谱法检测金属蛋白酶的影响
金属蛋白酶-2(MMP-2,明胶酶A)与金属蛋白酶-9(MMP-9,明胶酶B)在多种生理过程中起作用,病理状态下如肿瘤、心血管疾病和呼吸系统疾病,则这些酶的表达和活性增加[1-2].明胶酶谱法多用于检测血浆、细胞培养上清及组织中的金属蛋白酶-2和9的活性[3],我们先前的实验发现不同来源的明胶直接影响明胶酶谱法结果,不同方式处理样本对酶的活性检测有影响,本研究就明胶的来源(自猪、牛皮肤提取)是否影响金属蛋白酶活性的检测,以及不同样本量、样本储存温度、反复冻融等因素对明胶酶谱法检测金属蛋白酶活性的影响进行探讨.
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肠出血性大肠埃希杆菌O157:H7溶血毒素的检测方法
我们曾和美国马利兰大学发展了鉴定肠出血性大肠埃希杆菌的探针,其特异性和灵敏性极高。经序列分析发现该探针是溶血素基因的部分片段。我们又从溶血表型进一步完善了这一鉴定方法。由于其溶血条件特殊,人们一直认为该菌不溶血。我们将经验总结报告如下。 一、材料和方法 1.菌种来源:肠出血性大肠埃希杆菌882364,1986年江苏省徐州市卫生防疫站分离,经本实验室鉴定,并保存。851006为本实验室筛选到的溶血素基因的天然缺失株(对照菌株)。 2.菌株鉴定:生化鉴定为大肠埃希菌。O157单抗和H7血清为本实验室制备。用O157:H7 PCR诊断试剂盒检测882364、851006的溶血素基因,882364的扩增结果为阳性,851006为阴性。 3. 血平板的制备[1]:脱纤维羊血用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次,加入至终浓度为3%。培养条件:于混合气(8%CO2,40%H2,52%N2)环境中37℃培养16 h,然后置21℃空气中6 h。 4.液体溶血活性检测[2]:(1)标准1%羊红细胞的制备;(2)活化菌体;(3)活性检测。 二、结果血平板检测的结果需对光观察,如发生溶血,可见菌落周围透明溶血环。液体溶血检测的结果如只需定性,则A值大于完全不溶血管即可;如需相对定量,可用溶血单位(HU)表示,一个溶血单位(HU)为裂解50%羊红细胞的检测样品的量。
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血清α-L-岩藻糖苷酶对慢性乙型肝炎肝脏损害程度诊断价值的观察
血清α-L-岩藻糖苷酶(AFU)对原发性肝癌(PHC)诊断的较好敏感性和特异性,已受到临床的广泛重视[1].近发现重型肝炎患者的病情的变化和死亡率与AFU活性变化也有密切关系[2].我们通过对593例慢性乙型肝炎患者的血清AFU的酶活性检测,发现AFU的酶活性与慢性乙型肝炎的肝脏损害程度亦有关,现报告如下.
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血浆ACE活性检测新法
血管紧张素转换酶是一种二肽羧肽酶,广泛存在于人体各组织器官中.血管紧张素Ⅰ在转换酶作用下转变为血管紧张Ⅱ,它有很强的生物活性,除引起小动脉收缩外,还能促使醛固酮的分泌和钠离子和水分的重吸收,使血容量增加和血压升高.本文采用国外介绍的一种新的酶动力学方法检测ACE活性,经过成百例的检测,证实这种检测方法在原发性高血压患者活性增高,而有对照的其它脑出血,风心病,心肌炎等疾病中与正常无差异.
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恶性腹水基质金属蛋白酶活性分析
目的:初步探讨基质金属蛋白酶与恶性腹水的关系.方法:收集腹水患者67例,男38例,女29例.肝硬化腹水36例,结核性腹水8例,恶性腹水23例.用明胶酶谱法测定基质金属蛋白酶活性.结果:肝硬化腹水、结核性腹水不能检出基质金属蛋白酶-2,-9(MMP-2,-9)活性,而恶性腹水MMP-2检出率为87.0%,MMP-9检出率为78.3%,且MMP-2活性高于MMP-9活性(0.01<P=0.022<0.05).结论:基质金属蛋白酶活性检测对于良、恶性腹水的鉴别诊断有重要价值,他可能与恶性腹水形成有关.
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抗肝癌人源化单链抗体hscFv25的体外亲和力成熟
目的:提高人源化抗肝癌单链抗体hscFv25的亲和力.方法:设计并合成人源化抗肝癌单链抗体hscFv25重链及轻链CDR3的半随机突变引物,构建突变体抗体库,竞争筛选亲和力更高的突变体抗体,对所得到的高亲和力的候选抗体,在大肠杆菌中进行可溶性表达,并采用细胞ELISA、细胞涂片免疫组织化学染色的方法,对该抗体进行初步的活性鉴定.结果:得到了3株候选高亲和力突变体抗体,其中的一株在大肠杆菌中获得了可溶性表达后,进一步的活性检测结果表明,该抗体的相对亲和力比亲本单链抗体提高了60倍左右,同时该抗体对肝癌细胞(SMMC-7721)的免疫组织化学染色呈强阳性,着色情况与亲本抗体相一致,而对正常肝细胞(HL-02)染色呈阴性.结论:成功地构建了人源化抗肝癌单链抗体hscFv25的突变体抗体库,并筛选到了一株亲和力更高的突变体抗体.
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应用CRISPR-CAS9技术制备miR-155基因敲除小鼠
目的:探讨利用typeⅡbacterial CRISPR/CAS9系统构建miR RNA-155基因敲除小鼠的可行性。
方法:首先,利用软件设计构建识别靶定靶序列的sgRNA,构建致靶基因切割的CRISPR/Cas9载体质粒;然后体外鉴定sgRNA/Cas9的活性检测;设计构建基因敲进的打靶载体;体外转录sgRNA/Cas9 mRNA;小鼠受精卵注射sgRNA/Cas9 mRNA和打靶载体;后miR-155基因敲除F0代C57/BL6小鼠的可遗传性检测,并剪鼠尾提DNA进行鉴定。 -
术前区域性动脉化疗联合手术序贯治疗老年人进展期胃癌的临床观察
随着我国老年化社会的到来,年龄大于65岁的老年人胃癌的发生率逐渐增高,约占我国全部胃癌的25.5%[1].由于早期诊断率低,大多数胃癌确诊时已属晚期,单纯手术或者化疗均难以达到满意效果.近年来,我们对术前判定手术切除困难的老年胃癌患者,行术前区域动脉化疗后再行手术治疗,并进行外周血T淋巴细胞亚群及自然杀伤细胞(natural killer cell,NK细胞)活性检测,取得了满意的疗效.
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一氧化氮、氧化、脂质过氧化与脑缺血
为探讨一氧化氮(NO)等自由基与脑缺血的关系,我们检测了133例脑缺血急性期患者血浆中的NO、维生素(Vit)C、VitE、β-胡萝卜素(β-CAR)、过氧化脂质 (P-LPO) 含量及红细胞超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶(E-CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px)活性和其过氧化脂质 (E-LPO) 含量,并与100例健康成人的上述检测值作分析比较。 1. 对象与方法:患者组(CI):随机抽检脑缺血急性期(发病72 h内)患者133例,年龄39~88 (62.7±10.8) 岁,男91例、女42例,均经CT或(和)MRI证实。对照组:随机抽检健康成人志愿者100名,年龄35~90 (63.1±12.7) 岁,男60名,女40名。两组受检对象平均年龄间和性别比例间差异均无显著性(P>0.05)。 全部受检对象的NO、VitC、VitE、β-CAR含量检测和SOD、E-CAT、GSH-Px活性检测及P-LPO、E-LPO含量检测均见文献[1]。 2. 结果:脑缺血组与对照组的各检测值及其比较结果见表1。
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Ⅳ型胶原酶活性检测在良、恶性腹水鉴别诊断中的价值
近年的研究表明,基质金属蛋白酶类(MMPs)、尤其是Ⅳ型胶原酶(包括MMP-2和MMP-9)与多种肿瘤的生长、浸润、转移密切相关.而恶性腹水是恶性肿瘤腹膜侵袭和转移的结果,故可推测恶性腹水中有望检测到Ⅳ型胶原酶.我们通过明胶酶谱法测定各种类型腹水中Ⅳ型胶原酶活性,以期为临床上腹水的鉴别诊断提供重要参考.
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肺癌患者血清磷酸已糖异构酶测定的临床意义
近年来,许多肿瘤标志物已广泛应用于临床,但有关血清酶诊断肺癌的研究文献报告甚少,本文通过观察血清磷酸已糖异构酶(PHI)活性检测对肺癌的临床诊断应用进行探讨.
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颞下颌关节紊乱病关节滑液β-糖苷酶活性检测与临床意义
β-糖苷酶主要参与TMJ滑液透明质酸以及细胞外基质硫酸软骨素等氨基多糖分子的水解,从而引起滑液正常生理功能降低及软骨基质降解破坏,导致TMD发生.我们检测滑液和β-糖苷酶活性,探讨其与TMD不同病理类型的关系.