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激活低氧诱导因子-1的转导通路
低氧诱导因子-1(HIF-1)与心血管缺血、肺高压和癌症等有密切关系,是在低氧的肝细胞癌细胞株hep3B细胞的核提取物中发现的,是一种结合于促红细胞生成素(EPO)基因增强子的寡核苷酸序列的特异蛋白.据报道,许多类型的细胞都可被低氧诱导而产生效应,其中HIF-1起主要作用,提示细胞中普遍存在一个低氧转导机制.一些转录因子,如活化蛋白-1(AP-1)、核因子-κB(NF-κB)、HIF-1[1]都与低氧应激反应有关.哺乳动物细胞对缺氧的适应性反应主要是表达HIF-1,这一过程与某些蛋白基因如醛缩酶A、烯醇化酶α、乳酸脱氢酶LDH、丙酮酸激酶和葡萄糖转移酶-1(GLUT-1)的表达有密切关系[2].
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SELEX技术检测小分子化学物研究进展
Tuerk等[1-2]于1990年发明一种体外筛选新技术,即指数富集的配体系统进化技术(systematic evolution of ligandsby exponential enrichment,SELEX),分别筛选出针对噬菌体T4 DNA聚合酶和有机染料分子的特异性适体.适体(aptamer)指用SELEX技术从体外合成的随机寡核苷酸序列库中人工筛选出的与靶标有高亲和力和特异性结合的寡核苷酸序列.
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雷公藤抑制致敏小鼠T细胞IL-5 mRNA表达及GATA3活性
通过对致敏小鼠T细胞IL-5 mRNA表达和GATA3活性的观察,探讨雷公藤内酯醇(TP)对IL-5基因转录水平的调节机制,并与地塞米松(DM)的作用比较。 材料与方法(1)动物模型建立及分组:BALB/c小鼠24只,随机平均分为4组:正常对照组,以生理盐水代替卵蛋白(OVA)致敏和激发;致敏组,以OVA致敏和激发[1];TP组,每次激发前1 h腹腔注射TP 40 μg/kg体重;DM组,每次激发前1 h腹腔注射DM 10 mg/kg体重。TP组与DM组后一次激发后24 h再给药1次。(2)原位杂交(ISH):制备脾脏T细胞涂片。IL-5寡核苷酸探针序列:5′TCT CAA AGA ACC ACA TTA CTT GTG GCT CAC 3′。随机观察200个细胞,计数杂交阳性T细胞数。(3)凝胶电泳迁移率实验(EMSA):BALB/c小鼠30只,随机分为正常对照组(5只)和致敏组(25只),致敏方法同上。Panning法[2]分离CD+4T细胞,用丝裂霉素C处理的B细胞作为抗原呈递细胞(APCs)。将CD+4T细胞分为4组:A组:正常对照组,即正常小鼠CD+4T细胞;另3组分别为将致敏小鼠CD+4T细胞随机分成的B组:刀豆蛋白A(ConA)刺激组,C组:TP组和D组:DM组。各组加入OVA至终浓度0.2 g/L、ConA至终浓度25 mg/L、1×107个APCs,相应组加入TP至终浓度10-4mol/L,DM至终浓度10-5mol/L。B组取0.5 h、1 h、2 h和4 h时相点,其余组取2 h时相点。GATA3寡核苷酸序列:P1 5′CCT CTA TCT GAT TGT TAG CA,P2 5′ TGC TAA CAA TCA GAT AGA GG,末端标记[γ-32P] ATP。EMSA反应产物经6%聚丙烯酰胺凝胶电泳3 h,-70℃放射自显影8 h。相同实验重复3次。(4)凝胶电泳迁移率竞争实验:特异性竞争抑制实验组:加入100倍和200倍未标记GATA3探针;非特异性竞争抑制实验组:加入200倍非特异性的其它未标记探针序列:P1 5′ATA AAA TTT TCC AAT GTA AA,P2 5′TTT ACA TTG GAA AAT TTT AT。
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核酸适配子在生物医学领域中的应用
1990年Tuerk[1]和Ellingto[2]报道了一种在体外应用随机单链寡核苷酸文库筛选、扩增特定配体的技术,此种技术可以得到能与非核酸靶分子具有高亲和力、高特异性结合的寡核苷酸序列,此技术称为指数富集配基的系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX),筛选出的寡核苷酸序列称为核酸适配子(aptamer).由于核酸适配子与抗体类似,与靶物质结合的特异性和亲和力可甚至优于抗体,加上其靶分子广、稳定性强、易改造修饰等特点,可在基础研究、临床诊断、药物研发等方面得以广泛应用[3]而受到关注.本文对核酸适配子目前在生物医学领域中的应用作一综述.
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pGenesil-2.1-iASPP-shRNA质粒的构建及转染
目的 构建针对iASPP基因的短发卡RNA干扰(iASPP-shRNA)质粒,并转染胃癌细胞AGS(p53野生型).方法 以iASPP为靶基因设计两条带有短发卡结构的寡核苷酸序列,连接到pGenesil-2.1载体,转化感受态大肠杆菌DH5a,提取质粒转染胃癌细胞并培养形成稳定的细胞系,PCR检测转染AGS细胞中的iASPP基因.结果 构建的pGenesil-2.1-iASPP-shRNA质粒测序证实iASPP基因序列完全正确,该质粒转染AGS细胞后,其iASPP基因表达受抑制.结论 成功构建了pGenesil-2.1-iASPP-shRNA质粒,并可成功转染AGS细胞而抑制其iASPP基因的表达.
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反义c-myc寡核苷酸对人肝癌细胞恶性表型的逆转作用
我们采用反义c-myc核酸技术观察反义c-myc寡核苷酸(ODN)对人肝癌 细胞SMMC-7721生长的抑制作用,现将结果报道如下。 一、材料与方法 1.寡核苷酸的合成及修饰:正义、错配及反义c-myc ODN(均为15-mer)的合成和磷酸 基硫代化修饰均由上海生物工程公司完成。设计的序列为:5'ATGCCCCTCAACGTT3' 正义 寡核苷酸序列;5'AACGTTGAGGGGCAT3'反义寡核苷酸序列;5'TACGGGGTTGAGCAA3'错 配链寡核苷酸序列。
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载ATM反义寡核苷酸纳米粒对小鼠SCC Ⅶ细胞放射增敏实验研究
目的 探讨纳米粒作为基因治疗载体的可行性,并研究载ATM反义寡核苷酸纳米粒抑制ATM基因表达对小鼠SCC Ⅶ细胞放射敏感性的影响.方法 采用W/O/W双乳化溶剂蒸发法制备载ATM寡核苷酸纳米粒,并检测其理化性质;载ATM寡核苷酸纳米粒转染SCCⅦ细胞,RT-PCR检测细胞ATM mRNA表达水平;应用细胞克隆形成试验检测细胞放射敏感性,通过流式细胞学检测细胞周期分布和凋亡情况.结果 制备的纳米粒呈圆形,分散性好(PDI=0.1 08±0.052),粒径平均值为(116 ±25.2)nm,包封率达(87.5±4.3)%;转染ATM反义寡核苷酸纳米粒组SCCⅦ细胞ATM mRNA表达有明显下调(P<0.05);转染ATM反义寡核苷酸纳米粒组SCCⅦ细胞放射后细胞存活能力明显低于对照组(P<0.05);流式细胞学检测结果显示转染ATM-ASODN-NP的细胞接受放射治疗后,G2期细胞比例与对照组相比有明显下降,细胞凋亡率升高(P<0.05).结论 纳米粒作为基因治疗的载体有效可行,具有较好的应用前景,ATM基因表达下调导致SCC Ⅶ细胞放射敏感性提高.
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基因芯片及其在肿瘤研究中的应用
基因芯片技术是将成千上万个寡核苷酸序列或cDNA序列规律的排列在1~2cm2的支持物上,然后将荧光标记的样本DNA/mRNA与芯片杂交,并用计算机对杂交信号作出检测从而研究基因表达谱.目前,基因芯片在肿瘤诊断中的应用主要包括肿瘤的分子学分类,预测肿瘤对某些化疗或激素治疗的敏感性,肿瘤的分期,发现新的治疗靶点等方面.本文还对基因芯片的应用前景作一简要介绍.