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EDTA缓冲液在原位杂交中的应用
蛋白酶K在原位杂交技术中通常用于杂交前的处理,它具有消化包围靶DNA蛋白质的作用,以增加探针与靶核酸结合的机会,提高杂交信号.但蛋白酶K的浓度过高、消化时间过长或孵育温度过高时,都会对细胞的结构有一定的破坏,导致组织切片的脱落,细胞核的消失,从而影响杂交结果.EDTA缓冲液可以替代蛋白酶K的作用,解决上述出现的问题,并能达到理想的染色效果.
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应用间期荧光原位杂交技术探讨cyclin D1 基因在乳腺癌中的扩增
本研究将用间期荧光原位杂交(interphase fluorescence in situ hybridization,FISH)技术研究cyclin D1基因在乳腺癌中的变化,为乳腺癌的术后治疗与预后评估提供新的生物学信息。 1.材料与方法:(1)试验材料:选取40例经手术切除治疗而病理诊断为乳腺癌的肿瘤组织,按国际TNM分期法(UICC 1988年)临床上属Ⅰ、Ⅱ期患者20例,Ⅲ、Ⅳ期患者20例。(2)细胞悬液的制备:制备单个细胞悬液,在杂交前2~4 d,将单细胞悬液滴在经处理过的玻片上,自然风干备用。(3)探针的制备:Cyclin D1探针购自Vysis公司(Fluoro-phore直接标记,呈红色)。(4)间期荧光原位杂交检测方法:玻片用100 μl RNA酶(100 μg/ml)37 ℃消化1 h,于70%甲酰胺2×SSC中(73±1)℃变性5 min后脱水,风干;同时将探针混合液(Lysis 杂交Buffer 7 μl,探针1 μl,2 μl纯净水)置(73±1)℃水浴箱内变性5 min,然后将变性探针混合液加于变性的细胞玻片上,封闭,置37 ℃温箱杂交过夜。将盖玻片取下,放入45 ℃ 50% 2×SSC甲酰胺内10 min共3次,然后再放入2×SSC液中洗10 min,后在室温放入加入0.1% NP-40的2×SSC内洗5 min和1 min(室温)凉干,加4′,6-二联脒-2-吲哚苯(DAPI)补染,在荧光显微镜下观看结果。(5)观察结果分析标准:在荧光显微镜下,选取肿瘤细胞分析,观察细胞核内荧光杂交信号并计数。每例计数100~200个细胞核。信号4~10为轻度扩增,10以上为
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骨连接蛋白在正常牙髓和修复性牙本质形成中的基因表达
骨连结蛋白(osteonectin,ON)是一种重要的非胶原糖蛋白,可能参与了牙本质的生物矿化过程[1]。我们利用原位杂交技术,观察ON在正常牙髓和牙髓修复过程中的基因表达特征,探讨ON在修复性牙本质形成中的作用。 1.材料与方法:分别在Wistar大白鼠(体重150~250 g)的上下颌第一磨牙近中面制备单面洞,术后第3及15天处死动物。迅速分离上下颌骨,4%多聚甲醛4℃下固定,10%EDTA脱钙,系列乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,5 μm连续切片,4℃下保存备用。实验中所有试剂均由含DEPC水配制以消除RNA酶的作用。利用T7 RNA多聚酶(Boehringer Mannheim公司)体外转录体系合成ON单链RNA探针,地高辛标记RNA检测试剂盒(Promega公司)标记。根据Holland等[2]的方法将标本与已标记探针进行原位杂交。DAB显色,苏木素淡复染。光镜下检查呈棕色的阳性杂交信号。 2.结果:正常对照的大鼠第二磨牙,杂交信号主要表达于成牙本质细胞层内,成牙本质细胞层下方的牙髓细胞也呈阳性表达,但信号强度低于成牙本质细胞。固有牙髓内的牙髓细胞信号较微弱或不表达。术后3 d组标本可见窝洞下方的成牙本质细胞表达呈强阳性,成牙本质细胞层下方的牙髓细胞也呈阳性表达。固有牙髓内的牙髓细胞也呈阳性表达。前期牙本质和牙本质内表达阴性。15 d组标本,可见修复性牙本质形成。修复性牙本质下方的细胞无极化,缺乏典型的成牙本质细胞表型,为成牙本质细胞样细胞。在成牙本质细胞样细胞内,ON表达阳性,染色均匀。可见扩张的牙髓毛细血管内皮细胞也表达阳性。
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基因芯片技术及其在体育科研中的应用展望
基因芯片是指应用原位合成或微量点样等方法,将大量cDNA片段、肽核苷酸或寡核苷酸探针有序地固化于支持物(如玻璃片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等)的表面,组成密集二维分子排列,然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交,通过激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机等特定仪器对杂交信号的强度扫描分析,从而获得大量的基因序列或表达信息[1].基因芯片的突出特点在于高度并行性、多样性、微型化和自动化.高度的并行性不仅可以大大提高实验的进程,并且有利于基因芯片技术所展示图谱的快速对照和阅读;多样性是指单个芯片中可以进行样品的多方面分析,从而提高分析的精确性,避免因不同的实验条件产生的误差;微型化是当前芯片发展的趋势,其优势是减少试剂用量和减少反应体积,从而提高样品浓度和反应速率.高度自动化可以降低制造芯片的成本和保证芯片的制造质量不易波动.另外,与计算机相连的图像分析系统使研究结果更客观、准确.同时由于生物信息学的迅速发展,为基因芯片的研究提供了物质基础[2].目前,该技术已应用于基因表达分析、新基因发现、基因突变及多态性分析、基因组文库作图、疾病诊断和预测、药物筛选、基因测序、个体化医疗等.此技术为"后基因组计划"时期基因功能的研究及现代医学科学及医学诊断学的发展提供了强有力的工具[1,3].
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RAD18基因在多种细胞及大鼠多种组织中的表达
RAD18基因是人类基因组计划研究的重要模式生物--啤酒酵母的复制后修复上位显性组的重要成员,其编码的产物RAD18蛋白与RAD6蛋白在体内形成紧密的复合物.鉴于DNA修复基因在进化上具有很强的保守性,为探讨RAD18基因在高等动物细胞中存在的意义,我们以全长的RAD18基因为探针,应用染色体原位杂交技术及RNA印迹技术对多种细胞如KGY444(裂殖酵母)、S2(果蝇)、NIH3T3(小鼠)、A10(大鼠)、COS-7(猴)、293(人)等及Wistar大鼠多种组织进行了研究.染色体原位杂交结果显示,上述各种细胞均有很强的RAD18基因杂交信号,而质粒载体片段杂交对照则无信号.RNA印迹杂交结果表明,上述各种细胞及Wistar大鼠心、肝、脾、肺、肾、脑等组织均有RAD18基因表达.这说明RAD18基因无论是在生物进化上,还是在维持细胞的正常功能方面均具有重要意义.本工作为今后克隆哺乳动物及人类该基因同源基因提供了理论依据.
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实验性心肌肥厚大鼠左室c-fos表达及卡托普利的作用
心肌肥厚时,心肌细胞作出适应性反应发生结构改建,这种重构与压力超负荷早期心肌细胞 原癌基因表达过盛密切相关。本文应用大鼠腹主动脉缩窄模型结合血管紧张素转化酶抑制剂 卡托普利(Cap),研究心肌肥厚早期c-fos表达及六周后血压、心功能及酶学指标的改变, 以探讨Cap抑制心肌肥厚的可能机制。1 材料与方法 (1)动物模型复制 采用体重(250±20) g的健康、雄性SD大鼠(由本校动物室提供),按腹主 动脉缩窄法制备压力超负荷性心肌肥厚模型,使腹主动脉残留管腔直径为0.7 mm。 (2)动物分组 动物分成两部分:第一部分:大鼠19 只,其中4只,在腹主动脉缩窄前及缩 窄后1 h、3 h、12 h分别处死,留取心脏。另15只随机均分成手术组、伪手术组、Cap治疗 组(n=5)。复制心肌肥厚模型后3 h处死动物,留取心脏,提取总RNA,检测左室c-fos mRNA表达。第二部分,大鼠30 只,随机均分成手术组(LVH,n=10,腹主动脉缩窄后未 用Cap治疗),伪手术组(sham,n=10,行伪手术)及Cap治疗组[LVH+Cap,n=10,腹 主动脉缩窄后用Cap50 mg/(kg*d)治疗]。建立模型6周后,右颈总动脉插管,记录动脉血 压后,进一步插管入左室,测取并计算左室内压力大上升、下降速率及等容舒张期左室压 力下降的时间常数(T值)。处死动物,留取心脏标本备用。 (3)左心室c-fos mRNA表达 取左室心肌组织50 mg,一步法抽提RNA。用地高辛随机引物法 标记的c-fos探针(华美生物试剂公司,cDNA片段,1.3kb)进行斑点杂交,IBAS图象分析仪 测定杂交信号的相对光密度(IOD)。 (4)心肌重量及质膜Na+-K+ATPase活性测定 称量左室重量(LVW)及体重(BW),计算LVW /BW。制备10%心肌匀浆,差速分离质膜及线粒体。通过检测反应液中ATP水解释放的无机磷 含量来确定酶活性。
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基因芯片技术(上)
1概述1.1基因芯片定义[1~4]基因芯片(Gene Chip),又称DNA 芯片、DNA微阵列(DNA microarray),包括寡核苷酸微阵列(Oligo-microarray)及cDNA microarray,是将大量的DNA片段按预先设计的排列方式固化在载体表面,并以此作为探针,在一定的条件下,与样品中待检测的靶基因片段杂交,通过检测杂交信号,实现对靶基因的存在、含量及变异等信息的快速检测.
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杂交信号放大方法快速检测结核分枝杆菌的实验研究
目的 确定杂交信号放大方法(HSAM)检测结核分枝杆菌的灵敏度和特异性,进而探讨该方法用于检测临床标本的可行性.方法 HSAM法检测合成的IS6110靶基因、结核分枝杆菌标准菌株、大肠埃希菌和表皮葡萄球菌,确定该方法的灵敏度和特异性,并与PCR法进行比较.结果 HSAM少能检测到10合成的靶基因和结核分枝杆菌,与PCR方法灵敏度相近,标准菌株检测结果阳性,大肠埃希菌和表皮葡萄球菌均为阴性,该方法具有较高的特异性.结论 HSAM具有高灵敏度、高特异性及操作简便快速等特点,可作为结核分枝杆菌临床标本检测方法.
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结核分枝杆菌杂交信号放大检测方法的建立
目的 建立结核分枝杆菌杂交信号放大检测方法.方法 构建纳米颗粒信号放大载体,建立杂交信号放大方法,检测标本中结核分枝杆菌特异性的插入序列IS6110.应用该方法检测124份临床结核患者标本,并与细菌培养和生化鉴定法的检测结果进行比较,确定该方法的灵敏度和特异性.结果 杂交信号放大方法检测临床标本的灵敏度为87.7%,特异性为92.2%,假阳性率为7.8%,假阴性率为12.3%.结论 已建立具有较高灵敏度和特异性的杂交信号放大检测方法,该方法操作简便、快速,可作为结核分枝杆菌临床标本的检测方法.
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大鼠胃卵泡刺激素和促性腺激素释放激素受体的共定位
我们先前的研究已经证实,大鼠消化系统广泛分布有促性腺激素释放激素(GnRH)免疫反应性上皮细胞,而且证实这些细胞同样存在GnRH mRNA的杂交信号,说明胃、肠、胰腺能自身合成GnRH[1,2].随后我们又证实大鼠下颌下腺、胰腺和胃含有GnRH的受体[3~5],说明它们又是GnRH的靶器官.但是大鼠消化道是否存在卵泡刺激素(FSH)尚未见报道.为此,我们采用免疫组织化学方法,观察大鼠胃内是否存在FSH免疫反应性物质及其在胃内的分布情况,并进一步研究其与促性腺激素释放激素受体(GnRHR)的共定位关系,为大鼠胃内能否表达FSH及其与GnRH的功能关系提供形态学依据.
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乙型肝炎病毒基因多态性检测芯片的临床应用
在乙型肝炎病毒(HBV)持续感染的过程中,其基因组可自然地或在治疗诱导下出现各种变异而呈多态性,给乙型肝炎的诊断、治疗及判断预后带来许多临床问题.DNA芯片技术是近几年发展起来的进行大规模遗传多态性检测的新方法,我们根据HBV基因多态性位点及突变热点的几种可能突变情况,设计了多条寡核苷酸探针,与聚合酶链反应(PCR)扩增的HBV基因相应区段杂交,根据特定位置上杂交信号的有无和与之相应的探针序列来判定基因突变的类型.同时,测定了99例临床样本和40例献血员样本,取得了较满意的结果,现初步报告如下.
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生物信息学(3):生物芯片技术
生物芯片简介生物芯片(biochip)是由微电子学、物理学、化学、计算机科学与生命科学交叉综合的高新技术.生物芯片的概念源于计算机芯片的概念.在计算机芯片上排列的是集成电路,而生物芯片上排列的是密集的探针阵列.生物芯片一般指将大量的分子探针同时固定于支持物(如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体)的表面上,然后与已标记的待测生物样品中靶分子进行杂交,通过特定的仪器如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机(CCD)对杂交信号的强度进行检测分析,从而判断样品中靶分子的数量.根据芯片上的固定的探针不同可分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片等.
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人胰腺褪黑素受体亚型基因及其蛋白表达的研究
目的:了解褪黑素受体亚型在胰岛B细胞上的分布,为研究褪黑素对胰腺生理功能的调节作用奠定基础.方法:标本来自接受胰腺肿瘤手术的患者,选取远离肿瘤、经光镜下观察为正常的胰腺组织.采用原位杂交、RT-PCR及SP免疫组织化学法检测标本中mt1和MT2受体亚型mRNA及其蛋白的表达.结果:(1)原位杂交结果示胰岛B细胞存在阳性杂交信号;对照切片未发现杂交信号.(2)胰腺组织RT-PCR产物测序结果显示,扩增所获得的基因序列与GenBank的人mt1、MT2受体亚型的基因序列相吻合.(3)免疫组织化学染色示胰岛B细胞内mt1和 MT2受体亚型均呈现阳性反应,散在分布,以胞质为主;mt1和MT2受体亚型的阳性反应基本相同.结论:胰岛B细胞上存在mt1和 MT2受体亚型,提示褪黑素可能对胰岛B细胞有直接的调节作用.
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信号调节蛋白SIRPα在肝癌内的表达及意义
目的:探讨信号调节蛋白SIRPα与肝细胞癌之间的关系.方法:应用Northern杂交技术,检测36对肝细胞癌(HCC)和相应癌旁肝组织,以及1种正常肝细胞系、4种肝癌细胞系内SIRPα基因表达的变化,并结合各组织标本的病理学特点进行分析.结果:SIRPα在20例肝癌组织及两种肝癌细胞系内表达水平明显下降.在两种主要杂交信号中,肿瘤组织内3.9 kb转录子表达量较癌旁组织下降2~4倍,而2.5 kb转录子表达量则下降4~6倍.有9例肿瘤组织在原基因表达水平下降的同时,在3.9 kb转录子的上方又出现一长度稍大的杂交信号,而相应癌旁肝组织内则为阴性.其中,5例有肝内或门静脉转移的肿瘤组织,SIRPα表达全部下降,且均发现有这种新的基因表现形式出现.结论:SIRPα,尤其是2.5 kb转录子在肝癌内表达下降,与肿瘤进展程度密切相关,且肿瘤组织内存在SIRPα相关的新的基因表现形式.SIRPα可能为肝癌发生发展过程中一个重要的调节蛋白.
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寡核苷酸芯片探针固定化和杂交条件的优化
目的探讨寡核苷酸芯片探针固定化的方法,优化杂交条件.方法设计spacer为poly(dT)10~20的长度为15~30 mer的探针,与122~1 067 bp的荧光标记靶序列杂交,杂交温度选择42 ℃~65 ℃,杂交时间选择1~3 h.扫描分析杂交结果,通过Quantarray定量分析软件进行定量.结果较短的如100 bp左右的靶序列,spacer为poly(dT)10、探针为20 mer左右即可获得非常理想的杂交结果.较长的如750 bp左右的靶序列,较短的spacer不能获得理想的杂交结果,可以选择poly(dT)15或poly(dT)20,探针应为20 mer以上,25 mer和30 mer均能获得较好的杂交结果.1 k以上的靶序列与15~30 mer的探针杂交信号较弱.结论通过优化杂交条件可以有效地提高杂交效率.
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原位杂交的技术关键及其应用
原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(in situ hybridization,ISH),其原理是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体,然后再应用与标记物相应的检测系统,通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号,并在显微镜或电子显微镜下进行细胞内定位.
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基因芯片技术应用和展望
基因芯片(Gene Chip)通常指DNA芯片,其基本原理是将指大量寡核苷酸分子固定于支持物上,然后与标记的样品进行杂交,通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量.基因芯片的概念现已泛化到生物芯片(biochip)、微阵列(MICroarray)、DNA芯片(DNA chip),甚至蛋白芯片.基因芯片集成了探针固相原位合成技术、照相平板印刷技术、高分子合成技术、精密控制技术和激光共聚焦显微技术,使得合成、固定高密度的数以万计的探针分子以及对杂交信号进行实时、灵敏、准确的检测分析变得切实可行.
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生物芯片技术的原理
1 分类生物芯片根据点在芯片上的探针的不同分为基因芯片、蛋白质芯片、糖芯片及芯片实验室.1.1 基因芯片(Genechip) 又称DNA芯片,是在基因探针的基础上研制而成.所谓基因探针只是一段人工合成的碱基序列,在探针上连接一些可检测的物质,根据碱基互补的原理,利用基因探针在基因混合物中识别特定基因.其将大量探针分子固定于支持物上与标记的样品进行杂交,通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析.
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风湿性心脏病肺动脉高压患者肺组织肾上腺髓质素受体mRNA的变化
肾上腺髓质素是一种内源性神经肽,它参与了肺动脉高压的形成[1],其作用机制之一是通过特异性受体发挥扩血管作用。我们采用印迹杂交(Northern blot)法检测风湿性心病肺动脉高压患者肺组织肾上腺髓质素受体(AM-R)mRNA的表达,以期探讨肾上腺髓质素在肺动脉高压中的作用机制。 一、材料和方法 1.标本来源:风湿性心脏病患者右肺组织18例,其中男11例,女7例,平均年龄31.7岁。根据平均肺动脉压分为3组[2],每组6例:平均肺动脉压<2.80 kPa(1 kPa=7.5 mm Hg)为肺动脉压正常组;2.80~5.33 kPa为肺动脉高压组;>5.33 kPa为严重肺动脉高压组。正常对照组为无心肺疾病的患者右肺组织5例。 2.探针:人AM-R cDNA探针 (美国 Montuenga 博士惠赠)。 3.方法:(1)肺组织总RNA提取:采用异硫氰酸胍一步法。(2)RNA甲醛变性:取20 μg RN A,加入1×电泳缓冲液、体积分数为17.5%甲醛和50.0%甲酰胺,65 ℃水浴20 min,冰浴2 min。(3)RNA电泳:在质量分数为1%甲醛凝胶、1×电泳缓冲液中80 V预电泳5 min,65 V恒压电泳2 h左右。(4)转膜:采用真空转印仪,20×标准柠檬酸盐中负压400 MPa持续转印0.5 h。(5)Northern blot分析:将尼龙膜放入杂交炉中,55 ℃,转速12 r/min,预杂交4~6 h。再将用α-32P 3-磷酸核糖腺嘌啉标记好的AM-R cDNA探针,加入杂交管中,相同条件下杂交24~36 h。(6)杂交信号的密度扫描:放射自显影后,X光片经显影、定影、水洗、室温下凉干用计算机图像分析仪扫描分析,将各点杂交信号做面积和灰度测定,然后用同一样品3-磷酸甘油醛脱氢酶的杂交信号值做校正,即:AM-R mRNA(%) = (AM-R杂交信号面积×AM-R杂交信号灰度值)/(3-磷酸甘油醛脱氢酶杂交信号面积×杂交信号灰度值)×100%。 4.统计学方法:数据以均数±标准差(****±s)表示,进行方差分析。 二、结果 严重肺动脉高压组、肺动脉高压组、肺动脉压正常组肺组织AM-R mRNA分别为(76.00±1 1.50)%、(97.26±5.79)%、(105.41±12.24)%,合并肺动脉高压组 AM-R mRNA表达明显低于正常对照组(119.31±16.29)%(P<0.05),肺动脉压正常组 AM-R mRNA表达与正常对照组差异无显著性(P>0.05),严重肺动脉高压组AM-R mRN A表达明显低于肺动脉压正常组(P<0.05)。
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问号赖型钩端螺旋体重组质粒pDL121的初步研究
钩端螺旋体病的传染和流行常给人类生命及畜牧业生产造成严重危害.我国曾发生过数十次大规模钩端螺旋体病流行.作为我国两个流行菌型之一的问号赖型钩端螺旋体在生物学特性和致病性有其独特性,但其遗传学特性和致病机制尚不完全清楚.为了探讨问号赖型钩端螺旋体抗原基因的特点,应用六种常见内切酶(BamHI,Bgl Ⅱ,EcoRI, Hind Ⅲ, Pst Ⅰ, Pvu Ⅱ)对从问号赖型钩端螺旋体017株的基因文库中筛选出来的重组质粒pDL121外源基因进行酶谱分析,同时用Digoxin标记的pDL121外源基因片段作探针对不同种属的致病性钩端螺旋体和非致病性钩端螺旋体基因进行杂交分析.结果显示问号赖型钩端螺旋体重组质粒pDL121外源基因没有6种内切酶的酶切位点,重组探针与致病性钩体(serovar lai strain 017, serovar hebdomadis strain 56 610, serovar pomona strain 56 608)有杂交信号,与非致病性钩体(serovar patoc strain Patoc Ⅰ, serovar illini strain 3055)无杂交信号,亦不识别大肠杆菌.结果提示重组质粒pDL121外源基因可能是问号赖型钩端螺旋体的一个新基因,进一步测序分析将揭示该基因本质,同时因该重组探针能鉴别致病性钩体和非致病性钩体,提示其可用于钩端螺旋体病的早期诊断及钩端螺旋体的鉴定和分类.