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人牙髓细胞体外培养的实验研究
目的 建立人牙髓细胞体外培养模型并研究特异性波形丝蛋白在培养细胞中的表达.方法 采用组织块法体外培养人牙髓细胞,取新鲜拔除的无龋、无感染的智齿或正畸牙的牙髓.结果 经7～8d,在组织块周围有细胞游出,14d后细胞铺满瓶底,可以进行传代.一般可传5～8代.持续生长40d左右.SABC免疫组织化学检测培养细胞波形丝蛋白的表达阳性.结论 通过组织块法可以成功培养人牙髓细胞,为牙髓细胞的进一步研究奠定了生物学基础.
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脉冲CO2激光照射对牙髓细胞影响的实验研究
目的 动态观察脉冲CO2激光照射大鼠磨牙后牙髓组织中多种细胞因子在不同时间段和部位的表达,探讨热损伤后牙髓的防御和自我修复机制.方法 采用免疫组织化学染色方法观测能量密度为10.5 J/mm2的脉冲CO2激光照射牙本质过敏症模型大鼠磨牙冠部牙髓组织中热休克蛋白70(HSP-70)、转化生长因子β1(TGF-β1)和骨形成蛋白2(BMP-2)在照射后第4小时,3 d,2和4周时的表达,并对其进行定量分析.结果 HSP-70、TGF-β1,、BMP-2分别在照射后第4小时、2和4周表达强,与其余各时间段的表达差异有显著意义.结论 HSP-70、TGF-β1和BMP-2在损伤早期起防御作用,后期参与牙髓的自我修复过程,并促进修复性牙本质的形成.
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牙髓组织再生中I型胶原支架佳浓度的体外研究
目的：探讨牙髓组织再生研究中不同浓度的I型胶原支架对牙髓细胞的分布及数量的影响,确定佳胶原材料的浓度。方法实验组将10μl移液枪头一端封闭,做为人工根管；对照组为两端开放的10μl移液枪头。体外培养转染绿色荧光蛋白的C57BL/6小鼠牙髓细胞,并将其分别接种于1%,2%和3%的I型胶原支架中,注入10μl的实验组和对照组移液枪头内,于6孔板中培养2周。荧光显微镜下观察牙髓细胞的分布,胰蛋白酶消化后计算各浓度中牙髓细胞的数目。结果对照组各浓度的胶原支架内牙髓细胞均生长良好。实验组1%和2%的I型胶原中的牙髓细胞生长良好,且细胞计数无显著性差异( P>0.05)；浓度为3%的胶原中牙髓细胞在人工根管的中、上段少有生长,且与1%和2%的胶原支架中的牙髓细胞数目差异有统计学意义(P<0.01)。结论 I型胶原支架材料浓度从1%提高到2%,可减少材料的收缩,并能保证细胞生长良好,2%的I型胶原浓度是牙髓组织再生中佳浓度。
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四种修复粘接材料的体外细胞毒性研究
目的 比较4种修复粘接材料—聚羧酸锌水门汀、玻璃离子水门汀( FujiI)、树脂改性玻璃离子水门汀( RelyXTM Luting)、树脂类粘接剂(Super-Bond C&B)对人牙髓细胞的生物学作用.方法 原代培养人牙髓细胞,同时制备各材料样品,浸入α-MEM培养基制取材料浸提液.分别将各材料的浸提液与第4代人牙髓细胞共同培养,以MTF法评价材料的细胞毒性.结果 人牙髓细胞在4种修复粘接材料浸提液作用下,细胞相对增值率(RGR)与对照组相比均有显著性差异(P＜0.05).在相同浸提液浓度组,细胞毒性由低到高排序均为:聚羧酸锌水门汀＜FujiⅠ＜Super-Bond C&B＜ RelyXTM Luting.结论 聚羧酸锌水门汀、玻璃离子水门汀(Fujil)、树脂类粘接剂(SuperBond C&B)具有轻度细胞毒性.树脂改性玻璃离子水门汀(RelyXTM Luting)具有中度细胞毒性.
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骨连接蛋白在正常牙髓和修复性牙本质形成中的基因表达
骨连结蛋白（osteonectin，ON）是一种重要的非胶原糖蛋白，可能参与了牙本质的生物矿化过程［1］。我们利用原位杂交技术，观察ON在正常牙髓和牙髓修复过程中的基因表达特征，探讨ON在修复性牙本质形成中的作用。 1．材料与方法：分别在Wistar大白鼠（体重150～250 g）的上下颌第一磨牙近中面制备单面洞，术后第3及15天处死动物。迅速分离上下颌骨，4％多聚甲醛4℃下固定，10％EDTA脱钙，系列乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，5 μm连续切片，4℃下保存备用。实验中所有试剂均由含DEPC水配制以消除RNA酶的作用。利用T7 RNA多聚酶（Boehringer Mannheim公司）体外转录体系合成ON单链RNA探针，地高辛标记RNA检测试剂盒（Promega公司）标记。根据Holland等［2］的方法将标本与已标记探针进行原位杂交。DAB显色，苏木素淡复染。光镜下检查呈棕色的阳性杂交信号。 2．结果：正常对照的大鼠第二磨牙，杂交信号主要表达于成牙本质细胞层内，成牙本质细胞层下方的牙髓细胞也呈阳性表达，但信号强度低于成牙本质细胞。固有牙髓内的牙髓细胞信号较微弱或不表达。术后3 d组标本可见窝洞下方的成牙本质细胞表达呈强阳性，成牙本质细胞层下方的牙髓细胞也呈阳性表达。固有牙髓内的牙髓细胞也呈阳性表达。前期牙本质和牙本质内表达阴性。15 d组标本，可见修复性牙本质形成。修复性牙本质下方的细胞无极化，缺乏典型的成牙本质细胞表型，为成牙本质细胞样细胞。在成牙本质细胞样细胞内，ON表达阳性，染色均匀。可见扩张的牙髓毛细血管内皮细胞也表达阳性。
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抑制Notch信号通路对人牙髓细胞的生物学效应
目的 评价抑制Notch信号通路后人牙髓细胞在细胞、代谢酶、基因3个水平的老化指标变化,探讨Notch信号通路对人牙髓细胞老化的作用.方法 采用γ-分泌酶抑制剂3,5-二氟苯乙酰-L-丙氨酰-S苯基甘氨酸t-丁酯抑制Notch信号通路后(抑制组)观察细胞形态,以正常培养基中添加抑制剂的溶剂二甲基亚砜为阴性对照组,检测两组碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性、细胞老化相关β-半乳糖苷酶以及老化相关基因p53的表达.结果 抑制Notch信号通路后人牙髓细胞从第10代开始出现细胞形态老化的表现.抑制组自第8代即出现ALP阳性细胞减少,ALP活性下降为(35.36±2.55) U/g,显著低于阴性对照组[(49.76±4.30) U/g](t=4.989,P=0.008).抑制组第8代细胞即开始出现老化相关β-半乳糖苷酶阳性染色,第10代时出现大量阳性染色细胞.第10代时,抑制组细胞p53基因相对表达量(1.7±0.4)显著高于阴性对照组(设为1.0)(t=3.581,P=0.012).结论 抑制Notch信号通路后,人牙髓细胞在细胞、代谢酶、基因3个水平均出现老化前移表现,提示Notch信号通路可以影响人牙髓细胞的生命周期.
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胞壁酰二肽对人牙髓细胞分化影响的研究
目的 探讨天然免疫受体核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2(nucleotide-binding oligomerization domain-2,NOD-2)在深龋牙髓组织中的表达及NOD-2特异性配体胞壁酰二肽(muramyl dipeptide,MDP)对人牙髓细胞分化的影响.方法 实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测深龋及健康人牙髓组织中NOD-2表达差异;1 mg/L MDP刺激体外培养的人牙髓细胞0、2、6、12、24 h,实时荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹法及免疫荧光检测NOD-2基因及蛋白表达;不同质量浓度MDP刺激人牙髓细胞24 h,蛋白质免疫印迹法检测24 h后牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)的表达;0.1 mg/L MDP 作用于人牙髓细胞0、2、6、12、24 h,检测不同时间点牙本质涎磷蛋白(sialophosphoprotein,DSPP)、骨钙蛋白mRNA及骨桥蛋白的表达.结果深龋牙髓组织中NOD-2 mRNA相对表达量为(0.2610±0.0824),较健康牙髓组织(0.0024±0.0002)显著增高(P<0.05).实时荧光定量PCR及蛋白质印迹法结果显示NOD-2表达随时间上调,免疫荧光检测证实NOD-2蛋白表达于胞质.MDP质量浓度为0.1 mg/L时DSP蛋白表达量大(0.3782±0.0564),并随MDP质量浓度增加而下降;DSPP、骨钙蛋白mRNA表达呈时间依赖性,12 h达大值,24 h后有所下降;骨桥蛋白表达量随时间上调.结论深龋牙髓组织中NOD-2表达升高,MDP与人牙髓细胞的分化相关.
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人牙髓细胞在体外传代培养过程中的生物学行为变化
目的 探讨人牙髓细胞在体外传代过程中的生物学行为变化,为其在口腔材料生物相容性及牙髓损伤修复等研究中的应用提供依据.方法 选取第4、8、10和15代人牙髓细胞,从细胞形态及增殖能力、碱性磷酸酶活性、老化相关β-半乳糖苷酶的表达及p53基因的表达对牙髓细胞进行评价.结果 人牙髓细胞培养至第15代时,胞质增大、胞体扁平,增殖缓慢,第7天时A值仅为0.124±0.017,显著低于第4、8代(A值分别为0.391±0.030、0.317±0.049)(F=126.465,P =0.000);第15代细胞的碱性磷酸酶活性[(21.96±4.03) U/g蛋白]显著低于第4、8、10代细胞[分别为(85.67 ±4.64)、(84.22 ±2.99)、(29.64±3.53) U/g蛋白](P=0.000),并出现了大量β-半乳糖苷酶染色阳性细胞,p53基因表达显著上升,其相对表达量为(2.3±0.1),与第4代(设为1.0)比较差异有统计学意义(t=18.622,P=0.000).结论 人牙髓细胞在传代培养过程中细胞体积增大、代谢酶指标下降、细胞老化相关酶及p53基因表达升高.
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人牙髓细胞内皮向分化中 miRNA 的表达及生物信息学分析
目的研究人牙髓细胞内皮向分化时差异表达的微小RNA（ microRNA，miRNA）并进行生物信息学分析，初步探讨miRNA在人牙髓细胞内皮向分化中的作用。方法以添加50μg/L血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor ，bFGF）和2％胎牛血清的培养基培养人牙髓细胞7 d为诱导组，以未诱导的人牙髓细胞为对照组，实时荧光定量PCR检测血管内皮标志基因血小板-内皮细胞黏附分子（ CD31）、冯·维勒布兰德因子（ von Willebrand factor ， vWF ）和血管内皮细胞钙黏着蛋白（ vascular endothelial-cadherin，VE-cad）的表达；体外成管实验检测诱导后细胞的成管能力；通过miRNA表达谱芯片检测miRNA的表达并采用实时荧光定量PCR进行验证；运用生物信息学软件预测差异表达miRNA调节的靶基因及可能涉及的生物学功能和信号通路。结果实时荧光定量PCR结果显示，CD31、vWF和VE-cad在对照组牙髓细胞中的相对表达量分别为（3.48±0.22）×10-4、（3.13±0.31）×10-4和（39.60±2.36）×10-4，而在诱导组的相对表达量则分别为（19.57±2.20）×10-4、（48.13±0.54）×10-4及（228.00±8.89）×10-4，3种基因在诱导组的表达均较对照组显著上调（P＜0.05）；成管实验显示，诱导后细胞在基质胶上可形成类似小管样结构；基因芯片结果显示，人牙髓细胞内皮向诱导后差异表达的miRNA有47个，其中15个miRNA表达上调，32个miRNA表达下调；实时荧光定量PCR对上述部分差异表达miRNA的验证结果与芯片结果基本一致；生物信息学分析显示，上述差异表达miRNA的靶基因显著富集于转录调控、细胞运动、血管形态、血管新生和细胞骨架蛋白等生物学功能，且与丝裂原活化蛋白激酶通路和Wnt通路等信号通路有关。结论人牙髓细胞内皮向诱导后存在miRNA的差异表达，为牙髓细胞的分化机制和牙髓血管新生提供新的思路。
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巨噬细胞游走抑制因子在人牙髓中的表达及对牙髓细胞增殖的影响
目的 研究正常及炎症牙髓组织中巨噬细胞游走抑制因子(macrophage migration-inhibitory factors,MIF)的表达及其对人牙髓细胞(human dental pulp cells,HDPC)增殖的影响,以期探讨MIF在牙髓炎症中的可能作用.方法采用免疫组织化学和实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测健康及炎症牙髓组织中MIF的表达情况,并以不同质量浓度[0(对照组)、0.1、1.0、10.0 mg/L]脂多糖刺激HDPC 24 h,ELISA法检测HDPC培养上清液中MIF含量的变化;不同质量浓度(10、30、60 μg/L)的重组人MIF分别作用于HDPC 24和48 h,细胞计数试剂盒法检测细胞增殖率.结果 健康牙髓组织中MIF主要分布于成牙本质细胞层,炎症牙髓组织中MIF分布于成牙本质细胞、炎症细胞、牙髓成纤维细胞和血管内皮细胞中;MIF mRNA在正常牙髓组织和炎症牙髓组织中的表达差异无统计学意义(P>0.05);不同质量浓度脂多糖刺激HDPC后对照组MIF质量浓度为(1048.53±161.81) ng/L,0.1和1.0 mg/L组MIF分泌量[分别为(1772.58±495.05)、(1692.58±337.45) ng/L]与对照组相比均显著升高(P<0.05),约为对照组的1.5倍;10、30、60 μg /L 重组人MIF均可促进HDPC的增殖(P<0.05).结论 MIF在人牙髓组织中有表达且一定浓度脂多糖可促进HDPC MIF的分泌,重组人MIF可促进HDPC增殖,MIF可能在牙髓炎症发展过程中发挥一定作用.
关键词： 牙髓炎 巨噬细胞游走抑制因子 牙髓细胞 -
无翅型MMTV整合位点家族成员10A在人牙髓组织和细胞中的表达
目的 观察无翅型MMTV整合位点家族成员10A(wingless-type MMTV integration site family,member 10A,Wnt10A)及Wnt通路相关分子在人牙髓组织和牙髓细胞中的表达特征,为进一步研究Wnt10A在人牙髓细胞增殖分化中的作用提供分子生物学依据.方法 选取因正畸或治疗原因拔除的完整离体双尖牙和第三磨牙,免疫组化法观察Wnt10A在牙髓组织中的定位表达,PCR法观察Wnt10A、Wnt通路下游分子及成牙本质细胞分化标志物(轴心抑制蛋白2、Dickkopf相关蛋白1、低密度脂蛋白受体相关蛋白4、淋巴增强因子1、骨钙蛋白、碱性磷酸酶、牙本质涎磷蛋白)在牙髓组织中的表达.采用酶组织块消化法体外培养人牙髓细胞并传代培养；PCR法分析第1～9代人牙髓细胞中Wnt10A、Wnt通路下游分子及成牙本质细胞分化标志物的表达水平.结果 免疫组化法和半定量PCR法结果显示Wnt10A和Wnt通路相关分子在牙髓组织中均有表达.体外培养的人牙髓细胞培养至第15天汇合并传代,传至第4代,细胞活跃增殖,细胞胞质清亮,伸展均一；至第9代,细胞增殖减缓,部分细胞死亡.Wnt10A和Wnt信号通路下游分子在整个牙髓细胞的体外传代培养中均有表达,牙本质涎磷蛋白在第4代牙髓细胞中表达水平高(0.4178 ±0.0076),Wnt10A在第5、9代牙髓细胞中的表达水平[分别为(4.97 ±2.83)、(4.70±4.06)]均显著高于第2、4代[分别为(0.84 ±0.66)(0.70±0.45)](P＜0.05).结论 Wnt10A介导的Wnt信号通路在人牙髓组织和细胞中有表达激活,可能参与了成牙本质细胞的分化和牙本质的形成.
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细胞外基质磷酸化糖蛋白在人牙髓细胞成牙本质分化中的表达
义(P<0.05).蛋白质印迹法检测显示各矿化标记的蛋白表达均较对照组上调.结论 在hDPC诱导成牙本质分化的过程中,MEPE与DSPP、DSP、BSP、Ⅰ型胶原呈现相似的表达变化趋势,提示MEPE与hDPC的成牙本质分化有关,可作为hDPC向成牙本质样细胞分化的标志.
关键词： 牙髓细胞 细胞外基质磷酸化糖蛋白 成牙本质分化 -
氢氧化钙对人牙髓细胞中骨涎蛋白基因转录的影响
目的 观察氢氧化钙对人牙髓细胞中骨涎蛋白基因转录的影响,研究氢氧化钙诱导矿化的机制,为研制更有效的盖髓剂提供实验依据.方法 收集天津医科大学口腔医院口腔颌面外科门诊因正畸拔除的双尖牙15颗,提取牙髓组织并进行细胞培养,将培养传代的人牙髓细胞分成不同浓度(0.012、0.120、0.400和1.200 mmol/L)氢氧化钙实验组和对照组,提取总RNA,通过实时定量聚合酶链反应实验,检测确定人牙髓细胞中氢氧化钙对骨涎蛋白mRNA水平的佳刺激浓度.同时,检测佳浓度氢氧化钙在不同时间点(0、3、6、12和24 h)对骨涎蛋白、核心结合蛋白因子2(runt-related transcription factor-2,Runx-2)和成骨细胞特异性转录因子(osterix,OSX) mRNA水平的影响；通过瞬时转染实验,将人骨涎蛋白基因不同长度片段的启动子插入荧光素酶基因中,通过脂质体瞬时转染进人牙髓细胞,检测骨涎蛋白启动子在氢氧化钙实验组和对照组中转录活性的变化.组内和组间比较均采用两独立样本t检验,以双侧P＜ 0.05为差异有统计学意义.结果 实时定量聚合酶链反应实验中,佳刺激浓度1.200 mmol/L氢氧化钙作用人牙髓细胞12h后,骨涎蛋白mRNA的水平增长为(2.86±0.09),而1.200 mmol/L氢氧化钙在不同的时间点(0、3、6、12和24 h)刺激细胞,骨涎蛋白mRNA水平6h时为(1.45±0.36),12 h时增长到(2.66±0.18)；Runx-2 mRNA水平在6h时为(2.38±0.08),12h时增长到(2.73±0.16),24 h时下降至初始水平；OSX mRNA的水平从12 h开始增长,24 h达峰值(3.30±0.06).瞬时转染实验也证实了氢氧化钙刺激人牙髓细胞12h后,人骨涎蛋白基因- 84LUC ～ - 868LUC启动子转录活性氢氧化钙刺激组比对照组增强了2.00～2.60倍.结论 氢氧化钙诱导矿化中增强了人骨涎蛋白基因的转录,转录位点可能位于人骨涎蛋白基因启动子的- 84 ～ - 868区域.
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干扰八聚体转录结合因子4A对人牙髓细胞增殖与多向分化能力的影响
目的 研究八聚体转录结合因子4A(octamer-binding transcription factor 4A,Oct4A)在人牙髓细胞(human dental pulp cells,DPC)的表达及对细胞增殖、成牙本质向和成脂向分化能力的影响.方法 实时荧光定量PCR(reahi mequantitative PCR,RT-qPCR)技术检测健康人DPC中Oct4A的表达；合成特异性针对Oct4A的siRNA(Oct4A干扰组),50 nmol/L siRNA经脂质体LipofectamineTM RNAiMAX转染DPC 24、48、72、96和120 h,以无义序列-siRNA转染的DPC作为阴性对照,细胞计数试剂盒法检测细胞增殖情况、RT-qPCR检测Oct4A的mRNA水平以选取佳转染时间；茜素红染色检测成牙本质诱导DPC 14 d后矿化结节形成情况,油红O染色检测成脂诱导DPC 14 d后脂滴形成情况,RT-qPCR技术检测成牙本质向分化标志物牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)和成脂向分化标志物脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)的mRNA表达变化；蛋白质印迹法检测DSPP和LPL的表达.结果 Oct4A在第3代DPC中表达高(2.10±0.10),为第1代DPC的2.10倍(与第1、7代相比P =0.000),之后随细胞传代表达下降；Oct4A-siRNA转染DPC 72 h,干扰效率达峰值(69.7％)；与正常细胞组及阴性对照组相比Oct4A干扰组细胞增殖能力显著下降,矿化结节和脂滴形成显著减少(P =0.000),分化标志物DSPP和LPL表达量显著下降(P =0.000).结论 瞬时干扰牙髓细胞中Oct4A的表达可以降低细胞增殖和成牙本质向、成脂向分化能力.
关键词： 细胞增殖 细胞分化 牙髓细胞 八聚体转录结合因子4A -
釉基质蛋白对人牙髓细胞中骨涎蛋白表达的影响
目的 探讨釉基质蛋白(emdogain,EMD)对人牙髓细胞中骨涎蛋白基因mRNA和蛋白水平的影响,以期发现EMD诱导矿化的机制.方法 从2011年5至7月天津医科大学口腔医院口腔颌面外科门诊因正畸需要拔除的15颗健康双尖牙中提取人牙髓组织,并传代培养人牙髓细胞,分成不同质量浓度(25、50、100和250 mg/L)EMD组和空白对照组,在培养1、3、5、7d提取总RNA,通过实时定量PCR法检测EMD对骨涎蛋白mRNA表达水平的影响；通过蛋白质印迹法检测EMD刺激入牙髓细胞1、3、5、7d骨涎蛋白在蛋白水平的表达变化.结果 实时定量PCR结果显示,在1、3、5、7d,25、50、100和250 mg/L EMD组的骨涎蛋白表达(7d时分别为1.79 ±0.03、2.03±0.10、2.67±0.08、2.94±0.07)与空白对照组(7 d:1.06±0.11)相比差异均有统计学意义(P ＜0.001)；相同质量浓度(250 mg/L)的EMD在不同时间点(1、3、5、7 d)刺激细胞,骨涎蛋白的表达(2.30±0.06、2.65±0.05、2.76±0.05、2.94 ±0.07)各组间相比差异均有统计学意义(P＜0.05)；蛋白质印迹法结果显示,250 mg/L EMD可以促进人牙髓细胞骨涎蛋白表达增加,随着刺激时间的延长,骨涎蛋白表达明显增强.结论 EMD能诱导人牙髓细胞中骨涎蛋白基因mRNA和蛋白水平的增长.
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人牙髓细胞向成牙本质细胞分化的蛋白质组学研究
目的 采用蛋白质组学方法分析人牙髓细胞向成牙本质细胞分化过程中细胞蛋白表达谱的改变,揭示特征蛋白在分化过程中所起的作用.方法对人牙髓细胞进行矿化诱导,提取诱导前后细胞总蛋白,双向电泳分离蛋白质,DeCyder V6.0软件确定差异蛋白点,质谱鉴定差异蛋白质.结果双向电泳确认46个差异蛋白质斑点,质谱鉴定20个蛋白斑点,差异蛋白质涉及细胞周期调节、能量代谢、信号传导等细胞生物学过程.结论蛋白质组学技术可高通量筛选与人牙髓细胞向成牙本质细胞分化相关的功能蛋白.
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人牙髓细胞与牙周韧带细胞多向分化能力的比较
目的 比较人牙髓细胞(dental pulp cells,DPC)和牙周韧带细胞(periodontal ligamentcells,PDLC)的多向分化能力,揭示其干细胞成分特征,为开展干细胞介导的生物牙根再生奠定实验基础.方法 酶消化法分离培养人DPC和PDLC,流式细胞术检测STRO-1的表达.诱导细胞成牙本质及成骨分化、成脂分化和成软骨分化,von Kossa染色、抗骨钙素(osteocalcin,OCN)和牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)免疫组化染色、油红O染色、阿新蓝染色、抗Ⅱ型胶原免疫组化染色以及实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)等检测DPC和PDLC的多向分化.结果 DPC和PDLC体外呈克隆样生长,STRO-1阳性率分别是(16.5%±4.2%)和(11.6%±1.1%).100%的DPC和83.3%的PDLC样本可多向分化.细胞诱导分化后,OCN、牙本质涎磷蛋白(dentinsialophosphoprotein,DSPP)、过氧化物酶体激活物增生受体2(peroxisomal proliferator activated receptorgamma 2,PPARγ2)、脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)和Ⅱ型胶原mRNA表达上调,与诱导前相比差异均有统计学意义(P<0.001),DPC和PDLC间OCN和PPARγ2基因上调倍数的差异有统计学意义(P<0.001).结论 人DPC和PDLC的间充质干细胞比例和多向分化能力相似.
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覆盖富血小板血浆3D打印聚己内酯支架对牙髓细胞体外生物学行为的影响
目的 探讨覆盖不同处理方法 富血小板血浆(PRP)的3D打印聚己内酯(PCL)支架对牙髓细胞黏附、增殖及分化的影响.方法 用冻干法和凝胶法制备PRP并覆盖在3D打印的聚己内酯支架上,免疫荧光染色观察各组支架牙髓细胞的早期黏附情况,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖情况,Transwell小室检测细胞迁移情况,碱性磷酸酶(ALP)试剂盒测定ALP活性,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测细胞成骨相关基因的表达.采用单因素方差分析进行统计分析,LSD-t检验进行两两比较.结果 免疫荧光结果 显示黏附在冻干组的细胞多(1999.33个/总视野),凝胶组次之(1043.33个/总视野),单纯支架组少(843.00个/总视野),而且冻干组和凝胶组相比,差异有统计学意义(F=19.36,P<0.01),冻干组和单纯支架组对比,差异有统计学意义(F=23.42,P<0.01).细胞增殖实验显示,3组支架的细胞都呈增长趋势,但是在各个测定时间点,任何2组之间的细胞增殖都没有显著差异.细胞迁移结果 显示,冻干组(279.75个/视野)和凝胶组(167.00个/视野)的细胞数目显著高于单纯支架组(134.75个/视野),差异有统计意义(F冻单组=7.45、F凝单组=1.88,P<0.01),而冻干组和凝胶组相比则差异无统计学意义.ALP活性结果 显示,3个组别中冻干组活性高(ALP7 d=12.57 U/gprot、ALP14 d=23.20 U/gprot、ALP21 d=58.98 U/gprot),在第7天凝胶组次之(6.65 U/gprot),单纯支架组低(5.93 U/gprot),而在第14和21天,单纯支架组次之(ALP14 d=15.56 U/gprot、ALP21 d=53.74 U/gprot),凝胶组低(ALP14 d=13.35 U/gprot、ALP21 d=47.83 U/gprot).在第7、14和21天,冻干组的ALP活性显著高于凝胶组(F7 d=3.20,P7 d<0.01;F14 d=5.34,P14 d<0.01;F21 d=6.04,P21 d<0.01)和单纯支架组(F7 d=3.60,P7 d=0.04;F14 d=4.14,P14 d<0.01;F21 d=2.84,P21 d=0.01).在第7和14天,凝胶组和单纯支架的细胞ALP活性相比差异没有统计学意义.成骨相关基因表达中,在第7和14天的RUNX2和OCN表达中,除了第14天的凝胶组的OCN表达外,冻干组(OCN7 d=4.67、RUNX27 d=2.32、RUNX214 d=5.88)的表达高于单纯支架组(OCN7 d=1.00、RUNX27 d=1.00、RUNX214 d=1.00),差异具有统计意义(F7 d=11.1,P7 d<0.01;F7 d=3.20,P7 d=0.04;F14 d=11.80,P14 d<0.01),凝胶组(OCN7 d=2.60、RUNX27 d=2.23、RUNX214 d=4.67)的表达显著高于单纯支架组,差异有统计学意义(F7 d=4.85,P7 d<0.01;F7 d=2.98,P7 d=0.03;F14 d=8.87,P14 d<0.01).在第7天的OCN和第14天的RUNX2的表达中,冻干组(OCN7 d=4.67)的表达水平高于凝胶组(OCN7 d=2.60),差异有统计学意义(F=6.26,P<0.01);而在第14天的OCN中,凝胶组表达和冻干组无明显差异.结论 覆盖PRP的3D打印PCL支架比单纯的支架更有利于牙髓细胞的黏附、增殖和成骨分化,且冻干法优于凝胶法.
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组蛋白去甲基化酶KDM5A在人牙髓细胞及成牙本质细胞分化中的表达
目的：探讨组蛋白赖氨酸去甲基化酶KDM5A在人牙髓细胞(hDPC)中的表达模式及成牙本质分化诱导对其表达量的影响。方法体外培养hDPC,实时荧光定量聚合酶链反应和Western blot检测第1代至第8代(P1~P8代)hDPC中KDM5A mRNA和蛋白的表达量；免疫荧光检测KDM5A在hDPC中的分布；对P3代细胞进行成牙本质分化诱导,于第7天和第14天分别检测KDM5A mRNA和蛋白的表达水平。结果体外传代培养hDPC中可检测到KDM5A的表达,KDM5A mRNA和蛋白量均呈先增加后减少的趋势；hDPC细胞质及细胞核中均表达KDM5A；成牙本质向分化诱导7和14 d, KDM5A mRNA和蛋白量高于未诱导组细胞,诱导14 d表达量高于诱导7 d(P<0.05)。结论 hDPC表达KDM5A,矿化诱导可提高KDM5A的表达。
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转录共激活子p300在人牙髓细胞中的表达及成牙本质向分化对其表达的影响
目的 探讨体外培养人牙髓细胞中转录共激活子p300的表达模式,及成牙本质向分化诱导是否影响牙髓细胞中p300的表达水平.方法 体外培养人牙髓细胞,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)和Western blot检测P0到P7代细胞中p300 mRNA和蛋白的表达情况;取P3代细胞进行成牙本质向分化诱导,于第7天和第14天分别检测p300 mRNA和蛋白的表达量.结果 体外培养人牙髓细胞中可检测到p300表达,表达量随细胞传代逐渐减少(P＜0.05);成牙本质向分化诱导7天和14天,p300表达量低于未诱导组细胞(P＜0.05),诱导14天表达量低于诱导7天(P＜0.05).结论 人牙髓细胞中表达p300,表达量随体外培养传代逐渐减少;成牙本质向分化诱导下调p300表达水平.
关键词： 转录共激活子p300 牙髓细胞 成牙本质向分化
