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WI-38细胞衰老与蛋白磷酸酶2A催化亚基甲基化的关系研究
目的 构建WI-38细胞连续培养衰老模型,并探讨WI-38细胞衰老与蛋白磷酸酶2A催化亚基(PP2Ac)去甲基化水平的关系.方法 连续培养WI-38细胞株直至细胞衰老而停止增殖,以群体倍增次数(population doubling level,PDL)记录细胞代龄并收集年轻细胞和衰老细胞,利用刃天青还原率检测细胞增殖活性,细胞衰老特异性β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测细胞衰老率,Western blotting检测细胞内去甲基化PP2Ac的表达水平.结果 WI-38细胞连续培养至第43代时细胞停止增殖;衰老组细胞(43PDL)增殖活性明显低于年轻组(23PDL),差异具有统计学意义(P＜0.01);衰老组细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率明显高于年轻组,达93％,是年轻组的4.5倍;衰老组细胞去甲基化PP2Ac蛋白表达水平明显上升,是年轻组的3.3倍.结论 WI-38细胞复制性衰老与细胞内蛋白磷酸酶2A催化亚基(PP2Ac)的去甲基化表达水平相关.
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人胚肺成纤维细胞衰老过程中P66Shc 启动子区CpG岛甲基化状态
目的 探讨人胚肺成纤维细胞复制性衰老及过氧化氢诱导的早衰过程中P66Shc的表达改变及其启动子 区域的甲基化水平变化.方法 荧光定量PCR方法检测细胞衰老过程中的mRNA表达改变,甲基化特异性PCR(MSP)定性检测甲基化的变化情况,亚硫酸氢盐修饰基因组结合克隆测序定量检测启动子区域CpG岛甲基化水平.结果 人胚肺成纤维细胞复制性衰老及过氧化氢诱导的早衰过程中,P66Shc的mRNA表达水平逐渐升高,中年细胞组及复制性衰老细胞组mRNA表达分别升高至1.78和1.73倍,而早衰组却显著增高,至7.16倍；年轻细胞组、复制性衰老细胞组及早衰组P66Shc启动子区域CpG岛呈高甲基化水平,分别为94％、90％和90％.结论 人胚肺成纤维细胞复制性衰老过程中P66Shc的mRNA表达水平逐渐升高,其启动子区CpG岛呈高的甲基化水平,不参与该基因表达调控.
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细胞衰老过程中P53表观遗传学修饰
目的 检测体外培养的人胚肺成纤维细胞复制性衰老过程中及过氧化氢诱导细胞早衰阶段P53的表观遗传学修饰.方法 荧光定量采用聚合酶链式反应法(PCR)检测P53的mRNA表达,甲基化特异PCR检测启动子区甲基化改变情况,染色质免疫沉淀结合定量PCR检测其组蛋白修饰,包括组蛋白H3,H4乙酰化和H3(Lys4)及H4(Lys20)甲基化修饰.结果 细胞复制性衰老过程中,P53的mRNA表达在中年细胞组显著升高,复制性衰老细胞组也升高,早衰组无明显改变;细胞复制性衰老过程中,其启动子区-820 bp～-656 bp甲基化水平随增龄而降低,早衰组降低明显;复制性衰老细胞组及早衰组的组蛋白修饰在启动子区-889 bp～-676 bp以组蛋白H3(Lys4)甲基化修饰为主;-199 bp～-30 bp的修饰,复制性衰老细胞组以组蛋白H3,H4乙酰化修饰为主,早衰组以H4乙酰化,H3K4甲基化修饰为主.结论 细胞衰老过程中,P53启动子区组蛋白修饰参与其mRNA表达调控,复制性衰老与早衰存在调控机制的差异.
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细胞复制性衰老及过氧化氢诱导的早衰过程中基因组DNA甲基化水平改变
目的 检测体外培养的人胚肺成纤维细胞复制性衰老及过氧化氢诱导的细胞早衰过程中基因组DNA甲基化及甲基转移酶DNMT1的表达改变.方法 应用5-甲基胞嘧啶免疫荧光法及[~3H]甲基掺人法检测细胞衰老不同阶段细胞基因组DNA整体甲基化变化趋势,以Q-PCR和Western Blot方法检测DNMT1的mRNA和蛋白表达变化.结果 细胞复制性衰老过程及早衰过程中,与年轻细胞组相比,5-甲基胞嘧啶免疫荧光强度逐渐降低,[~3H]甲基掺入实验结果显示,甲基化的CpG%分别为年轻细胞组68.2%,中年细胞组41.9%,复制性衰老组16.1%,而早衰起始组63.5%,早衰持续组18.0%.DNMT1的mRNA和蛋白表达水平一致,在细胞复制性衰老过程中,DNMT1表达呈下降趋势,复制性衰老细胞组表达水平低,而早衰起始组DNMT1表达显著升高,早衰持续组又降低至同复制性衰老组水平.结论 本试验条件下,在细胞复制性衰老及早衰过程中,基因组DNA甲基化水平逐渐降低,基因组低甲基化是衰老细胞的伴随状态,与DNMT1水平降低有关.
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人胚肺成纤维细胞衰老过程中Foxa2启动子区组蛋白修饰变化
目的 检测体外培养的人胚肺成纤维细胞复制性衰老过程中及过氧化氢诱导细胞早衰阶段Foxa2启动子区的组蛋白修饰变化.方法 按传代情况将人胚肺成纤维细胞分为年轻细胞(22 population doubling levels,22PDL)组、中年细胞(35PDL)组、复制性衰老细胞(49PDL)组和氧化应激诱导的早衰细胞(premature senescence,PS)组.采用荧光定量PCR检测Foxa2的mRNA表达水平,染色质免疫沉淀方法检测其启动子区IP1(-740 bp～-596 bp)、IP2(-187 bp～ +84bp)的组蛋白修饰,包括组蛋白H3、H4乙酰化及H3(Lys4)、H4(Lys20)甲基化修饰.结果 与年轻细胞组比较,复制性衰老细胞组和早衰组人胚肺成纤维细胞Foxa2 mRNA表达水平均降低,差异有统计学意义(P＜0.05),中年细胞组无明显变化.在Foxa2 IP1启动子区,衰老的细胞具有降低的H3组蛋白乙酰化和增加的H4(Lys20)甲基化修饰；在IP2启动子区,衰老的细胞具有降低的H3(Lys4)甲基化修饰特征.结论 在细胞衰老过程中,Foxa2启动子区特异的组蛋白修饰参与调控其mRNA表达水平.
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人胚肺成纤维细胞衰老过程中胰岛素样生长因子2表观遗传活化作用
目的 观察体外培养人胚肺成纤维细胞复制性衰老过程中及过氧化氢诱导早衰持续阶段胰岛素样生长因子2(IGF2)表观遗传学修饰.方法 荧光定量PCR检测 IGF2的mRNA表达,甲基化特异PCR检测其启动子区甲基化改变,染色质免疫沉淀结合定量PCR检测组蛋白修饰,包括组蛋白H3、H4乙酰化,H3(Lys4)及H4(Lya20)甲基化修饰.结果 细胞复制性衰老过程中,中年细胞组及复制性衰老细胞组IGF2的mRNA表达升高,早衰持续组升高显著;细胞衰老过程中,仅复制性衰老细胞组在启动子区-658～ -456 bp具有一定的甲基化水平;复制性衰老细胞组的组蛋白修饰在启动子区-856 ～ -634 bp以H4乙酰化,H3甲基化修饰为主;+9 ～ +145 bp的修饰,复制性衰老细胞组受组蛋白H3及H4甲基化联合修饰,早衰持续组以H3甲基化修饰为主.结论 细胞衰老过程中,IGF2启动子区组蛋白修饰联合调控其mRNA表达,复制性衰老与早衰的调控机制存在差异.
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FoxM1在肿瘤发生中的作用研究进展
FoxM1转录因子是一系列生物过程,包括细胞增殖、细胞周期进程,细胞分化,DNA损伤修复,组织稳定,血管生成和细胞凋亡的调节剂.研究显示诸多癌症,包括肝癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、子宫颈癌、卵巢癌、口腔癌、血液及神经系统肿瘤中均发现FoxM1高表达.本文就FoxM1参与肿瘤发生发展的机制做一综述.
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“两阻三促”维护血管健康
心脑血管疾病发生的根本原因是血管壁细胞的衰老,以及血脂代谢紊乱(高胆固醇)、自由基等问题对血管壁细胞造成了损伤.血管壁细胞衰老或损伤后,易形成动脉粥样硬化,进而导致血管破裂或堵塞,诱发高血压、冠心病、糖尿病、脑血管意外等疾病.众所周知,疾病就是细胞的损伤,而营养是用于修复、再生细胞的“建筑材料”.通过系统补充营养,促进细胞修复和再生,疾病症状就会减轻、减少,甚至消失.
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红薯叶营养价值高
红薯叶,即秋天红薯(学名番薯)成熟后地上秧茎顶端的嫩叶,一般人对它不屑一顾.殊不知,红薯叶也是一种营养价值甚高的绿叶蔬菜,还有人将其誉为“蔬菜皇后”.现代医学研究发现:红薯叶含有一种独特的胶粘蛋白,所含维生素B、C和矿物质丰富,能够增强人体细胞的活性,有利于预防冠心病和动脉粥样硬化过早出现,又能防止肝脏和肾脏中结缔组织的萎缩,保持消化道、呼吸道和关节腔的润滑,预防胶原病的发生;红薯叶富含的黄酮类化合物,具有抗氧化、提高人体抗病能力、延缓细胞衰老、抗炎防癌等多种保健作用;红薯叶中含有大量的纤维素,是很好的“减肥蔬菜”;红薯叶含有胰岛素样成分,有一定的降血糖作用,为糖尿病人的理想食品.
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人胚肺成纤维细胞衰老过程中线粒体生物学性状变化的研究
目的 研究人胚肺成纤维细胞复制性衰老及过氧化氢诱导的早衰过程中线粒体生物学性状的变化.方法 将人胚肺成纤维细胞培养至22群体倍增水平(PDL),用400μmol/L H2O2染毒工作液避光染毒1次,每次2 h,染毒于每天同一时间内进行,连续染毒4 d后,为细胞早衰起始组(PSi);连续染毒4 d后,停止染毒并继续正常培养7 d后为细胞早衰持续组(PSp);同时基于细胞传代情况,将细胞分为年轻细胞组(22 PDL)、中年细胞组(35 PDL)、复制性衰老细胞组(49 PDL)、PSi和PSp 5个细胞衰老组.分别测定不同衰老组细胞的线粒体分布及相对含量、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)含量,转录因子(TFAM)、DNA甲基转移酶1(mtDNMT1)mRNA表达水平,DNA拷贝数,TFAM蛋白表达水平和总甲基转移酶(mtDNMTs)活性.结果 49 PDL组细胞的mtDNA拷贝数、8-OHdG含量、mtDNMT1的mRNA表达水平及mtDNMTs活性均高于22 PDL组(P值均<0.05);PSi的8-OHdG含量高于22 PDL组(P<0.05);PSp组细胞的ATP含量、mtDNA拷贝数、TFAM的mRNA和蛋白表达水平以及mtDNMTs活性均高于22 PDL组(P值均<0.05).结论 人胚肺成纤维细胞衰老过程中,复制性衰老与早衰细胞的mtDNA拷贝数和mtDNMTs活性均升高,氧化应激可能参与调控早衰的发生进程.
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淫羊藿总黄酮延缓衰老的研究
目的:淫羊藿总黄酮(EF)延缓人胚肺二倍体成纤维细胞衰老及神经内分泌、免疫衰老的机制.方法:采用含EF的血清对人二倍体成纤维细胞2BS细胞株进行处理,观察2BS细胞寿命;采用荧光实时定量PCR法检测p16基因mRNA的表达;ELISA法检测细胞总视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)和磷酸化Rb蛋白的含量;TRAP-Hyb单管一步法检测细胞端粒酶活性;端粒限制性片段(TRF)Southern blot法检测2BS细胞端粒长度变化.采用基因芯片技术,检测下丘脑、垂体、肾上腺、脾脏淋巴细胞的基因表达谱.结果:EF能够延长2BS细胞的传代寿命;下调2BS细胞p16基因mRNA的表达;增加磷酸化Rb蛋白的含量;延缓衰老细胞端粒长度的缩短,并未激活细胞端粒酶活性;EF上调HPAT轴多种神经递质、激素、细胞因子或其受体表达.结论:淫羊藿总黄酮通过抑制p16基因表达,促进磷酸化Rb蛋白的产生,从而延缓衰老细胞端粒长度的缩短,发挥延缓细胞衰老的作用.EF能上调神经递质受体的表达并通过NEI网络的下行通路激活神经内分泌和免疫系统;通过下调促凋亡、抗增殖基因,上调抗凋亡、促增殖基因的表达,重塑淋巴细胞基因表达的平衡,延缓免疫衰老.
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鹿茸多肽对大鼠软骨细胞复制性老化的作用
目的:对体外传代培养出现复制性老化的大鼠软骨细胞进行鹿茸多肽干预对照实验,观察鹿茸多肽对软骨细胞复制性老化的影响.方法:将第3代软骨细胞分为空白对照组(未加药物)、鹿茸多肽5、10、15μg/ml组传代使之进入第4代,同时以第2代软骨细胞为青年对照组,进行组化检测老化相关β-半乳糖苷酶,流式细胞仪分析细胞周期和增殖指数,阿力新蓝染色检测胞外基质硫酸GAG(glycosaminoglycaan)含量和结构,RT-PCR(revercse transcriptpolymerase chain reaction)检测Ⅱ型胶原、Aggrecan蛋白,对鹿茸多肽抗软骨细胞老化进行分子生物学研究.结果:鹿茸多肽显著抑制老化相关β-半乳糖苷酶的表达(P＜0.01)、促进鼠软骨细胞增殖、减少G1期细胞含量、促进软骨细胞胞外基质GAG、Ⅱ型胶原、Aggrecan蛋白表达(P＜0.01).结论:鹿茸多肽具有显著的抗软骨细胞复制性老化作用.
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鹿茸多肽抗鼠软骨细胞老化的机制初探
目的:对体外传代培养的大鼠软骨细胞进行鹿茸多肽干预对照实验,检测老化相关因子,初步探讨鹿茸多肽抗软骨细胞复制性老化的机制.方法:进行大鼠软骨细胞取材及传代培养,对第4代软骨细胞进行鹿茸多肽干预,并与第2、3、4代软骨细胞进行对照实验,采用免疫细胞化检测p16、pRb、E2F、CyclinD、CDK4等因子表达水平,TRAP-ELISA(telomerase repeat amplification protocol assay-enzyme linked immunosorbent assay)检测端粒酶活性,进而考察鹿茸多肽对软骨细胞老化过程中各因子的影响.结果:随着细胞复制性老化p16、pRb、CyelinD表达显著上升(P<0.01),E2F、CDK4、端粒酶表达显著下降(P<0.01);鹿茸多肽干预后p16、pRb、CyclinD表达比第4代软骨细胞表达显著下降(P<0.01),E2F、CDK4、端粒酶表达显著上升(P<0.01).结论:鹿茸多肽可以逆向影响老化相关调控因子的表达来实现其抗软骨细胞退变老化的作用.
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H2O2氧化应激诱导兔椎间盘髓核细胞衰老的研究
目的:研究H2O2不同浓度对兔椎间盘髓核细胞形态、活力、增值、周期等的影响.方法:新西兰大白兔(2～3 kg,雌)10只,无菌条件下酶消化法分离髓核细胞.含15％FBS的DMEM/F12(1:1)培养液培养,细胞90％融合后传第1代.按照H2O2不同浓度(0μmol/L、130 μmol/L、216 μmol/L、360 μmol/L、600 μmol/L、1 000 μmol/L)分组,0 μmol/L H2O2为空白对照组.在细胞对数生长期,不同浓度H2O2处理1h后原培养液继续培养48 h,通过检测,分析比较各组髓核细胞与空白对照组间形态、活力、增值、周期的差异性.结果:与空白对照组比较,当H2O2浓度为130 μmol/L、216 μmol/L时,髓核细胞生物学特性未见显著性改变(P＞0.05)；当H2O2浓度为360 μmol/L、600 μmol/L、1 000 μmol/L时,髓核细胞出现衰老改变:细胞质减少并出现空泡、增值减慢、衰老相关-β-半乳糖苷酶蓝染率增加、细胞周期阻滞于G1期而进入S期减少(P＜0.05).随着H2O2浓度的增高,衰老程度不断升高.结论:一定浓度的H2O2能够导致髓核细胞提前衰老,引起髓核细胞生物学特性的改变.
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补肾化瘀生新法协同静脉注射骨髓间充质干细胞对延缓大鼠衰老作用
目的:观察补肾化瘀生新法协同静脉注射骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)延缓大鼠衰老的有效性,明确中医药协同静脉注射BMSCs治疗延缓机体衰老的可行性.方法:75只SD大鼠随机分为补肾化瘀生新方高、中、低剂量组、模型组和正常组.每组12只,按照125 mg·kg-1 ·d-1的剂量颈背部皮下每日1次注射D-半乳糖溶液,连续45 d,建立大鼠衰老模型.补肾化瘀生新方高、中、低剂量组(27.28,13.64,6.82 g·kg-1)灌胃给药,模型组生理盐水灌胃,正常组不给药,早晚各1次,连续45 d.同时尾静脉注射BMSCs注射3.0 ×106个/mL的BMSCs,每周1次,连续4次.免疫荧光法测定脑、肝、肺、心中CD105,p53,p21,p16INK4a阳性细胞数,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测大鼠的脑、肝、肺、心中p16INK4a,p53,p21 mRNA表达.结果:与正常组比较,模型组大鼠脑、心脏、肺脏、肝脏中CD105阳性细胞数明显降低,p16INK4a,p21,p53阳性细胞数明显升高(P＜0.05),大鼠的脑、心脏、肺脏、肝脏中p16INK4a,p53,p21 mRNA表达明显上调(P＜0.05);与模型组比较,补肾化瘀生新各剂量组大鼠脑、心脏、肺脏、肝脏中CD105阳性细胞数明显升高,p16INK4a,p53,p21阳性细胞数明显降低(P＜0.05),补肾化瘀生新各剂量组均能明显降低脑、肝、肺、心组织中p16INK4a,p53,p21阳性细胞数mRNA表达明显下降(P＜0.05).结论:补肾化瘀生新法协同静脉注射BMSCs可能影响p16INK4a/Rb和p53/p21途径上的关键基因p16INK4a,p53,p21的表达而延缓BMSCs衰老,显示了中医药协同静脉注射BMSCs抗衰防衰的可行性.
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肾虚衰老理论研究的新思路
在中医学中,肾虚衰老一直占主导地位,而生命科学研究则表明机体生长、发育与衰老的基础是以细胞周期为核心的细胞增殖、分化与衰老等生命活动,两者之间必然有着某种本质的联系,将肾虚衰老、肾藏精、肾为先天之本理论与细胞基本生命活动之一的"细胞衰老"结合研究,可进一步揭示肾虚衰老理论的本质以及补肾防衰老的分子机制,同时可从另一个角度揭示目前尚未知的中医肾本质,从而深化中医学肾为先天之本理论.
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人参皂甙对不同代龄人胚肺成纤维细胞的增殖及Cyclin D1基因表达的影响
目的:探讨人参皂甙对衰老的人胚肺成纤维细胞增殖及Cyclin D1基因表达的调节作用,以进一步研究人参皂甙抗细胞衰老的机制.方法:用体外培养的人胚肺成纤维细胞为细胞衰老模型,通过细胞流式分析、免疫组化及RT-PCR方法,观察了人参皂甙对成纤维细胞的增殖周期、DNA合成,Cyclin D1 mRNA和蛋白质表达情况.结果:衰老的成纤维细胞用人参皂甙连续处理4代后,处于G1期的细胞数明显减少,进入S期的细胞由16.7%增加到33%(P＜0.05);Cyclin D1 mRNA表达比对照组下降,Cyclin D1蛋白质表达由原来的77.1±2.9明显下降为52±6.3(P＜0.001),DNA合成增加17%(P＜0.05).人参皂甙对低代龄细胞的Cyclin D1 RNA合成有所增加,对Cyclin D1蛋白质、DNA的作用影响不大.结论:人参皂甙对人胚肺成纤维细胞具有双向作用,对高代龄细胞具有促进细胞增殖,调节Cyclin D1基因表达的作用.
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血府逐瘀汤对血管紧张素Ⅱ诱导大鼠骨髓源内皮祖细胞衰老及p53、SIRT1蛋白表达的影响
目的 观察血府逐瘀汤对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导大鼠骨髓源内皮祖细胞(EPCs)衰老及对p53、SIRT1蛋白表达的影响,探讨其抗衰老的作用机制.方法体外培养EPCs,加入100 nmol/L AngⅡ诱导细胞衰老,建立EPCs衰老模型,随机分为正常组、模型组、miR-34a抑制剂组、血府逐瘀汤5％药物血清组、血府逐瘀汤10％药物血清组、血府逐瘀汤15％药物血清组.β-半乳糖苷酶染色法检测内皮祖细胞衰老,Western blot检测EPCs中p53蛋白、SIRT1蛋白的表达.结果与正常组比较,模型组EPCs衰老数量明显增多(P<0.01),p53蛋白表达量明显升高(P<0.01),SIRT1蛋白表达量明显降低(P<0.01);与模型组比较,miR-34a抑制剂组和5％、10％、15％药物血清组EPCs衰老数量显著减少(P<0.01),miR-34a抑制剂组和10％、15％药物血清组p53蛋白表达显著降低(P<0.05,P<0.01),miR-34a抑制剂组和10％、15％药物血清组SIRT1蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01);与miR-34a抑制剂组比较,5％、10％、15％药物血清组EPCs衰老数量显著增多(P<0.05,P<0.01),p53蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01),SIRT1蛋白表达明显下降(P<0.01);与5％药物血清组比较,10％、15％药物血清组EPCs衰老数量明显减少(P<0.01),p53蛋白表达显著降低(P<0.01),SIRT1蛋白表达显著升高(P<0.01);与10％药物血清组比较,15％药物血清组EPCs衰老数量明显减少(P<0.01),p53蛋白表达差异不明显,SIRT1蛋白表达明显升高(P<0.01).结论血府逐瘀汤能延缓EPCs的衰老,可明显降低衰老EPCs中p53蛋白的表达,显著增加衰老EPCs中SIRT1蛋白的表达,其中以15％药物血清组效果佳.
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人参三七川芎提取物对高糖高脂诱导的衰老血管内皮细胞自噬的影响
目的 观察人参三七川芎提取物对血管内皮细胞自噬流的影响,探讨其延缓高糖高脂诱导血管内皮细胞衰老的作用机制.方法 采用40 mmol/L葡萄糖和100μmol/L棕榈酸钠造模,实验分为空白对照组、衰老模型组和中药组(200 mg/L),干预48 h.采用CCK-8检测细胞增殖能力;β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老程度;Western blot检测细胞p16、p21、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3B-Ⅱ)和p62蛋白表达;免疫荧光检测自噬流变化.结果 与空白对照组比较,衰老模型组细胞增殖能力和LC3B-Ⅱ表达降低,β-半乳糖苷酶蓝染细胞数量和p16、p21、p62蛋白表达增加,并存在自噬流阻滞;与衰老模型组比较,中药组细胞增殖能力增强,LC3B-Ⅱ表达升高,β-半乳糖苷酶蓝染细胞数量减少,p16、p21和p62表达降低,自噬流畅通.结论 人参三七川芎提取物可延缓高糖高脂引起的血管内皮细胞衰老,其机制可能与增强细胞自噬活性有关.
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细胞衰老与肿瘤治疗及中医肾理论
与细胞增殖、分化、凋亡一样,细胞衰老(cell senescence)也是细胞的基本活动之一.细胞衰老现象初为Hayflick在正常成纤维细胞的体外培养中观察到,发现正常细胞在体外条件下增殖分裂50～70代即进入一种衰老的状态,细胞丧失继续增殖的能力无法进一步传代培养,但仍然存活,这种现象被称为"Hayflick极限".
